盒装豆腐的贮藏特性、腐败菌分离鉴定及腐败特性研究.pdf

聂远洋，卢森，龚艺松，等.盒装豆腐的贮藏特性、腐败菌分离鉴定及腐败特性研究 J.食品工业科技，2023，44（21）：137145.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022120253NIEYuanyang,LUSen,GONGYisong,etal.StorageCharacteristics,IsolationandIdentificationofSpoilageBacteria,andSpoilageCharactersofBoxedTofuJ.ScienceandTechnologyofFoodIndustry,2023,44(21):137145.(inChinesewithEnglishabstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022120253 生物工程 盒装豆腐的贮藏特性、腐败菌分离鉴定盒装豆腐的贮藏特性、腐败菌分离鉴定及腐败特性研究及腐败特性研究聂远洋1,2，卢森1，龚艺松1，李胜利3，李波1,2,*（1.河南科技学院食品学院，河南新乡453003；2.河南省果蔬加工及质量安全控制工程技术研究中心，河南新乡453003；3.郑州新农源绿色食品有限公司，河南郑州450199）摘要：为探究腐败微生物对盒装豆腐品质的影响及其腐败特性，以感官评分和菌落总数为指标，研究贮藏温度（4、25、37）对盒装老豆腐和内酯豆腐保存期的影响，并对盒装豆腐中腐败菌进行分离鉴定，观测其腐败性状和生长特性。结果显示：4 贮藏时盒装老豆腐和内酯豆腐的保存期均超过 30d，25 贮藏时盒装老豆腐和内酯豆腐的保存期约为 36 和 48h，37 贮藏时二者的保存期分别为 12 和 30h 左右。从新鲜和腐败变质的盒装老豆腐和内酯豆腐中共分离鉴定出 52 株腐败菌，其中芽孢杆菌属细菌 43 株，其他属细菌 9 株，表明芽孢杆菌是导致盒装豆腐腐败变质的主要微生物。贮藏温度对腐败菌的多样性有影响，4 和 25 贮藏时腐败菌种类较丰富。回接芽孢杆菌后在 25 贮藏时对盒装豆腐的品质影响较大，其中蜡样芽孢杆菌会导致盒装老豆腐发生褐变，枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌会引起盒装老豆腐胀袋，回接枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌的盒装内酯豆腐的腐败性状与空白样品基本一致，豆腐的最终腐败性状是各种细菌综合作用所致。本研究在前人的基础上进一步丰富了豆腐来源芽孢杆菌和其他细菌的种类，对于指导豆制品企业在生产和贮运过程中采取针对性措施控制盒装豆腐中芽孢杆菌的数量，进而延缓其腐败变质和延长保存期具有较好的理论意义。关键词：盒装豆腐，保存期，腐败菌，分离鉴定，芽孢杆菌，腐败性状本文网刊:中图分类号：TS201.3文献标识码：A文章编号：10020306（2023）21013709DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2022120253StorageCharacteristics,IsolationandIdentificationofSpoilageBacteria,andSpoilageCharactersofBoxedTofuNIEYuanyang1,2，LUSen1，GONGYisong1，LIShengli3，LIBo1,2,*（1.SchoolofFoodScience,HenanInstituteofScienceandTechnology,Xinxiang453003,China；2.HenanFruitandVegetableProcessingandQualitySafetyControlEngineeringTechnologyResearchCenter,Xinxiang453003,China；3.ZhengzhouXinnongyuanGreenFoodCo.,Ltd.,Zhengzhou450199,China）Abstract：Inordertoexploretheeffectsofspoilagemicroorganismsonthequalityofboxedtofuandtheirspoilagechar-acteristics,sensoryscoreandaerobicplatecountwereusedasindexestostudytheeffectofstoragetemperature(4,25and37)onthestoragelifeofboxedfirmtofuandlactonetofu.Thespoilagebacteriainboxedtofuwereisolatedandidentified,andtheirspoilageandgrowthcharacteristicswereobserved.Theresultsshowedthatthestoragelifeofboxedfirmtofuandlactonetofustoredat4wasbothmorethan30days.Thestoragelifeofboxedfirmtofuandlactonetofu收稿日期：20230103基金项目：校企合作项目豆制品加工关键技术研究与新产品开发（10503116）。作者简介：聂远洋（1986），男，博士，讲师，研究方向：豆制品加工，E-mail：。*通信作者：李波（1973），男，博士，教授，研究方向：豆制品加工，E-mail：。第44卷第21期食品工业科技Vol.44No.212023年11月ScienceandTechnologyofFoodIndustryNov.2023storedat25wasabout36and48h,respectively.Thestoragelifeofboxedfirmtofuandlactonetofustoredat37wasabout12and30h,respectively.Fifty-twostrainsofspoilagebacteriawereisolatedandidentifiedfromfreshandspoilageboxedfirmtofuandlactonetofu,including43strainsofBacillussp.and9strainsofothergenusbacteria,whichindicatedthatBacillussp.werethemainmicroorganismsthatcausedspoilageofboxedtofu.Thediversityofspoilagebacteriawasaffectedbystoragetemperature,andthespeciesofspoilagebacteriaweremoreabundantwhentheboxedtofuwerestoredat4and25.ThequalityofboxedtofuwasgreatlyaffectedbyBacillussp.whenstoredat25,inwhichBacillus cereuscouldcausebrowningofboxedfirmtofu,andBacillus subtilisandBacillus licheniformiscouldcauseboxedfirmtofutoswell.ThespoilagecharacteristicsofboxedlactonetofubackinoculatedBacillus subtilisandBacillus cereuswerebasicallythe same as those of the control sample.The final spoilage characters of tofu were caused by the comprehensiveactionofvariousbacteria.ThisstudyfurtherenrichedthespeciesofBacillussp.andotherbacteriafromtofuonthebasisofpreviousstudies,andithadgoodtheoreticalsignificanceforguidingsoybeanproductsenterprisestotaketargetedmeasurestocontrolthenumberofBacillussp.inboxedtofuintheprocessofproduction,storageandtransportation,soastodelayitsspoilageandprolongitsstoragelife.Keywords：boxedtofu；storagelife；spoilagebacteria；separationandidentification；Bacillus；spoilagecharacters豆腐富含蛋白质、维生素、矿物质等营养成分，具有很高的营养价值12，深受大众喜爱。