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34流 行 病 学狐狸体表犬啮毛虱的形态特征观察和分子鉴定粟玉刚1，李向勇2，李蜜1，陈宇明1，吴天晓1，何江鱼1，谭镜明1（1.长沙市农业综合行政执法局，湖南长沙410013；2.长沙生态动物园，湖南长沙410118）摘要：本研究旨在利用全证据法对采自湖南省长沙生态动物园狐狸体表的 2 只寄生虱进行准确鉴定。首先通过显微镜观察寄生虱的形态特征，初步鉴定为毛虱。然后分别提取 2 只寄生虱的 DNA 样本，再以 PCR 扩增寄生虱线粒体细胞色素 c 氧化酶 I 亚基（cox1）基因的部分序列，进行序列分析，并利用 Mega 11 程序最大似然法（ML）构建系统发育树，从分子水平进一步对寄生虱进行鉴定。PCR 扩增结果显示，两个样本条带大小与预期一致，均约 400 bp；序列分析显示两个样本 cox1 序列与 GenBank 收录的犬啮毛虱（Trichodectes canis，基因登录号 MH001214）相似性均为 99.0%；系统发育分析显示，两个样本均与犬啮毛虱位于同一分支。结果表明，采自狐狸体表的寄生虱为犬啮毛虱。本研究为湖南省不同宿主犬啮毛虱流行病学调查提供了新的分子学证据。关键词：狐狸；犬啮毛虱；形态特征；分子鉴定中图分类号：S858.99文献标识码：A文章编号：1005-944X（2023）08-0034-05DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2023.00.007开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Morphological Observation and Molecular Identification of Trichodectes canis on Body Surfaces of FoxesSu Yugang1，Li Xiangyong2，Li Mi1，Chen Yuming1，Wu Tianxiao1，He Jiangyu1，Tan Jingming1（1.Changsha Agricultural Comprehensive Administrative Law Enforcement Bureau，Changsha，Hunan410013，China；2.Changsha Ecological Zoo，Changsha，Hunan410118，China）Abstract：For the purpose of accurate identification of 2 parasitic lice collected from the body surfaces of foxes in Changsha Ecological Zoo in Hunan Province by using entire evidence-based method，their morphological characteristics were observed under a microscope，and the lice were preliminarily confirmed as Trichodectes.Then DNA samples were respectively extracted，partial sequences of the mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I（cox1）gene were amplified by PCR for sequence analysis，and a phylogenetic tree was constructed using the maximum likelihood（ML）method of Mega 11 program for further identification at molecular level.PCR results showed that the sizes of the amplified fragments of two samples were consistent with the expected ones，both of which were about 400 bp；sequence analysis results showed that the cox1 sequences of the two samples were 99.0%similar