黑木耳菌丝老化过程中胞外酶变化规律分析.pdf

第 42 卷第 4 期王彤等：美味牛肝菌药用价值及产品开发现状DOI：10.13629/ki.53-1054.2023.04.012中国食用菌圆园23，42（4）：7579耘阅陨月蕴耘 云哉晕郧陨 韵云 悦匀陨晕粤悦晕缘猿原员园缘源/匝陨杂杂晕 员园园猿原愿猿员园黑木耳菌丝老化过程中胞外酶变化规律分析*庞杰，于传宗*，宋晓青，李亚娇，王海燕，孙国琴（内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031）摘要：目前关于黑木耳菌丝退化的机制尚不清楚，试验通过测定黑木耳老化过程中胞外酶活力的变化进行探究。结果表明，随着老化处理时间的不断延长，滤纸酶、半纤维素酶、纤维素酶、漆酶、果胶酶、淀粉酶、总蛋白酶的活力均呈下降趋势，纤维二糖酶活力呈先上升后下降的趋势，各胞外酶之间存在不同程度的相关性。研究结果对于进一步探究黑木耳菌丝老化生理及机理有重要的意义。关键词：黑木耳；菌丝体；老化；胞外酶中图分类号：S646.6文献标志码：A文章编号：1003-8310（2023）04-0075-05Analysis on Changes Rules of Extracellular Enzymes in Auricularia auriculaMycelium During SenescencePANG Jie,YU Chuan-zong,SONG Xiao-qing,LI Ya-jiao,WANG Hai-yan,SUN Guo-qin（Inner Mongolia Academy of Agricultural&Animal Husbandry Sciences,Hohhot 010031,China）Abstract:At present,the degradation mechanism of Auricularia auricula mycelium is still unclear,the test measuring thechanges of extracellular enzymes during the aging process of A.auricula to explore the mechanism.The results showed that theactivities of filter paper enzyme,hemicellulase,cellulase,laccase,pectinase,amylase and total proteinase all showed a down原ward trend with the aging treatment time extending,while the activities of cellobiase showed a trend of rising first and then de原clining.And there was a different degree of correlation between the extracellular enzymes.The results have important signifi原cance for further exploring the aging physiology and mechanism of A.auricula mycelium.Key words:Auricularia auricula;mycelium;senescence;extracellular enzyme*基金项目：2020 年内蒙古科技计划项目（2020GG0050）；2021 年内蒙古农牧业科学院青年创新基金项目（2021QNJJNO4）；2021 年内蒙古自治区自然基金项目（2021BS03047）。作者简介：庞杰（1986），男，博士，副研究员，主要从事食用菌种质资源与种质创新方面研究。E-mail:*通信作者：于传宗（1976），男，博士，研究员，主要从事食用菌种质资源与种质创新方面研究。E-mail:收稿日期：2023-05-18食用菌菌种的老化问题在食用菌生产上日益严重，成为一项普遍存在的核心技术难题，菌种老化具有可遗传性，会直接影响菌种质量，从而给大规模生产带来极大的经济损失1。