肌纤维内源TGF-β信号促进急性损伤骨骼肌内巨噬细胞胞葬.pdf

中国临床解剖学杂志 2023 年第 41 卷第 5 期肌纤维内源TGF-信号促进急性损伤骨骼肌内巨噬细胞胞葬廖钊宏1,2，蓝海强2，王涵2，菅晓婷2，黄静雯2，黄姝贤1，廖华2*1.佛山科学技术学院医学院医学检验教研室，佛山528000；2.广东省组织构建与检测重点实验室，南方医科大学基础医学院解剖教研室，广州510515【摘要】目的探究骨骼肌内源TGF-信号对肌毒素诱导的小鼠急性损伤肌内巨噬细胞胞葬的影响。方法选择野生 C57BL/6 鼠（对照）、肌纤维条件性 TGF-受体敲除鼠（SM TGF-r2-/-）。Cardiotoxin(CTX)胫骨前肌（TA）注射诱导小鼠急性肌损伤。比较两组动物损伤肌内巨噬细胞渗出及表型、凋亡细胞数目、巨噬细胞胞葬差异。紫外照射法体外诱导细胞凋亡。体外分化培养原代野生鼠（WT），或SM TGF-r2-/-鼠成肌细胞（MPCs），与巨噬细胞、凋亡细胞共培养，对比分析巨噬细胞胞葬差异。结果较之WT鼠，SM TGF-r2-/-鼠损伤肌内炎性渗出显著，以单核/巨噬细胞为主。M1细胞比例增加（P0.05），但M2细胞比例、胞葬作用显著下调（P0.05）。体外炎性环境中，TGF-r2-/-MPCs共培养体系中的巨噬细胞胞葬、M2巨噬细胞比例较之WT-MPCs均显著下调（P0.05）。结论内源TGF-信号活化肌纤维参与调控巨噬细胞表型，可促进损伤肌内巨噬细胞胞葬，有助于局部炎症舒缓，加快肌修复。【关键词】TGF-信号；肌损伤；巨噬细胞胞葬；炎症【中图分类号】R392.31【文献标识码】A【DOI】10.13418/j.issn.1001-165x.2023.5.07Intrinsic transforming growth factor Beta signaling in myofiber promotes the role on macrophagesefferocytosis in acute injured skeletal muscleLiao Zhaohong1,2,Lan Haiqiang2,Wang Han2,Jian Xiaoting2,Huang Jingwen2,Huang Shuxian1,Liao Hua2*1.Department of Laboratory Medicine,School of Medicine,Foshan University,Foshan 528000,China;2.Department of Anatomy,Guangdong Provincial Key Laboratory of Tissue Construction and Testing,School ofBasic Medical Sciences,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China【Abstract】ObjectiveTo explore the role of skeletal muscle intrinsic transforming growth factor Beta(TGF-)signaling on macrophages efferocytosis in inflamed muscle induced by Cardiotoxin(CTX)injection.MethodsWild C57BL/6 mice(control group)and mice with skeletal muscle-specific deficiency of TGF-II(SM TGF-r2-/-group)were selected.Acute injured skeletal muscle was induced by CTX injection to thetibialis anterior muscle.After injection,the differences of the exudation of macrophages,macrophagesphenotype,apoptotic cells and the role on macrophages efferocytosis in the inflamed muscle between the twogroups were compared.Ultraviolet irradiation was taken to induce of apoptotic cells.In vitro,differentiationculture of primary WT,or SM TGF-r2-/-myoblasts(MPCs)were co-cultured with macrophages and apoptoticcells to compare and analyze the differences of the role on macrophages