按照使用凝固剂的不同，豆腐可分为老豆腐（北豆腐）、嫩豆腐（南豆腐）、酸浆豆腐（豆清豆腐）和内酯豆腐36。豆腐常见的包装方式有盒装和散装，其中较大规模的豆制品企业一般采用塑料盒密封包装的方式，而豆腐作坊一般采用大块散装的方式7。盒装豆腐采用巴氏杀菌，卫生安全，产品质量稳定。但由于豆腐含水量高、营养丰富，容易发生腐败变质，导致豆腐产品货架期较短，对豆制品企业扩大销售半径、提高产量规模产生较大影响，也容易引发食品安全问题8。因此，如何有效控制盒装豆腐的微生物数量，延长产品的保藏期，是提升豆制品企业竞争力亟待解决的问题。已有研究表明，豆腐产地、种类、生产季节、加工工艺、包装方式和贮藏条件的不同可能会导致豆腐腐败菌种类的差异。韩翠萍等9从散装豆腐和盒装豆腐中分离出 4 株优势腐败微生物，分别为溶血性葡萄球菌、克假丝酵母、短芽孢杆菌、托尔豪特链球菌。王宸之等10在全豆豆腐中分离出蜡状芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。郑玉玺等11在不同产地不同盒装豆腐中分离出枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌。吴丽樱12在盒装内酯豆腐中分离出枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌，在简易包装老豆腐中分离出库特氏菌、荧光假单胞菌、肠膜明串珠菌和产气肠杆菌。Lee 等13在变质豆腐中分离出蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。Rossi 等14在小规模豆腐企业生产的豆腐中分离出魏氏菌属、乳酸乳球菌、肠球菌等。Ananchaipattana 等15在豆腐样品中分离出大肠杆菌、假单胞菌、乳酸菌、葡萄球菌和芽孢杆菌等。Fouad 等16在 23 保存的真空包装豆腐分离出了乳酸菌、肠道细菌和假单胞菌属。然而，不同种类的腐败菌与豆腐的腐败性状相关性如何，不同腐败阶段何种腐败菌发挥主要作用等，还鲜有研究。河南是人口大省和豆腐消费大省，也是北豆腐或老豆腐的典型产区。目前有关河南地区盒装豆腐腐败微生物的研究鲜有报道。本文以河南省豆制品龙头企业郑州新农源绿色食品有限公司生产的盒装老豆腐和内酯豆腐为研究对象，研究不同贮藏温度下盒装豆腐的保存期，并对其腐败微生物进行分离鉴定，通过回接实验探明主要微生物生长导致豆腐腐败的腐败性状，以期为盒装豆腐生产和贮运过程中的微生物控制提供理论依据，并为企业下一步开发有针对性的芽孢控制技术提供菌种来源。1材料与方法1.1材料与仪器盒装老豆腐（L）、盒装内酯豆腐（N）郑州新农源绿色食品有限公司；营养琼脂培养基、营养肉汤培养基广东环凯微生物科技有限公司；氯化钠天津市大茂化学试剂厂；细菌基因组 DNA提取试剂盒、DNA HindIII Marker、D2000 DNA Marker、ddH2O、2TaqPCRMasterMixII天根生化科技（北京）有限公司；革兰氏染色试剂盒、50TAE 电泳缓冲液、6DNA 上样缓冲液北京索莱宝科技有限公司；琼脂糖、Goldview 核酸染料北京兰杰柯科技有限公司；琼脂糖凝胶 DNA 小量回收试剂盒广州美基生物科技有限公司；16SrRNA 通用引物（27F 和 1492R）生工生物工程（上海）股份有限公司合成。XFH-50CA 电热式压力蒸汽灭菌器浙江新丰医疗器械有限公司；SW-CJ-2D 超净工作台上海尚道仪器制造有限公司；ME104E 电子天平托利多仪器（上海）有限公司；SPX-250B 生化培养箱上海坤天实验室仪器有限公司；AxioVert.A1 倒置显微镜德国卡尔蔡司显微镜有限公司；Pico17 高速离心机赛默飞世尔（中国）有限公司；TProfessionaLstand-ard96Gradient 梯度 PCR 仪德国耶拿分析仪器股份公司；JY600 电泳仪北京君意东方电泳设备有限公司；Tanon-5200MuLti 全自动凝胶图像分析系统上海天能科技有限公司；FE28-MicropH 计梅特勒-托里多仪器（上海）有限公司。138食品工业科技2023 年11月1.2实验方法1.2.1样品采集与处理取生产线上经巴氏杀菌并冷却后的新鲜盒装老豆腐和内酯豆腐，2h 内由 28 冷藏车运输至实验室。新鲜样品立即进行感官评价和菌落总数测定，并分离腐败菌。其余样品分别在 4、25、37 下放置，分别每隔 3d、12h、6h 进行感官评价和菌落总数测定，直至样品腐败变质。完全腐败后（感官评分低于 5.5 分）的样品用于分离腐败菌。