to that of Trichodectes canis（GenBank accession number：MH001214）；phylogenetic analysis results showed that both samples were located in the same branch as Trichodectes canis.In conclusion，the parasitic lice collected from the body surfaces of foxes were Trichodectes canis.New molecular evidence was thus provided for future epidemiological investigation on Trichodectes canis from different hosts in Hunan Province.Key words：fox；Trichodectes canis；morphological characteristic；molecular identification收稿日期：2023-04-25修回日期：2023-06-07基金项目：长沙市科技计划项目（kq1907002）通信作者：谭镜明。E-mail： 李向勇。E-mail：352023年第40卷第8期流 行 病 学犬啮毛虱（Trichodectes canis，T.canis）隶属于节肢动物门（Arthropoda）昆虫纲（Insecta）虱目（Phthiraptera）犬啮毛虱科（Trichodectidae）啮毛虱属，是一类永久性、专性体外寄生虫，多寄生于犬体表，也寄生于狐狸、果子狸和狼等动物体表1-3。相比于规范饲养的犬只或其他宿主动物，犬啮毛虱在流浪动物中更为常见4，其感染率在不同国家和不同犬类间有很大差异，为 0.2%10.6%不等5。犬啮毛虱采食宿主的皮毛及鳞屑等表皮分泌物，轻度感染时一般不表现临床症状，严重感染会造成宿主瘙痒；宿主频繁啃咬患处引起脱毛，继发湿疹、丘疹等；犬啮毛虱还会影响宿主食欲和睡眠，造成宿主精神不安，营养不良4，6。除对宿主健康造成直接危害外，犬啮毛虱还是犬复孔绦虫（Dipylidium caninum）的中间宿主7，感染了犬啮毛虱的犬只更易感染犬复孔绦虫。犬啮毛虱是一类常见且危害较大的体外寄生虫，但其在狐狸体表的研究鲜有报道。准确鉴定狐狸体表的犬啮毛虱可丰富其在不同宿主的分子流行病学数据，具有重要的学术价值。线粒体基因组因其相对分子质量较小、不发生重组以及呈母系遗传等特点8，已被广泛应用于寄生虫的物种鉴定、系统发育和分子进化分析等领域9-11，包括寄生虱12-14。线粒体细胞色素 c 氧化酶 I 亚基（cytochrome c oxidase subunit 1，cox1）基因被认为是昆虫物种鉴定最理想的分子标记15。本研究对采自湖南省长沙生态动物园狐狸体表的寄生虱，扩增并测序虫体 cox1 基因部分序列，通过序列分析并结合形态特征和宿主信息进行分类鉴定，以期为不同宿主犬啮毛虱流行病学调查提供依据。1材料与方法1.1材料1.1.1样本2 只寄生虱样本（均为雌性，编号12），采集自湖南省长沙生态动物园狐狸体表。1.1.2主要试剂昆虫 DNA 试剂盒 Insect DNA Kit D0926-02，购 自 美 国 Omega Bio-Tek 公 司；蛋白酶 K Proteinase K（20 mg/mL）、无核酸水Nuclease-free Water、无水乙醇，均购自北京全式金生物公司；普通Taq酶预混液Premix Taq（TaKaRa Version 2.0），购自北京宝日医生物技术有限公司；琼脂糖 Bioweste regular agarose G-10，购自西班牙BIOWEST 公司；核酸染料 GelstainRedTM，为美国EverBright 公司产品。1.1.3 主 要 仪 器 设 备 小 型 离 心 机 Scilogex S1010E、小型涡旋震荡仪 Scilogex SCI-VS，购自美国 SCILOGEX 公司；高速离心机 Eppendorf Centrifuge 5427 R，为德国 Eppendorf 公司产品；三温三控水浴锅，购自上海精宏实验设备有限公司；全自动样品快速研磨仪，购自上海净信实业发展有限公司；电子秤，为德国 Sartorius 公司产品；DYY-6C 型电泳仪，购自北京六一生物科技有限公司；紫外凝胶成像系统 Quantum VilBer LouRMAT，为 德 国 VILBER LOURMAT 公 司 产品；PCR 扩增仪 Applied biosystems 2720 Thermal Cycler，购自美国 Thermo Fisher Scientific 公司；体视显微镜 Nikon SMZ18，购自日本 Nikon 公司。