efferocytosis.ResultsComparedwith the control group,the exudation of inflammatory cells in the injured muscle in SM TGF-r2-/-groupsignificantly increased,mainly contained mononuclear cells/macrophages.The proportion of M1 macrophagessignificantly increased(P0.05),but the proportion of M2 macrophages and the role on macrophagesefferocytosis significantly decreased(P0.05).In the co-cultured system in vitro,compared with the WT-MPCs co-culture system,the role on macrophages efferocytosis and the proportion of M2 macrophagessignificantly decreased in TGF-r2-/-MPCs co-culture system in the pro-inflammatory milieu(P0.05).ConclusionsIntrinsic TGF-signaling can promote the role on macrophages efferocytosis in the injuredmuscle by regulating macrophage phenotype,thus relieving local inflammation and accelerating muscle repair.【Key words】TGF-signaling;Muscle injury;Macrophages efferocytosis;InflammationCorresponding author:Liao Hua,E-mail:hua-【收稿日期】2023-02-24【基金项目】国家自然科学基金面上项目（32071181）；广东省自然 科 学 基 金 面 上 项 目（2023A1515012191）；广 州 市 科技计划项目（202002030497）；国家重点研发计划（2022YFF1202600）【作者简介】廖钊宏（1993-），男，广州人，博士，讲师，研究方向：骨骼肌损伤修复，E-mail:【通讯作者】廖华，教授，E-mail:hua-转化生长因子-（transforming growth factor beta,TGF-），是一种多功能细胞因子，参与细胞生长调节、纤维化、癌变、伤口愈合、血管生成生理病理过程1,2。TGF-b 家族成员参与调控损伤肌组织内肌卫星细胞增殖、肌纤维分化及渗出淋巴细胞的凋亡，抑制持续的炎性渗出，促进细胞外基质（extracellular 实验研究 535CHINESE JOURNAL OF CLINICALANATOMY VOL.41 NO.5 2023matrix，ECM）合成，加速肌损伤愈合、肌纤维再生进程3,4。细胞凋亡是细胞程序性死亡，通常在外周组织 炎 症 发 生 发 展 过 程 中 出 现。而 胞 葬 作 用（Efferocytosis）是指吞噬细胞针对凋亡细胞的定向清除5。吞噬细胞通过特定的自身表面受体识别凋亡细胞的信号，完成吞噬细胞骨架重排及内化，形成胞葬吞噬细胞6。组织 M1是促炎型巨噬细胞，M2是促缓解型巨噬细胞7，M2与胞葬作用密切相关8。人们日常生活中更多地遇到各种急性创伤导致骨骼肌处于病理状态，比如交通事故导致的肌开放性创伤（外伤性肌炎）、横纹肌溶解综合征（无菌性肌炎）等。一旦无法及时控制急性肌炎，那么肌肉就容易导致急性肾衰竭、肌纤维化、瘢痕化甚至转变为慢性肌炎。因此，探究急性肌损伤后的炎症消退、肌组织再生修复等机制对有效控制急性肌炎，预防转向慢性肌炎进展有重要意义。有研究显示 TGF-能影响各类细胞的表型9，由此推测急性肌损伤后，内源TGF-能影响损伤肌内巨噬细胞的表型，从而影响损伤肌内巨噬细胞的功能-胞葬作用。目前，有关肌纤维内源TGF-信号对肌损伤后的炎症反应、免疫细胞功能以及肌纤维再生修复的行为影响鲜有报道。本研究采用 SM TGF-r2-/-鼠作为动物模型，探讨肌纤维内源特异性TGF-信号对急性损伤骨骼肌内巨噬细胞胞葬作用的影响，为临床治疗急性骨骼肌创伤提供一定的理论基础。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物50 只 C57BL/6 小鼠（购自南方医科大学实验动物中心），50 只由 TGF-flox/flox小鼠、MCK-Cre 小鼠（均购自 Jackson 实验室）杂交获得的肌纤维条件性 TGF-II 受体敲除小鼠（SM TGF-r2-/-），均为816 周龄，体重为 1822 g。