不同处理样品标注见表 1。表1盒装豆腐不同类型和贮藏条件的样品标注Table1Samplelabelingofboxedtofufordifferenttypesandstorageconditions豆腐类型贮藏条件新鲜样品42537盒装老豆腐XL4L25L37L盒装内酯豆腐XN4N25N37N1.2.2感官评价选择 10 名经过培训的专业人员，参照郑玉玺17的感官评分表并稍作修改，对样品的气味、色泽、口感、组织状态进行感官评价。盒装老豆腐和内酯豆腐的感官评价标准分别见表 2 和表 3。根据 Torry18方案当样品的感官评分在 5.5 分以下时，即认为样品已经达到不可接受状态，即达到腐败标准。1.2.3菌落总数的测定参考 GB4789.2-2016食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数的测定中所规定的方法对样品的菌落总数进行测定19。1.2.4腐败菌的分离纯化无菌操作下取 25g 豆腐样品置于无菌均质袋中，加入 225mL 无菌生理盐水，充分拍打混匀，以 10 倍稀释法稀释若干倍。选取合适的稀释梯度，分别吸取 200L 样液均匀涂布在营养琼脂平板上，置于 37 恒温培养箱中倒置培养 1824h。挑取 510 个形态特征差异明显的单个菌落，在营养琼脂平板上划线，置于 37 恒温培养箱中倒置培养 1824h。重复上述划线分离步骤，直至得到纯菌株。将纯化后的腐败菌接种至营养肉汤培养基中，37120r/min 振荡培养 1824h，取部分培养液用 20%甘油在-20 保藏菌种，部分培养液用于革兰氏染色和细菌基因组 DNA 提取。1.2.5腐败菌的形态观察腐败菌经革兰氏染色后，在显微镜油镜下观察其形态特征，根据染色结果及细胞形态简单分类。1.2.6腐败菌的 16SrRNA 分子鉴定采用细菌基因组 DNA 提取试剂盒提取腐败菌基因组 DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像系统检测提取结果，然后进行 16SrRNAPCR 扩增。通用引物20：27F5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，1492R 5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3。PCR 反应体系（50L）：模板 DNA4L，引物 27F2L，引物 1492R2L，2TaqPCRMasterMix25L，ddH2O17L。PCR 扩增条件：94 预变性 5min，30 个循环（94 变性30s，52 退火 45s，72 延伸 90s），72 延伸7min。PCR 扩增产物用 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，切下长度 1500bp 左右目标条带，采用琼脂糖凝胶 DNA 小量回收试剂盒纯化 PCR 产物。纯化产物用 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。获得的序列在 NCBI 上利用 BLAST 搜索与已知种属最接近的序列，进行同源性比对分析。1.2.7腐败菌回接取样新鲜老豆腐和内酯豆腐，在无菌环境下分割成 4cm4cm4cm 的小块，放入无菌袋中，95 杀菌 30min，以减少样品初始菌量，冷却至室温备用。表2盒装老豆腐感官评价标准Table2Sensoryevaluationstandardsofboxedfirmtofu感官评价指标分值气味色泽口感组织状态豆腐香气淡黄色豆香味浓成块、有弹性、质地细腻910无香味、无异味微黄色、无黏腻感豆香味淡软硬适中、有轻微掉渣78略有酸味黄色、轻微黏腻感有一定豆腥味豆水略有浑浊56有较强酸味褐色、失水、黏腻无豆腐滋味豆水浑浊、质地略硬34酸臭味严重灰褐色、失水严重酸涩味严重豆水严重浑浊、质地变硬12表3盒装内酯豆腐感官评价标准Table3Sensoryevaluationstandardsofboxedlactonetofu感官评价指标分值气味色泽口感组织状态豆腐香气淡乳白色细腻、略甜块型完整910无香味、无异味白色细腻软硬适中、有轻微掉渣78略有酸味淡黄色略有酸涩味表面粘连，稍有失水56有较强酸味灰色酸涩味较重粘连、失水、易碎34酸臭味严重色泽暗淡颗粒感较强严重失水、难以成型12第44卷第21期聂远洋，等：盒装豆腐的贮藏特性、腐败菌分离鉴定及腐败特性研究139保藏菌种解冻后，接种至营养肉汤培养基中，37120r/min 振荡培养 24h，菌落计数确定活化腐败菌的浓度，根据新鲜豆腐样品的质量添加菌液，腐败菌的添加量为 103CFU/g，用无菌涂布棒将菌液均匀涂抹于豆腐表面，随即密封。