黑木耳 Auriculariaauricula(L.ex Hook.）Underw 是我国产量第二的栽培食用菌种类2。生产发现黑木耳菌种由于管理和使用不当，未在菌丝生长活力最佳状态下使用，长期的培养会造成菌种有害物质积累、菌丝消亡等3。有害物质不断累积会导致菌种退化无法继续使用，而菌种老化过程中的菌丝活力退化机制目前仍未可知4。关于菌丝是否老化主要通过形态特征观察和生理生化研究进行确定5，而对于菌丝老化后的生理生化反应等的研究较少。食用菌在生长发育过程中通过胞外酶将培养料中的糖类、蛋白质等大分子转化成利于吸收的小分子物质，为其菌丝生长、原基分化、子实体生长发育提供营养物质6-7。对菌丝体胞外酶活力进行测定，可以获知食用菌对培养料的分解顺序，微观监控菌株生长的不同时期对营养成分中国食用菌耘阅陨月蕴耘 云哉晕郧陨 韵云 悦匀陨晕粤灾燥造援 42晕燥援4的需求等8-11。因此开展黑木耳菌丝体胞外酶测定试验，了解黑木耳菌种老化过程中胞外酶的变化规律，进一步探究黑木耳菌丝老化对其利用基质营养物质的影响，从而解析黑木耳老化对其生长发育的影响。1试验方法1.1供试菌株供试菌株为内蒙古自治区农牧业科学院食用菌实验室保藏的黑木耳菌株。1.2样品制备老化处理培养基配方：PDA 培养基 40 g、酵母粉3 g，加水定容至 1 L。将配好的培养基进行高压灭菌，分装至直径为 9 cm 的玻璃培养皿中，每皿 20 mL。将活化的黑木耳菌种接种至老化处理培养基上，于 23 益培养。待菌丝长满培养皿则开始取样，每次取出 4 个培养皿作为样品，取样培养皿放置在-80 益冰箱保藏备用。第 1 次所取样品即为对照，记为样品 1；以后每 10 天取 1 次样，培养至第 70 天共取样 8 次，依次记为样品 28。取样 8 次后菌丝体大量自溶，不再取样。1.3胞外酶测定将培养皿样品从-80 益冰箱取出，于-20 益放置 4 h 后，再于 0 益放置 4 h 解冻。取 1/4 体积的培养基于装有 100 mL 灭菌水的三角瓶中，在摇床中以80 r min-1的转速震荡 4 h，取上清液测定胞外酶。采用苏州格锐思生物科技有限公司的试剂盒测定所有样品中的 8 种胞外酶，酶活力单位定义分别如下。纤维素酶：每毫升液体每小时催化生产 1 滋g还原糖定义为 1 个酶活力单位（滋g h-1 mL-1）；滤纸纤维素酶：50 益下每毫升液体每小时分解滤纸生产1 mg 葡糖糖定义为 1 个酶活力单位（mg h-1 mL-1）；纤维二糖酶：每毫升液体每分钟生产 1 mmol 对硝基苯酚定义为 1 个酶活力单位（mmol min-1 mL-1）；半纤维素酶：每毫升液体每分钟分解半纤维素生产 1mmol 木糖定义为 1 个酶活力单位（mmol min-1 mL-1）；漆酶：每毫升液体每分钟还原 1 mmol ABTS 定义为1 个酶活力单位（mmol min-1 mL-1）；琢-淀粉酶：每毫升液体每分钟催化生产 1 滋g 麦芽糖定义为 1 个酶活力单位（滋g min-1 mL-1）；果胶酶：40 益条件下，每毫升液体每小时分解果胶生产 1 滋g 半乳糖定义为1 个酶活力单位（滋g h-1 mL-1）；总蛋白酶：每毫升液体每小时反应体系中变化 1 个吸收单位定义为 1个偶氮络蛋白单位（U h-1 mL-1）。1.4数据处理试验结果采用 Excel 2010 和 SPSS 18.0 软件进行数据分析。2结果与分析2.1黑木耳胞外酶酶活力变化趋势菌丝老化过程中黑木耳胞外酶酶活力变化情况见图 1。由图 1 可知，8 种胞外酶的酶活力变化趋势有一定差异。其中，纤维素酶、滤纸纤维素酶、半纤维素酶、漆酶的酶活力变化趋势一致，均呈下降的趋势。与样品 1（CK）相比较，纤维素酶从样品 3开始差异显著（P0.05），滤纸纤维素酶从样品 4 开始差异显著（P0.05），半纤维素酶、滤纸纤维素酶从样品 7 开始差异显著（P0.05），漆酶从样品 6 开始差异显著（P0.05）。其中，滤纸纤维素酶与半纤维素酶、纤维素酶、果胶酶极显著正相关，与漆酶显著正相关；半纤维素酶与纤维素酶、总蛋白酶呈极显著正相关，与漆酶、淀粉酶显著正相关；纤维素酶与漆酶、淀粉酶、果胶酶极显著正相关，与总蛋白酶显著正相关；漆酶与果胶酶显著正相关；淀粉酶与总蛋白酶显著正相关。2.3黑木耳胞外酶主成分分析对黑木耳菌丝老化过程中 8 个胞外酶进行主成分分析，主成分特征值详见表 2，主成分载荷矩阵详见表 3。