新生 C57BL/6 小鼠 9 只，新生SM TGF-r2-/-小鼠3只。实验操作均遵循南方医科大学实验动物伦理委员会指南。1.1.2主要试剂与仪器CTX（100 g/mL，Sigma 公司），反转录试剂盒（Thermo Fisher 公司），TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒（上海翊圣生物公司），PE标记 F4/80 抗 体（ThermoFisher 公 司），PE 标 记 CD11b 抗 体（ThermoFisher 公 司），FITC 标 记 Ly6C 抗 体（ThermoFisher 公 司），eFluor 405 标 记 MHC-II 抗 体（ThermoFisher公司），Alexa fluor 700标记CD206抗体（ThermoFisher公司），APC标记CX3CR1抗体（博奥森公司），细胞膜染色试剂盒（PKH67，上海泽叶生物公司），Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒（Sigma公司），大鼠抗小鼠 CD11b（eBioscience公司），大鼠抗小鼠 F4/80（eBioscience 公司），兔抗小鼠 Dystrophin（Abcam 公司），脂多糖（LPS，R&D 公司），干扰素-（IFN-，R&D 公司），Ficoll Plus 1.083（索莱宝公司），多维高清流式细胞仪（BD公司），FACS Aria II细胞分选仪（BD 公司），荧光显微镜（奥林巴斯 BX51），实时荧光定量 PCR 仪器（ABI Step One Plus公司），酶标仪（ThermoFisher公司）。1.2方法1.2.1动物实验将 60 L 的 CTX 溶液（50 g/mL）平均注射到双侧胫骨前肌（TA），制备小鼠急性肌损伤模型。在急性肌损伤后 0、4、7 和 10 d 经颈椎脱位处死小鼠。采集TA肌肉标本并用液氮冷却的异戊烷快速冷冻。根据Ficoll Plus 1.083试剂盒的指示，通过密度梯度离心法从 B6 小鼠脾脏中提取单个核细胞，通过 UV 照射（254 nm，30 min）使其凋亡，用 PKH67（1:250）标记凋亡细胞与活细胞。在肌肉样品采集前12 h，将凋亡细胞（1106）注射到受损的TA中。1.2.2免疫组化学与免疫荧光染色制造组织样本冰冻切片，厚度为 6 m，用苏木精-伊红染色和免疫荧光染色：丙酮固定，添加一抗（CD11b-Dystrophin、F4/80-Dystrophin，1：200），4 孵育过夜。PBS 冲洗，二抗（羊抗大鼠 Cy3、羊抗大鼠-Alexa Fluor 488，1：600）室 温 孵 育 1 h。PBS 冲 洗，DAPI 核 染。根 据TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒指示，将冰冻切片进行Tunel单染与Tunel-F4/80双染。荧光显微镜下观察并比较两组损伤后同一时间点的单核/巨噬细胞渗出、凋亡细胞数目、胞葬巨噬细胞的差异。1.2.3流式细胞术体内检测在肌损伤 4、7 d 后，取材将损伤肌剪碎匀浆，于 37 条件下，用 0.2%胶原酶II消化。过滤，离心收集细胞，重悬于PBS中，封闭Fc 段，添加荧光抗体（抗 CD45-Pacific Blue、抗 F4/80-PE、抗 CD11b-PE、抗 Ly6C-FITC、抗 MHC-II-eFluor、抗CX3CR1-APC、抗 CD206-Alexa fluor 700、抗 Tunel-FITC、抗 Annexin-V-APC、抗 CRT-Alexa fluor 647、抗CD31-APC，1：100），FACS Aria II 细胞分选仪分选与多维高清流式细胞分析仪分选或分析巨噬细胞，分选出来的细胞用以后续的实时荧光定量聚合酶链式反应（real time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR）。对于已注射 PKH67 标记凋亡细胞的组别，根据相对应的试剂盒指示，按照实验需求进行组合染色。Flow Jo软件分析并比较两组损伤后同一时间点的单核/巨噬细胞、M1、M2 渗出、凋亡细胞数目比例、巨噬细胞胞葬的差异。1.2.4qRT-PCR 检测分选巨噬细胞相关炎症因子RNA 的变化用 Trizol 法提取经细胞分选仪分选出来的 F4/80+巨噬细胞，使用反转录试剂盒进行对该细胞 的 RNA 逆 转 录，后 采 用 SYBR Green/ROX qPCRMaster 混 合 试 剂 盒 与 ABI Step One Plus 系 统 进 行qRT-PCR 反应。以 GAPDH 为内源对照，分别检测 536中国临床解剖学杂志 2023 年第 41 卷第 5 期iNOS、TNF-、IL-6、Arg-1、Retnla、Mrc1的 mRNA表达水平。内参及上述因子的引物序列如表1。