腐败菌回接后的豆腐样品在 25 下贮藏，每隔 12h 记录其腐败特征，测定菌落总数和 pH。1.2.8腐败特征的描述记录腐败菌回接样品贮藏过程中是否出现发酸、发臭、发黏、褐变、产生刺激性气味、胀袋等腐败特征。1.2.9pH 的测定无菌操作下取 25g 样品，置于无菌均质袋中，加入 225mL 灭菌生理盐水，充分拍打混匀，制成 101稀释液，用 pH 计测定 pH。1.3数据处理所有数据均以平均值标准差（n3）表示。采用 SPSS20.0 软件进行统计分析，显著性差异分析为单因素方差分析，多重比较采用 LSD 检验，P0.05具有显著性差异。采用 Origin2021 软件作图。2结果与分析2.1贮藏温度对盒装豆腐保存期的影响豆腐的保存期可分别用感官评分和菌落总数进行评价。当感官评分为 5.5 时，可认为豆腐样品已达到感官拒绝状态。一般认为，食品能被接受的最大微生物限量值为 7lgCFU/g2122。将盒装老豆腐和内酯豆腐分别置于 4、25、37 进行贮藏，分别每隔3d、12h、6h 进行感官评价和菌落总数测定，其在贮藏期间的感官评分和菌落总数变化见图 1图 3。0369 12 15 18 21 24 27 3023456789104L感官评分4N感官评分4L菌落总数4N菌落总数贮藏时间(d)感官评分2345678910菌落总数(lg CFU/g)图14 贮藏盒装豆腐感官评分和菌落总数变化Fig.1Changesofsensoryscoreandtotalnumberofcoloniesofboxedtofustoredat4结果显示，贮藏温度为 4 时，盒装豆腐在 30d时仍未达到感官拒绝状态，菌落总数低于 4lgCFU/g。贮藏温度为 25 时，盒装老豆腐和内酯豆腐分别在 36 和 48h 左右达到感官拒绝状态，菌落总数均超过 7lgCFU/g。贮藏温度为 37 时，盒装老豆腐和内酯豆腐分别在 12 和 30h 左右达到感官拒绝状态，菌落总数也超过 7lgCFU/g。由此可见，贮藏温度对盒装豆腐的保存期有较大影响，温度越低保存期越长。实验结果还显示，盒装内酯豆腐的保存期略长于老豆腐，这与二者的加工方式不同有关。内酯豆腐生产时，豆浆加入凝固剂葡萄糖酸内酯后即进行装盒密封，然后经升温成型，煮后的豆浆与外界环境接触时间较短23。老豆腐生产时，豆浆加入凝固剂后要经过蹲脑、压制、分切等处理后才装盒密封，与外界环境接触时间较长，污染残存的微生物数量较多，故保存期较短。此外，当样品达到感官拒绝状态前，其菌落总数已经达到 7lgCFU/g，表明在界定盒装豆腐的腐败标准时，感官评价要迟滞于微生物指标。通过前期的调研可知，该企业盒装豆腐产品标注的保存期是 17 下 10d，企业采用冷库贮藏和冷藏车运输，能够较好保持低温环境，但产品运输到超市后的贮藏和销售温度难以保证，有些消费者也未能将所购产品及时置于冰箱中冷藏，导致产品实际的保存期受到较大影响。因此，增强销售商的冷藏意识和管理水平，以及消费者的食品保藏知识，对提升豆腐等易腐食品的安全性、延长保存期、降低销售损耗具有重要意义。2.2盒装豆腐中腐败菌的分离纯化结果从新鲜的和不同温度贮藏后腐败变质的盒装豆腐样品中共分离出 52 株不同菌落形态的腐败菌。01224364860234567891025L感官评分25N感官评分25L菌落总数25N菌落总数贮藏时间(h)感官评分2345678910菌落总数(lg CFU/g)图225 贮藏盒装豆腐感官评分和菌落总数变化Fig.2Changesofsensoryscoreandtotalnumberofcoloniesofboxedtofustoredat250612182430362345678910234567891037L感官评分37N感官评分37L菌落总数37N菌落总数贮藏时间(h)感官评分2345678910菌落总数(lg CFU/g)图337 贮藏盒装豆腐感官评分和菌落总数变化Fig.3Changesofsensoryscoreandtotalnumberofcoloniesofboxedtofustoredat37140食品工业科技2023 年11月革兰氏染色结果显示大多数腐败菌为革兰氏阳性菌（40 株），少数腐败菌为革兰氏阴性菌（12 株）；腐败菌在细胞形态上多呈杆状，其中 46 株为杆菌，6 株为球菌。部分腐败菌的菌落特征和细胞形态见图 4 和图 5。