76第 42 卷第 4 期王彤等：美味牛肝菌药用价值及产品开发现状图 1菌丝老化过程中黑木耳胞外酶活性变化情况Fig.1Changes in extracellular enzymes activity of Auricularia auricula during mycelial senescence注：同一曲线图中不同小写字母表示差异显著（P0.05）。Note:Different lowercase letters in the same curve indicate significant differences(P0.05).庞杰等：黑木耳菌丝老化过程中胞外酶变化规律分析77中国食用菌耘阅陨月蕴耘 云哉晕郧陨 韵云 悦匀陨晕粤灾燥造援 42晕燥援4胞外酶相关系数0.386*0.3110.465*-0.228半纤维素酶0.563*0.418*纤维素酶0.627*0.526*0.610*0.386*-0.1470.2210.419*0.340-0.006漆酶淀粉酶0.1390.485*0.211果胶酶0.145-0.014总蛋白酶0.049淀粉酶果胶酶总蛋白酶纤维二糖酶半纤维素酶纤维素酶漆酶滤纸纤维素酶0.473*0.766*0.351*0.3290.655*0.154-0.211方差贡献率/%累积贡献率/%1.572100.00044.88644.886成分合计Z80.126Z13.59116.98961.875Z21.359Z31.02712.83574.710Z40.7409.25383.963Z50.4926.14990.112Z60.4265.32295.434Z70.2402.99498.4280.664 00.680胞外酶主成分纤维二糖酶-0.1280.035 4-0.416半纤维素酶0.733纤维素酶0.924-0.087 00.080漆酶0.6800.011 00.111淀粉酶0.5840.592 0-0.024果胶酶0.677-0.342 00.469总蛋白酶0.5500.556 0-0.352Z2Z3Z1滤纸纤维素酶0.788-0.364 00.168表 1菌丝老化过程中黑木耳胞外酶相关性分析结果Tab.1Correlation analysis results of extracellular enzymes in Auricularia auricula during mycelial senescence注：*表示双侧显著相关（P0.05），*表示双侧极显著相关（P0.01）。Note:*indicates bilateral significant correlation(P0.05),*indicates bilateral extremely significant correlation(P0.01).表 2菌丝老化过程中黑木耳胞外酶主成分特征值Tab.2Principal component characteristic values of extracellularenzymes from Auricularia auricula during mycelial senescence表 3菌丝老化过程中黑木耳胞外酶主成分载荷矩阵Tab.3Principal component load matrix of extracellular enzymesfrom Auricularia auricula during mycelial senescence由表 23 可知，前 3 个主成分（Z1、Z2、Z3）的累计贡献值为 74.710%。第 1 主成分（Z1）主要反映滤纸纤维素酶、半纤维素酶、纤维素酶、漆酶和果胶酶，方差贡献值为 44.886%。第 2 主成分（Z2）主要反映淀粉酶、总蛋白酶，方差贡献值为16.989%。第 3 主成分（Z3）主要反映纤维二糖酶，方差贡献值为 12.835%。3结论与讨论黑木耳菌丝老化会对胞外酶产生影响。食用菌营养物质的获取主要是通过菌丝分泌胞外酶，将栽培料中的纤维素、淀粉、木质素等大分子物质分解成便于吸收的小分子物质11。通过测定发现，随着菌丝老化时间的不断延长，各胞外酶活力均低于对照，说明老化处理能导致胞外酶分泌的减少，从而导致黑木耳菌丝对培养基质的利用能力降低。但各胞外酶活力降低的时间和程度各不相同，说明各胞外酶受到影响的先后顺序有一定的差异。