1.2.5体外细胞共培养模型与巨噬细胞胞葬作用分析从新生 Control 或 SM TGF-r2-/-小鼠的肢体肌肉中收集小鼠肌源性前体细胞（MPCs）。0.2%胶原酶II消化后，过滤肌肉匀浆，离心制备单细胞悬液。收集的细胞在 37、5%CO2的细胞培养箱中于含有 10%胎牛血清和青霉素-链霉素（100 g/mL）的 DMEM/F12 中培养。当培养的 MPCs 覆盖 70%80%的细胞培养皿面积时，用分化培养基（添加 2%HS）培养 72h，将细胞分化为肌管（MPC 肌管）。MPC 肌管用 LPS（100 ng/mL）和 IFN-（3 ng/mL）联合处理 24 h，促炎刺激。为了收集腹腔巨噬细胞，将巯基乙酸盐培养基（2 mL）注入 B6 小鼠腹腔。在 72 h 从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞。将 MPC 肌管与腹腔巨噬细胞以 1:2 的比例共培养 4 h。在 巨 噬 细 胞 胞 葬 作 用 测 定 前 45 min，将PKH67标记的凋亡或活细胞（3106细胞）分别加入共培养皿中。采用免疫荧光和流式分析共培养体系中各组的胞葬作用（F4/80-PKH67），M2巨噬细胞的情况。1.3统计分析应用 IBM SPSS 22.0 统计学软件进行统计分析。One-way ANOVA 法用于多重比较。数据表达方式用平均值标准差（n=3）。P0.05 表示数据具有统计学差异。2结果2.1肌特异性TGF-信号影响肌内炎性反应H&E 染色可见，与 Control 组比较，SM TGF-r2-/-组在 CTX致肌损伤后，于 4、7、10 d内，炎性细胞浸润显著增多，中央核细胞显著减少，肌修复延迟（图1A）。为了鉴定渗出显著增多炎性细胞类型，用 F4/80-Dystrophin、CD11b-Dystrophin 免疫荧光染色，结果显示（图 1B），较于 Control组，SM TGF-r2-/-组损伤肌内的单核/巨噬细胞渗出显著增多（P0.05），流式结果也如此（图 1C）。采用流式细胞术检测损伤肌内巨噬细胞表型，如图 1D 所示，较于 Control 组，SM TGF-r2-/-组损伤肌内 M1（F4/80+Ly6C+或 F4/80+MHC-II+）显 著 升 高（P0.05），M2（F4/80+CD206+或 F4/80+CX3CR1+）显著下降（P0.05）。如图1E所示，较于Control组，SM TGF-r2-/-组损伤肌巨噬细胞分泌的促炎 介 质（iNOS，TNF-，IL-6）mRNA 显 著 升 高（P0.05），而抗炎介质（Arg-1，Retlna，Mrc1）mRNA 则显著下降（P0.05）。2.2肌特异性 TGF-信号调控炎性肌内巨噬细胞胞葬为了解巨噬细胞在不同组别中的胞葬作用差异，我们采用 Tunel 染色标记小鼠损伤肌内的凋亡细胞，结果显示，较于 Control 组，SM TGF-r2-/-组损伤肌内的总凋亡细胞数目无显著差异（图 2A），而巨噬细胞相关联的凋亡细胞（F4/80+Tunel+）显著减少（图2B）（P0.05），游离凋亡细胞（F4/80-Tunel+）显著增多（图2B）（P0.05）。采 用 流 式 细 胞 术 进 行 检 测，较 于Control 鼠，SM TGF-r2-/-组损伤肌内的总凋亡细胞（Tunel+）的比例无显著差异（图2C），而游离凋亡细胞（Annexin-V+Tunel+）的 比 例 显 著 升 高（图 2D）（P0.05），胞葬巨噬细胞（Annexin-V-F4/80+Tunel+）的比例显著下降（图2E）（P0.05）。为了进一步验证巨噬细胞在不同组别中的胞葬作用情况，我们紫外线诱导单个核细胞凋亡，且用PKH67标记（图3A）。外源性移植凋亡细胞或者活细胞于炎性肌肉中，发现较于 Control 组，SM TGF-r2-/-组 M2的比例显著增高（图 3B）（P0.05），而较于移植凋亡细胞组，移植活细胞组的 M2 也有对应的变化，但变化幅度不如前者。采用免疫荧光和流式检测分析，结果显示（图 3C-D），移植凋亡细胞后，较于对Control 组，SM TGF-r2-/-组 的 胞 葬 巨 噬 细 胞（F4/80+PKH67+）数目、比例显著下降（P0.05）。流式分析炎性肌肉中凋亡细胞的“吃我”信号（Tunel+CRT+）与活细胞的“不吃我”信号（Annexin-V-CD31+）的情况。发现两者在两组别鼠组中的表达均无显著差异（图4）。