韩翠萍等9从腐败散装与盒装豆腐中均分离出 4 株腐败菌，其中 3 株为革兰氏阳性细菌，1 株为革兰氏阳性酵母；郑玉玺17从不同产地不同种类豆腐中分离纯化得 8 株纯菌株，均为革兰氏阳性菌，其中 6 株均为杆菌，2 株为球菌。本研究分离的豆腐腐败菌在革兰氏染色和细胞形态上与前人的研究结果一致，即大部分腐败菌为革兰氏阳性菌，呈杆状。2.3盒装豆腐腐败菌的菌种鉴定结果对盒装豆腐中分离纯化出的腐败菌进行 16SrRNA 分子鉴定，结果见表 4。XL2XL2XL3XL34L54L525L625L637L237L2图4盒装老豆腐部分腐败菌菌落特征及细胞形态（1000）Fig.4Colonycharacteristicsandcellmorphologyofsomespoilagebacteriafromboxedfirmtofu(1000)XN5XN5XN6XN64N54N525N325N337N737N7图5盒装内酯豆腐部分腐败菌菌落特征及细胞形态（1000）Fig.5Colonycharacteristicsandcellmorphologyofsomespoilagebacteriafromboxedlactonetofu(1000)表4盒装豆腐中分离细菌 16SrRNA 序列比对结果Table416SrRNAsequencealignmentresultsofisolatedbacteriafromboxedtofu样品菌株编号最相似菌株序列登录号相似度（%）种属门类XLXL1Bacillussp.strainWR-3MG371991.199.76芽孢杆菌属厚壁菌门XL7Bacillussp.strain210_24GQ199726.198.08芽孢杆菌属厚壁菌门XL2Bacillus subtilisstrainEGI132MN704439.199.50枯草芽孢杆菌厚壁菌门XL3Bacillus cereusstrainNPK1_1_30MN691552.1100.00蜡样芽孢杆菌厚壁菌门XL4Bacillus licheniformisstrainQT331MT043736.198.83地衣芽孢杆菌厚壁菌门XL5Lysinibacillussp.strain4515CKM242578.194.12赖氨酸芽孢杆菌厚壁菌门XL6Bacillus thuringiensisstrainBt57MT292096.198.75苏云金芽胞杆菌厚壁菌门XNXN1Bacillussp.strainA9OM957541.198.96芽孢杆菌属厚壁菌门XN2Bacillus subtilisstrainB11KJ870191.199.55枯草芽孢杆菌厚壁菌门XN4Bacillus subtilisstrainP62KU551208.199.30枯草芽孢杆菌厚壁菌门XN6Bacillus subtilisstrainCG-6OK037059.199.89枯草芽孢杆菌厚壁菌门XN7Bacillus subtilisstrain4I2MW380591.199.19枯草芽孢杆菌厚壁菌门XN3Bacillus jeotgalistrainNIOT-Ba-4KJ575006.198.30咸海鲜芽孢杆菌厚壁菌门XN5Pantoea agglomeransstrainATY79HQ219998.199.87成团泛菌变形菌门4L4L1Rummeliibacillus pycnusstrainM9-19KT382255.199.70鲁梅尔芽胞杆菌厚壁菌门4L3Rummeliibacillus pycnusstrainNBRC101231NR_041521.199.56鲁梅尔芽胞杆菌厚壁菌门4L2Bacillus cereusstrainBPH33HM771262.199.63蜡样芽孢杆菌厚壁菌门第44卷第21期聂远洋，等：盒装豆腐的贮藏特性、腐败菌分离鉴定及腐败特性研究141表 4 显示，每种豆腐样品的腐败菌为 67 株。腐败菌主要为芽孢杆菌（共 43 株），包括蜡样芽孢杆菌（11 株）、芽孢杆菌属（9 株）、枯草芽孢杆菌（7 株）、地衣芽孢杆菌（3 株）、鲁梅尔芽胞杆菌（3 株）、土壤芽孢杆菌（2 株）、特基拉芽孢杆菌（2 株），赖氨酸芽孢杆菌、苏云金芽胞杆菌、咸海鲜芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、短芽孢杆菌属、短小芽孢杆菌各 1 株。其他腐败菌包括金黄杆菌属、屎肠球菌、耐久肠球菌各2 株，成团泛菌、葡萄球菌、乳微杆菌各 1 株。由此可见，芽孢杆菌是盒装豆腐腐败菌中的优势菌，这与郑玉玺等11、吴丽樱等24、王敏等25的研究结果一致。表 5 显示，豆腐类型和贮藏温度对腐败菌的种类也有一定影响。