1.2方法1.2.1样本采集翻开狐狸体表被毛，用镊子直接采集体表的寄生虱。用生理盐水将虫体反复冲洗数次后，保存于 100%无水乙醇内，放-40 备用。1.2.2形态观察取出存放于无水乙醇的 2 只虫体样本，置于载玻片，在体视显微镜下观察虫体的背面、腹面形态特征，并使用Z轴拍摄法进行拍摄。1.2.3虫体总 DNA 提取将虫体 12 分别放入灭菌 1.5 mL 离心管中，用超纯水反复冲洗 5 次后，使用研磨机研磨。根据昆虫 DNA 试剂盒 Insect DNA Kit D0926-02 说明书步骤，各自完成总 DNA提取，分别编号为样本 HL-1、HL-2，置于-20 保存备用。1.2.4引物合成参照 Hafner 等16报道的寄生虱 cox1 基因序列设计通用引物（上游引物36流 行 病 学L6625：5-CCGGATCCTTYTGRTTYTTYGGNCAYCC-3；下游引物 H7005：5-CCGGATCCACNACRTARTANGTRTCRTG-3）。引物由北京擎科生物有限公司合成。1.2.5PCR 扩增及测序反应体系 25.0 L：普通 Taq 酶预混液 12.5 L，无核酸水 10.5 L，上下游 引 物 各 0.5 L，模 板（提 取 的 样 本 总DNA）1.0 L。反应条件：94 预变性 1 min；98 变性 10 s，45 退火 30 s，72 延伸 1 min，共 35 个循环；最后 72 再延伸 2 min。取 5 L PCR 产物进行 1.0%琼脂糖凝胶电泳，在紫外透射仪下观察结果并拍照。将阳性 PCR 产物送至北京擎科生物科技有限公司测序。1.2.6序列分析使用 Clustal X 2.0 软件17，对原始测序结果进行序列拼接，再使用Chromas v.2.4软件对可疑和模糊位点进行校正，最后将获得的序列提交至 NCBI 进行 Blast 分析（https:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。1.2.7系统发育分析根据前期镜检观察的虫体形态特征，初步判断该寄生虱为毛虱；使用本研究获得的序列及 GenBank（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore）收录的部分毛虱 cox1 序列（表 1），以象虱（Haematomyzus elephantis，GenBank 登录号 KF933034）作为外群，利用 Mega 11 软件18的最大似然（maximum likelihood）法，采用 Kimura 2-parameter 模型构建毛虱线粒体 cox1 基因系统发育树，自举检验值（bootstrap）设置为 1 000。2结果2.1形态观察在 体 视 显 微 镜 下 观 察 到 虫 体 大 小 为3.44 mm1.78 mm，平均大小为 3.5 mm1.6 mm。虫体头部呈淡褐色，形状钝圆，具有一对分节触角和咀嚼式口器，两颊凸出；胸部呈淡褐色，窄于头部，有 3 对足，每个足上具有单爪；腹部呈淡黄色，形似手雷，宽于头部和胸部，分 8 节，体表布满短小的针状刚毛（图 1）。初步判断其为毛虱。2.2PCR 扩增及测序扩增结果（图 2）显示，两个狐狸体表寄生虱样本（HL-1、HL-2）均能成功扩增出约 400 bp 的片段，符合预期长度，且无非特异性杂带，空白对照为阴性。两个阳性样本均能成功双向测通，无双峰。在删除引物序列和低质量序列后，获得两条长度为 350 bp 的序列。表 1用于构建毛虱线粒体 cox1 基因系统发育树的寄生虱信息物种科宿主GenBank 登录号牛毛虱（Bovicola bovis）住牛虱科（Bovicoliidae）牛MH001191绵羊毛虱（Bovicola ovis）住牛虱科（Bovicoliidae）绵羊MH001203山羊毛虱（Bovicola caprae）住牛虱科（Bovicoliidae）山羊MH001178鹿羽虱（Bovicola tibialis）住牛虱科（Bovicoliidae）黑尾鹿KM260757梅花鹿毛虱（Damalinia meyeri sika）住牛虱科（Bovicoliidae）梅花鹿JN122004小熊猫毛虱（Pancola ailurus n.sp.）犬啮毛虱科（Trichodectidae）小熊猫ON973802犬毛虱（Trichodectes canis）犬啮毛虱科（Trichodectidae）犬MH001214A.