2.3肌特异性TGF-信号对炎性肌内巨噬细胞表型表1qRT-PCR引物序列Tab.1Primer sequence of qRT-PCR基因 GenesArg1RetlnaMrc1iNOSTNF-IL-6GAPDH引物序列（5-3）Primer sequenceFor：CTCCAAGCCAAAGTCCTTAGAGRev：AGGAGCTGTCATTAGGGACAFor：CCAATCCAGCTAACTATCCCTCCRev：ACCCAGTAGCAGTCATCCCAFor：CTCTGTTCAGCTATTGGACGCRev：TGGCACTCCCAAACATAATTTGAFor：CTTCCGGGCAGCCTGTGAGACGRev：ATCCCCAGGTGTTCCCCAGGTAGGFor：GCTGTCTCCCCCGAAAGATGRev：AGGCAGGTGTAGATGTTGTGGFor：GAGTCCGCAGCAGGTGRev：GTGTCAGAGTCCATGGGAFor：CAATGTGTCCGTCGTGGATCTRev：GTCCTCAGTGTAGCCCAAGATG注：Arg1 为精氨酸酶 1；Retlna 为类抵抗素分子；Mrc1 为甘露糖受体 C1；iNOS为诱导型一氧化氮合酶；TNF-为肿瘤坏死因子；IL-6为白介素-6；GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶Note:Arg1 was arginase 1；Retlna was a resistin like molecule;Mrc1 was a mannose receptor C1;INOS was an inducible nitricoxide synthase;TNF-was tumor necrosis factor;IL-6 wasinterleukin-6;GAPDHwasglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase 537CHINESE JOURNAL OF CLINICALANATOMY VOL.41 NO.5 2023与巨噬细胞胞葬作用的影响为了排除体内复杂因素的干扰，我们进行了体外的共培养实验。免疫荧光与流式分析共培养体系中不同组别的巨噬细胞胞葬作用与 M2 巨噬细胞的比例情况。结果显示（图 5），较于 Control-原代肌管共培养体系，TGF-r2/-原代肌管共培养体系在炎性环图1肌纤维特异性TGF-信号缺失对损伤肌炎症的影响A:H&E 染色 CTX 损坏的胫骨前肌情况 B:F4/80-Dystrophin、CD11b-Dystrophin 的免疫荧光双标结果 C:流式分析 CD45+CD11b+和CD45+F4/80+细胞的比例 D:流式分析 M1，M2 的比例 E:qRT-PCR 分析所分选的巨噬细胞中促炎介质与抗炎介质的 mRNA 水平*P0.05，*P0.01，标尺为 50 mFig.1The effect of myofiber specific TGF-signaling deficiency on the inflammation of injured muscleA:H&E staining of CTX-damaged TA muscle;B:Immunofluorescence double-staining result of F4/80-Dystrophin,CD11b-Dystrophin;C:FACSanalysis of the proportion of CD45+CD11b+,CD45+F4/80+cells;D:FACS analysis of the proportion of M1 and M2 cells;E:qRT-PCR analysis inthe mRNA levels of pro-inflammatory mediators and anti-inflammatory mediators in sorted macrophages;*P0.05,*P0.01,Bar=50 m 538中国临床解剖学杂志 2023 年第 41 卷第 5 期图2肌纤维特异性TGF-信号在炎性肌肉中影响巨噬细胞胞葬作用A:Tunel染色标记凋亡细胞 B:巨噬细胞关联的凋亡细胞与游离凋亡细胞的免疫荧光结果 C:流式分析总的凋亡细胞的比例 D:流式分析游离凋亡细胞的比例 E:流式分析胞葬巨噬细胞的比例*P0.05，标尺为 50 mFig.2The effect of myofiber specific TGF-signaling on macrophages efferocytosis in inflamed muscleA:Tunel staining of apoptotic cells;B:Immunofluorescence results of macrophages-associated apoptotic cells and free apoptotic cells;C:FACS analysis of the proportion of all apoptotic cells;D:FACS analysis of the proportion of free apoptotic cells;E:FACS analysis of theproportion of efferocytotic macrophages;*P0.05,Bar=50 m境中巨噬细胞胞葬作用显著减弱（P0.05），M2 巨噬细胞比例显著下降（P0.05）。