贮藏温度对盒装内酯豆腐腐败菌多样性的影响较大，对盒装老豆腐影响较小，而且4 和 25 贮藏的盒装内酯豆腐腐败菌种类比其他样品都要丰富。当贮藏温度为 4 时，盒装内酯豆腐中的腐败菌为芽孢杆菌属（1 株）、肠球菌属（2 株）和金黄杆菌属（2 株）。其余样品中腐败菌多为芽孢杆菌属。由于低温会显著抑制大多数微生物的代谢活动，且 4 贮藏样品分离腐败菌时，样品并未达到续表4样品菌株编号最相似菌株序列登录号相似度（%）种属门类4L4Bacillus siamensisstrainMDJK10KY967281.199.54暹罗芽孢杆菌厚壁菌门4L5Enterococcus duransstrainKLDS6.0933KJ818114.199.73耐久肠球菌厚壁菌门4L6Brevibacillussp.strainSNH_M11MN577380.199.73短芽孢杆菌属厚壁菌门4N4N1Chryseobacteriumsp.strainFF12partiaLLN810503.198.68金黄杆菌属拟杆菌门4N2Chryseobacteriumsp.strainCBo1MK095750.198.98金黄杆菌属拟杆菌门4N3Rummeliibacillus pycnusstrainM9-19KT382255.199.18鲁梅尔芽胞杆菌厚壁菌门4N5Enterococcus faeciumstrain1718MT597585.199.54屎肠球菌厚壁菌门4N6Enterococcus faeciumstrainCAU:201MF369855.199.55屎肠球菌厚壁菌门25L25L1Bacillussp.strainLSB24MK600540.199.81芽孢杆菌属厚壁菌门25L3Bacillussp.strainBYT-24JQ773351.199.63芽孢杆菌属厚壁菌门25L2Bacillus cereusstrainZK2JQ773351.199.66蜡样芽孢杆菌厚壁菌门25L5Bacillus cereusstrainW1KT970711.199.63蜡样芽孢杆菌厚壁菌门25L4Brevibacillus agristrainSJ6OM049334.199.24土壤芽孢杆菌厚壁菌门25L6Brevibacillus agristrainY17KF641808.199.53土壤芽孢杆菌厚壁菌门25L7Enterococcus duransstrain3883MT538726.199.07耐久肠球菌厚壁菌门25N25N1Bacillus cereusstrainK1M2AB473013.199.70蜡样芽孢杆菌厚壁菌门25N2Bacillus cereusstrainDS-2ON005108.199.34蜡样芽孢杆菌厚壁菌门25N3Bacillus pumiLusstrainS8FJ236809.199.89短小芽孢杆菌厚壁菌门25N4Staphylococcussp.strainGG54MT459283.197.91葡萄球菌厚壁菌门25N5Bacillus subtilisstrainFL37KY818955.199.49枯草芽孢杆菌厚壁菌门25N6Microbacterium lacticumstrainB19/II6MZ841732.197.85乳微杆菌厚壁菌门37L37L1Bacillussp.strainLPB22MT673802.1100.00芽孢杆菌属厚壁菌门37L4Bacillussp.strainKT70KJ734004.198.89芽孢杆菌属厚壁菌门37L2Bacillus licheniformisstrainAD242MT642944.199.35地衣芽孢杆菌厚壁菌门37L3Bacillus tequilensisstrainM53-1JF411295.199.06特基拉芽孢杆菌厚壁菌门37L6Bacillus tequilensisstrainKM34JF411313.199.44特基拉芽孢杆菌厚壁菌门37L5Bacillus cereusstrainG5HQ418488.198.64蜡样芽孢杆菌厚壁菌门37L7Bacillus subtilisstrainX303KU240494.199.30枯草芽孢杆菌厚壁菌门37N37N1Bacillussp.strainJSM164012MG893180.199.64芽孢杆菌属厚壁菌门37N4Bacillussp.strainNII-73FJ897479.198.22芽孢杆菌属厚壁菌门37N2Bacillus cereusstrainLmb017KT986088.198.79蜡样芽孢杆菌厚壁菌门37N5Bacillus