这证明菌丝老化生活力下降是由于胞外酶分泌受到制约，从而影响菌丝的生长及子实体的产量和品质4。黑木耳老化制约了木质纤维素的降解。胞外酶主要有 4 大酶系，即纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶和淀粉酶12，包含纤维素酶等 10 余种酶类。通过主成分分析发现，黑木耳菌丝老化处理主要影响滤纸纤维素酶、半纤维素酶、纤维素酶、漆酶和果胶酶，这些酶均呈下降趋势，说明老化主要影响的是木质素、纤维素和半纤维素的降解。但老化处理对纤维二糖酶的活力有一定的促进作用，这在胞外酶相关性分析中也发现纤维二糖与其他胞外酶之间多呈负相关或相关性不显著，其机理有待进一步研究。老化处理过程中各胞外酶之间存在着内在相关78第 42 卷第 4 期王彤等：美味牛肝菌药用价值及产品开发现状性。食用菌胞外酶的生成受到遗传基因和代谢物的双重调控13，可能是由于上游产物减少导致了下游胞外酶产生的减少，也可能是由于老化处理导致胞外酶遗传基因表达受到影响，从而使胞外酶的产生受到影响，相关机理有待进一步研究。参考文献：1 宋好倩.蛹虫草生长营养特性及胞外酶活性的研究D.新乡：河南科技学院，2017.2 潘春磊，王延锋，盛春鸽，等.黑木耳 59 个菌株的遗传多样性分析J.中国食用菌，2022，41（1）：17-22.3 朱海峰.黑木耳液体菌种老化评价指标的研究D.哈尔滨：东北农业大学，2021.4 王毓婧，姚方杰，孙旭，等.转管继代对黑木耳菌种质量的影响J.吉林农业大学学报，2022，44（3）：293-299.5 李利梅.红托竹荪菌种菌丝老化变红过程中特征指标变化D.贵阳：贵州师范大学，2018.6 方华舟.不同蛹虫草优质母种分离方式与菌种性能比较J.北方园艺，2014（15）：142-146.7 李娟，倪新江，樊守金，等.金顶侧耳不同生长期几种胞外酶活性变化J.吉林农业大学学报，2006，28（6）：619-622.8 黄春霖，林辰壹，刘玉，等.巴尔喀什黑伞 3 种胞外纤维素酶活力变化规律研究J.天津农业科学，2018，24（11）：54-57.9 张乐，白羽嘉，谢现英，等.温度对阿魏侧耳胞外酶活性及原基形成的影响J.新疆农业科学，2014，51（9）：1692-1698.10 李晓博，李晓，李玉.双孢蘑菇生产中木质素、纤维素和半纤维素的降解及利用研究J.食用菌，2009，31（2）：6-8，10.11 CARDOSO W S,SOARES F E F,QUEIROZ P V,et al.Minimum cocktail of cellulolytic multi-enzyme complexes ob原tained from white rot fungi via solid-state fermentationJ.Biotech,2018,8(3):1-8.12 徐秀红，陈阿敏，裴芸，等.香菇液体和固体菌种在栽培料中胞外酶活性分析J.分子植物育种，2021，19（20）：6933-6941.13 孙瑞祥.以豆秸为主料的基质配方对金针菇生长发育的影响及其分子机制D.烟台：鲁东大学，2022.（责任编辑：刘韵然）著 作权转让 声明 中国食用菌 全体著作权人同意将论文发表在 中国食用菌 2023 年第 4 期上，并签署著作权转让协议。自论文发表之日起，该文的复制权、发行权、信息网络传播权、汇编权在全世界范围最长期限内独家授权给 中国食用菌 编辑部，并许可在国内外文献检索系统和网络、数据库检索。本刊稿酬含著作权转让费一次性支付。论文的著作权人保证：1）论文是著作权人独立取得的原创性研究成果，论文内容不涉及国家机密。2）论文未曾一稿多投，未曾以任何形式、用任何文种在国内外公开发表过，不再以任何形式在其他任何地方发表该论文。3）论文所有内容具有真实性、准确性和科学性，无教育部规定的学术不端行为，不违反国家有关出版管理条例等的规定。4）论文的内容不侵犯他人著作权和其他权利，否则著作权人将承担一切侵权责任，并赔偿由此给 中国食用菌 编辑部造成的全部损失。5）著作权人保证其本人有代表论文其他著作权人做出各项承诺的权力。此声明对全体著作权人均有约束力，不同意上述转让声明的著作权人，请于收到论文刊用通知 5 日内书面回复 中国食用菌 编辑部。中国食用菌 编辑部2023 年 8 月 10 日庞杰等：黑木耳菌丝老化过程中胞外酶变化规律分析79