3讨论急性骨骼肌损伤炎症转归的机制目前并未明确。我们前期的研究显示，采用 CTX 注射野生鼠胫骨前肌内，炎症细胞在4 d渗出最为剧烈，于15 d炎症细胞基本上撤退，肌纤维修复完成，这说明急性骨骼肌创伤触发的炎症具有自限性，损伤肌纤维在一定损伤的范围内具有有效的自我修复能力。而 TGF-b 家族成员参与调控损伤肌组织内肌卫星细胞增殖、肌纤维分化及渗出淋巴细胞的凋亡，抑制持续的炎性渗出，促进细胞外基质（extracellular matrix，ECM）合成，加速 539CHINESE JOURNAL OF CLINICALANATOMY VOL.41 NO.5 2023图3肌纤维通过激活内源TGF-信号驱使巨噬细胞胞葬作用A:紫外线诱导单个核巨噬细胞凋亡且用 PKH67 标记的免疫荧光结果 B：流式分析炎性肌肉中注射或者不注射外源性凋亡细胞后的 M2 的比例 C：外源性移植凋亡细胞于炎性肌肉中巨噬细胞对 PKH67+细胞摄取的免疫荧光结果 D：流式分析注射或者不注射外源性凋亡细胞于炎性肌肉中胞葬巨噬细胞的比例LCs.活细胞 ACs.凋亡细胞*P0.05，*P0.01，标尺为 50 mFig.3Myofiber drives macrophages efferocytosis by priming intrinsic TGF-signaling.A：Immunofluorescence results showed UV-inducted mononuclear cells apoptosis and PKH67 labeling；B:FACS analysis of the percentof M2 macrophages sorted from inflamed muscle injected with exogenous ACs or not；C：Immunofluorescence results showed theuptake of PKH67+apoptotic cells in macrophages after exogenous apoptotic cells transferring into inflamed muscle；D:FACS analysisof the percent of efferocytosis macrophages sorted from inflamed muscle injected with exogenous ACs or notLCs，Living cells；ACs，Apoptotic cells；*P0.05,*P0.01；Bar=50 m 540中国临床解剖学杂志 2023 年第 41 卷第 5 期图 4肌纤维特异性 TGF-信号对凋亡细胞识别信号的影响流式分析炎性肌肉中凋亡细胞的“吃我”信号与活细胞的“不吃我”信号的情况,*P0.05Fig.4The effect of myofiber specific TGF-signalingontherecognitionsignalingofapoptotic cellsFACS analysis of the expression of“eat-me”signal in apoptotic cells and“no-eat-me”signalin living cells in inflamed muscle,*P0.05图5肌纤维TGF-信号对巨噬细胞胞葬作用与M2型巨噬细胞的影响巨噬细胞在炎性 TGF-r2/-原代肌管、Control-原代肌管共培养体系中对 PKH67+标记的凋亡细胞摄取、M2表达的免疫荧光与流式分析结果Mac.巨噬细胞*P0.05，*P0.01 标尺为 50 mFig.5The effect of myofiber TGF-signaling on macrophages efferocytosis and M2 phenotypeImmunofluorescence staining results and FACS analysis of the uptake of PKH67 labeled apoptotic cells and the expression of M2 by macrophageco-cultured with TGF-r2/-or Control-MPCs exposed to pro-inflammatory milieu Mac.Macrophages;*P0.05,*P0.01;Bar=50 m 541CHINESE JOURNAL OF CLINICALANATOMY VOL.41 NO.5 2023肌损伤愈合、肌纤维再生进程。那么，肌纤维内源TGF-b信号是否影响急性骨骼肌创伤的损伤与修复？进一步，肌纤维内源TGF-b信号是如何影响损伤肌内的免疫细胞的表型与功能的？而免疫细胞的功能又是如何在急性骨骼肌创伤发挥作用的？再进一步，肌纤维内源 TGF-b 信号在影响免疫细胞的表型与功能的时候是否还有其它影响因素需要考虑？带着以上问题，我们逐步开展了实验。