背面；B.腹面。图 1寄生虱形态特征（雌性）372023年第40卷第8期流 行 病 学2.3序列分析序列比对结果显示，本研究采集的两个阳性样本序列相似性为 100%。Blast 结果显示，两个样本 cox1 序列与 GenBank 收录的来自湖南省长沙市犬体表的犬啮毛虱（GenBank 登录号 MH001214）相似性为 99.0%。2.4cox1 基因系统发育树构建基于部分毛虱 cox1 基因序列构建的系统发育树（图 3）显示，来自长沙生态动物园狐狸体表的寄生虱（HL-1 和 HL-2）与来自湖南省长沙市犬体表的犬啮毛虱（GenBank 登录号 MH001214）位于同一分支（Bv=100），但该分支和同属于犬啮毛虱科的小熊猫毛虱（Pancola.ailurus.sp）所处的分支不同（Bv=56）。3讨论对寄生虫进行准确分类、鉴定是从事寄生虫研究的基础。寄生虫的传统分类鉴定主要采用形态学证据。这种分类方法具有明显的局限性且对使用者的知识储备要求较高，需要丰富的鉴定经验。而线粒体基因组等分子标记的广泛使用为寄生虫的分类鉴定提供了新的有效方法。本研究采用全证据法对采自湖南省长沙生态动物园狐狸体表的寄生虱进行鉴定。形态特征显示：采集的寄生虱呈淡黄褐色，头部钝圆，具咀嚼式口器；身体形似手雷，体表布满针状刚毛，每个足上具有单爪。相关研究19表明，寄生虱足上的单爪能使其更好地适应在哺乳动物宿主体表生活。根据形态特征初步鉴定为毛虱，因为不同毛虱的形态学特征相似，所以单靠形态学很难进行准确鉴定。近年来线粒体基因组是使用最为广泛的分子标记之一，尤其是线粒体 cox1 基因，其具有种内保守、种间差异性较大的特点，被认为是非常理想的分子遗传标记15，常用于分类鉴定、种群遗传分析等研究领域。本研究获得的两个阳性样本株 cox1 基因序列与来自湖南省长沙市的犬啮毛虱（GenBank登录号 MH001214）相似性为 99.0%，表明这两个样本均为犬啮毛虱。系统发育关系强烈支持两个样本和犬啮毛虱（GenBank 登录号 MH001214）处于同一分支（Bv=100），进一步确认采自湖南省长M.DL 500 DNA Marker；12.样本 HL-1 和 HL-2；3.阴性对照。图 2寄生虱 cox1 基因部分序列 PCR 扩增结果图 3基于 cox1 基因部分序列构建的毛虱系统发育树38流 行 病 学沙生态动物园狐狸体表的毛虱为犬啮毛虱。但是犬啮毛虱未和小熊猫毛虱处于同一分支，推测原因可能是由于本研究仅采用 cox1 基因的部分序列，包含的遗传信息有限，不能全面反映毛虱之间的亲缘关系20。本研究结果丰富了来自不同宿主犬啮毛虱的分子数据，也进一步说明线粒体 cox1 基因是良好的分子标记，但形态特征和宿主信息仍是不可或缺的重要信息。参考文献：1 PRICE R D，HELLENTHAL R A，PALMA R L，et al.Illinois natural history survey special publication 24M.Carbondale：Southern Illinois University Press，2003.2 OI M，TSUCHIYA H，MATSUMOTO J，et al.Dog biting louse Trichodectes canis infestation in raccoon dogs Nyctereutes procyonoides viverrinus in JapanJ.Veterinary dermatology，2015，26：70-71.3 DOMNGUEZ-PEAFIEL G，GIMNEZ-PARDO C，GEGNDEZ M，et al.Prevalence of ectoparasitic arthropods on wild animals and cattle in the Las Merindades area Burgos，SpainJ.Parasite，2011，18（3）：251-260.4 BEUGNET F，HALOS L，GUILLOT J.Textbook of clinical parasitology in dogs and catsM.Zaragoza：Servet Editorial-Grupo Ass Biomedia S L，2018.5 MIHALCA A D，DEAK G，PANAIT L C，et al.Efficacy of 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