cereusstrainEM10KJ612536.199.03蜡样芽孢杆菌厚壁菌门37N6Bacillus cereusstrainDS16EU834245.199.73蜡样芽孢杆菌厚壁菌门37N7Bacillus cereusstrainS45GQ462533.1100.00蜡样芽孢杆菌厚壁菌门37N3Bacillus licheniformisstrainB21-023MK063827.199.05地衣芽孢杆菌厚壁菌门表5盒装豆腐中腐败菌的分布情况Table5Distributionofspoilagebacteriainboxedtofu样品腐败菌种类芽孢杆菌属 肠球菌属 微杆菌属 金黄杆菌属 葡萄球菌属 泛菌属XL74L5125L6137L7XN614N12225N41137N7142食品工业科技2023 年11月腐败状态，因此导致 4 贮藏盒装老豆腐和盒装内酯豆腐腐败菌种类的差异。同时盒装老豆腐和盒装内酯豆腐两者的加工方式、原辅料、机械化程度的不同都会导致其在不同贮藏温度时腐败菌种类的差异。吴丽樱12研究发现不同贮藏温度对简易包装老豆腐的腐败菌菌相有较大影响，郑玉玺17报道不同贮藏温度下盒装豆腐腐败菌多样性也会发生较大变化，这与本研究结果相似。2.4盒装豆腐腐败菌的腐败性状和生长特性根据腐败菌分离鉴定结果，分别从盒装老豆腐和内酯豆腐中选取出现频率较高的腐败菌各 5 株（见表 6），将每株菌分别回接到灭菌后的盒装豆腐样品中，在 25 下贮藏，观察其腐败性状、菌落总数和pH 的变化情况。表6回接实验中选取的腐败菌菌株Table6Spoilagestrainsselectedinthebackinoculationexperiment样品菌株英文名称菌株中文名称菌株编号盒装老豆腐Bacillus subtilis枯草芽孢杆菌XL2Bacillus cereus蜡样芽孢杆菌XL3Enterococcus durans耐久肠球菌4L5Brevibacillus agri土壤芽孢杆菌25L6Bacillus licheniformis地衣芽孢杆菌37L2盒装内酯豆腐Pantoea agglomerans成团泛菌XN5Bacillus subtilis枯草芽孢杆菌XN6Enterococcus faecium屎肠球菌4N5Bacillus pumilus短小芽孢杆菌25N3Bacillus cereus蜡样芽孢杆菌37N72.4.1腐败菌的腐败性状表 7 和表 8 显示，接种腐败菌的盒装老豆腐样品和空白的老豆腐样品 25贮藏时，在 24h 出现腐败性状（枯草芽孢杆菌除外），接种腐败菌的盒装内酯豆腐样品 25 贮藏时，在12h 即出现腐败性状，而空白内酯豆腐样品在 24h出现腐败性状。表明回接腐败菌的内酯豆腐较老豆腐更容易腐败，这可能是由于回接至内酯豆腐中的腐败菌（如成团泛菌、屎肠球菌、短小芽孢杆菌）其代谢分解豆腐中营养物质的速率快于回接至老豆腐中的腐败菌（如耐久肠球菌、土壤芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌）。腐败初期（1224h）的性状大体表现为腐败味、发粘等，中期（3648h）则表现为酸腐味、发粘、刺激性气味等，后期（60h）出现臭味、胀袋等性状。老豆腐和内酯豆腐的腐败性状有明显差异，可能与二者的制作工艺、所用凝固剂不同有关7，也与二者的含水量、pH 有关4-6。不同腐败菌的腐败性状也有一定差异，如蜡样芽孢杆菌会导致老豆腐发生褐变，枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌引起老豆腐胀袋；成团泛菌会在内酯豆腐表面形成一层菌膜，短小芽孢杆菌则在内酯豆腐中产生黏液；不同腐败菌均会引起内酯豆腐产生刺激性气味和胀袋。韩翠萍等9发现克假丝酵母、溶血性葡萄球菌及托尔豪特链球菌是导致豆腐发粘、涨袋及质构变软的主要微生物，而短芽孢杆菌对豆腐腐败变质无明显影响。综上，豆腐的不同产地、来源和种类及贮藏时间都会直接影响其腐败进程和性状，豆腐的最终腐败性状也是各种腐败菌综合作用所致。2.4.2腐败菌的生长特性图 6 显示，回接腐败菌后盒装老豆腐样品的菌落总数在前 24h 快速增长，之后趋于平缓。回接枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌样品的菌落总数增速快于空白样品，而回接耐久肠球菌、蜡样芽孢杆菌和土壤芽孢杆菌的增速慢于空白表7盒装老豆腐回接腐败菌后的腐败性状Table7Spoilagecharactersofboxedfirmtofua