文献报道，TGF-可降低与肌肉损伤相关的因子水平（如肌酸激酶），促进损伤肌组织的再生与修复10。该发现表明 TGF-在受损肌肉的再生中起重要作用。已有研究显示，急性骨骼肌损伤后，再生肌纤维内TGF-信号以及TGF-信号受体持续上调11，这进一步提示内源TGF-信号参与骨骼肌炎症的转归。TGF-r2 是 TGF-2 因子结合的第一受体分子，两者结合后形成磷酸化的聚合物，促使第二受体TGF-r1 自磷酸化，最终激活 TGF-相应的下游通路12。当小鼠全身 TGF-信号都被敲除后，会发生严重的自身免疫疾病，这样的小鼠在出生 3 周内夭折13。敲除 TGF-r2 能够沉默肌纤维内源性 TGF-信号通路并且能让小鼠相对长时间地存活，以保证后续实验的顺利开展。因此，我们通过 Cre/loxP 重组系统构建了骨骼肌内特异性TGF-2受体条件性缺失小鼠（SM TGF-r2-/-鼠）。吴泽锴等14研究表明持续激活的 TGF-信号有助于缓解肢体创伤后的骨骼肌剧烈炎症与肢体肿胀，促进肌再生修复。但内源 TGF-信号如何缓解骨骼肌炎症，目前鲜有报道。有研究显示TGF-能影响各类细胞的表型6，而巨噬细胞分为促炎型 M1 与抗炎型 M2，M2 与组织炎症撤退与修复的胞葬作用密切相关。所以，本研究希望通过巨噬细胞的表型与功能着手来揭示急性骨骼肌损伤后肌内炎症转归的机制，为临床治疗急性骨骼肌创伤提供一定的理论基础。我们的研究结果显示，在 CTX 制造急性肌损伤动物模型中，内源特异性TGF-信号的缺失导致损伤肌内炎症加剧，渗出单核/巨噬细胞为主，M1 巨噬细胞显著增多，M2 巨噬细胞显著下降，肌再生修复延迟。说明内源特异性 TGF-信号能影响损伤肌巨噬细胞的表型。而表型与功能密切相关，巨噬细胞的重要功能是胞葬作用。我们推测内源特异性 TGF-信号通过影响损伤肌内巨噬细胞表型进一步影响巨噬细胞胞葬作用。于是，我们采用注射活细胞或凋亡细胞于损伤肌内的方式，检测了两组鼠注射前与注射后的损伤肌内巨噬细胞胞葬作用，发现无论是否注射细胞于损伤肌内，内源特异性TGF-信号的缺失能显著下调巨噬细胞胞葬作用。文献报道，凋亡细胞的“吃我”信号（如磷脂酰丝氨酸 PS、钙网蛋白 CRT、血小板反应蛋白 1 TSP1、膜联蛋白 A1 Annexin A1 等）与活细胞的“不吃我”信号（如 CD31、CD46、CD47、CD21 等）能影响巨噬细胞的功能15，我们也想了解内源特异性 TGF-信号是否会干预相关信号以影响损伤肌内巨噬细胞功能。流式结果表明，凋亡细胞的“吃我”信号 Tunel+CRT+与活细胞的“不吃我”信号 Annexin-V-CD31+在两组鼠中的表达无显著差异，这说明内源特异性TGF-信号直接影响损伤肌内巨噬细胞胞葬作用，并不干预凋亡细胞的“吃我”信号。为了排除体内复杂因素的干扰，我们通过体外共培养体系，分析肌纤维特异性TGF-信号对炎性肌肉巨噬细胞的表型与巨噬细胞胞葬作用的影响。结果显示，较于 Control-原代肌管共培养体系，TGF-r2/-原代肌管共培养体系在炎性环境中巨噬细胞胞葬作用显著减弱，M2巨噬细胞比例也显著下降。综上，本研究结果示内源TGF-信号活化肌纤维参与调控巨噬细胞表型，可促进损伤肌内巨噬细胞胞葬，有助于局部炎症舒缓，加快肌修复。这为骨骼肌免疫耐受提供新的线索，也为临床治疗急性骨骼肌创伤提供一定的理论基础。但 TGF-信号的下游分子以及胞葬作用的信号途径本研究未曾涉及，这有待进一步的探究。【参考文献】1 Zhang Y,Alexander PB,Wang XF.TGF-beta Family Signaling in theControl of Cell Proliferation and SurvivalJ.Cold Spring HarbPerspect Biol,2017,9(4):a022145-a022166.DOI:10.1101/cshperspect.a022145.2 Ihara S,Hirata Y,Koike K.TGF-beta in inflammatory bowel disease:akey regulator of immune cells,epithelium,and the intestinal microbiotaJ.J Gastroenterol,2017,52(7):777-787.DOI:10.1007/s00535-017-1350-1.3 Pozzer D,Favellato M,Bolis M,et al.Endoplasmic ReticulumOxidative Stress Triggers Tgf-Beta-Dependent Muscle Dysfunction byAccelerating Ascorbic Acid TurnoverJ.Sci Rep,2017,7:40993-41008.DOI:10.1038/srep40993.4 Best TM,Gharaibeh 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