基于“HOXA-10”探讨氯米芬联合补肾种子汤对多囊卵巢综合征雌鼠子宫内膜容受性影响机制.pdf

世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，实验研究 ：基金项目：云南省应用基础研究项目 中医联合专项青年项目（）；楚雄医药高等专科学校科研项目（）作者单位：楚雄州中医医院，云南 楚雄 ；湖北三峡职业技术学院，湖北 宜昌 通信作者：姚莉娟，：基于“”探讨氯米芬联合补肾种子汤对多囊卵巢综合征雌鼠子宫内膜容受性影响机制姚莉娟查川淋张雯婷周双双李丽梅【摘要】目的通过氯米芬联合补肾种子汤调控“同源框基因 （）”表达水平，研究其影响多囊卵巢综合征（，）雌鼠子宫内膜容受性的相关机制。方法将 只 级 雌性大鼠按随机数字表法分为空白对照组、模型组、氯米芬组、补肾种子汤组、氯米芬联合补肾种子汤组，每组各 只。通过丙酸睾酮 绒毛膜促性腺激素（，）颈背部皮下注射 雌鼠构建 动物模型。造模成功后予以氯米芬、补肾种子汤、氯米芬联合补肾种子汤药物干预，连续 ，期间行阴道脱落涂片，并绘制大鼠体质量增长变化曲线。大鼠处死后，检测血清性激素雌二醇（，）、孕酮（，）、促黄体素（，）、促卵泡素（，）含量，行卵巢及子宫 染色，免疫组化观察 在子宫组织中表达水平。结果氯米芬组、氯米芬联合补肾种子汤组与模型组比较，性激素、值升高，比值降低，差异有统计学意义（）；氯米芬联合补肾种子汤组与氯米芬组比较，性激素、值升高，比值降低，差异有统计学意义（），与补肾种子汤组比较，性激素 值升高，差异有统计学意义（），性激素 值升高，比值降低，差异有统计学意义（）。卵巢 染色见：卵巢囊状卵泡明显减少，卵泡形态稍欠规则，颗粒细胞层增厚，见少量黄体。子宫 染色见：子宫内膜略显平坦，内膜增厚，子宫腺体增多，管腔轻度扩张，分泌物增多。氯米芬联合补肾种子汤组雌鼠 表达水平明显高于模型组、氯米芬组及补肾种子汤组，差异有统计学意义（）。以上指标数值增减及子宫、卵巢形态学改变以氯米芬联合补肾种子汤组最为明显，疗效最为显著。结论氯米芬联合补肾种子汤治疗 雌鼠模型，疗效明显优于单纯使用氯米芬或补肾种子汤，其作用机制为通过下调 比值，上调血清、水平及子宫组织 表达水平，改善 雌鼠卵巢形态学，提升大鼠子宫内膜容受性。【关键词】模型，氯米芬联合补肾种子汤，卵巢，子宫，【中图分类号】【文献标识码】“”，（，；，）【】“（）”（），（），（），（），（），（），（），世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，（），（），（），（），（），【】；多 囊 卵 巢 综 合 征（，）是以生殖障碍、代谢异常为主要疾病特征的一种内分泌紊乱综合征，病理症状涉及多个系统，常并发子宫内膜增生、子宫内膜癌，是引起不孕和反复妊娠失败等不良生殖结局的重要因素 。研究证实，患者的不良生殖结局与代谢和内分泌改变以及促排卵药物治疗后子宫内膜容受性降低关系密切 。探讨用何种方法、何种治疗手段来不断提升 不孕患者子宫内膜容受性迫在眉睫，对其机制研究具有重要意义。本团队使用氯米芬联合补肾种子汤治疗 不孕，至今已有十余年，通过对临床病例观察发现氯米芬联合补肾种子汤促排卵助孕治疗 不孕疗效较单纯使用氯米芬或补肾种子汤佳。临床治疗 不孕多采用氯米芬，但氯米芬治疗导致的子宫内膜容受性下降使得高排卵率、低妊娠率成为常见现象 。氯米芬联合补肾种子汤则能通过改善子宫内膜容受性，达到提高妊娠率、降低流产率的目的，且治疗周期短于单药治疗。笔者前期通过查阅收集 动物造模文献并对不同的造模方式进行分析、总结 ，发现丙酸睾酮联合 大鼠造模大鼠血清性激素及卵巢局部形态学与人类 临床特征相似 ，且模型持续时间长，更适用于临床药物动物实验。因此，本研究设计经丙酸睾酮 建立 大鼠模型，对其进行药物干预（氯米芬、补肾种子汤、氯米芬联合补肾种子汤），探讨氯米芬联合补肾种子汤对 雌鼠不孕模型的治疗效果，以大鼠体质量，血清性激素水平，染色下卵巢及子宫形态学改变，免疫组化检测子宫内膜组织中 表达水平等研究指标，探讨氯米芬联合补肾种子汤对 雌鼠子宫容受性的影响及其可能机制，为氯米芬联合补肾种子汤的临床推广、运用提供依据，同时寻找临床提高 患者子宫内膜容受性的治疗靶点，对改善其生殖结局具有重要意义 。材料与方法 材料 动物选取 周龄的 级 雌性大鼠 只，体质量约 ，购于斯贝福（北京）生物技术有限公司，动物生产许可证号：（川），动物合格证号：。在常规实验条件下饲养。该动物实验已通过楚雄州中医医院伦理委员会审批（审批号：）。药物及制备（）补肾种子汤由菟丝子 ，党参 ，紫丹参（彝药：呆乃色），乌药 ，巴戟天 ，淫羊藿 ，仙茅 ，茯苓（彝药：涛铺），鸡血藤 ，熟地黄 ，当归 ，续断 ，女贞子 ，墨旱莲 。根据前期实验、同时遵循动物实验伦理 原则计算出大鼠灌胃用药量实际相当于 成人用药等效剂量的 倍，即中剂量，根据人 大鼠体表面积计算公式 ，由楚雄州中医医院颗粒药房按标准化艺制备成免煎颗粒浓缩为补肾种子汤中剂量（）的中药液。（）丙酸睾酮购自索莱宝公司，生产批号：；绒毛膜促性腺激素（，）购自阿拉丁公司，生产批号：；氯米芬购自索莱宝公司，生产批号：。试剂及仪器（）苏木素购自 公司（），石蜡购自 公司（），伊红购自 公司（）。（）雌二醇（，）、孕酮（，）、世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，促黄体素（，）、促卵泡素（，）酶联免疫分析（）试剂盒：酶联，批号分别为：、。酶标仪购自美国 公司，生产批号为 。（）引物，购自 公司，生产批号：；山羊二步法检测试剂盒，购自北京中杉金桥公司，生产批号为 。（）电热恒温鼓风干燥箱购自厂家上海森信公司，型号为 ；高速冷冻离心机购于 ；移液器：；冰箱：海尔；正置白光拍照显微镜：厂家 （），型号 ；分析软件：厂家 （），型号 。方法 分组及建立 动物模型适应性喂养 后进入后续实验。采用随机数字表法将 只 大鼠随机分成空白对照组、模型组、氯米芬组、补肾种子汤组及氯米芬联合补肾种子汤组，每组各 只。构建 模型：除空白对照组外，其余各组 雌鼠均颈背部皮下注射丙酸睾酮，用量：只，隔日给药 次，同时皮下注射 ，用量：只，给药 次 ，连续 。核验模型建造情况造模处理最后，每天按时行阴道脱落涂片检测，在显微镜下观察各类细胞计数。干预措施（）空白对照组：蒸馏水灌胃，（），连续 ；（）模型组：蒸馏水灌胃，（），连续 ；（）氯米芬组：氯米芬灌胃，（），连续 ；（）补肾种子汤组：补肾种子汤颗粒中药液灌胃，（），连续 ；（）氯米芬联合补肾种子汤组：每日上午补肾种子汤颗粒中药液灌胃，（），下午氯米芬灌胃，（），连续 。观察指标 体质量监测每 测量大鼠的体质量（）并记录，绘制大鼠体重的增长变化曲线。比较各组大鼠处死时体质量变化情况，作为药物治疗后疗效评价手段之一。动情周期检测造模成功后进行药物干预，最后 做阴道涂片，观察上皮细胞判断排卵情况，作为药物干预后 治疗情况评价标准之一。血清性激素水平测定取材前 大鼠禁食，自由进水。药物干预处理第 天，以苯巴比妥钠麻醉大鼠。大鼠麻醉后心脏采血，置于 水浴恒温，以离心半径 ，转速 速度离心 ，将分离好的血清放入?的条件下冷藏备用，检测性激素、的含量，并计算 比值。子宫、卵巢 染色药物干预后，处死大鼠，摘取子宫及双侧卵巢。子宫组织放入包埋盒中，自来水冲洗 （除去多余的多聚甲醛）。卵巢固定、脱水、透明、浸腊，以卵巢最大平面为待测面，石蜡包埋后制成 厚切片，在 图形分析系统下观察。免疫组化将子宫冷藏后进行石蜡切片脱蜡至水。漂洗抗原修复 过氧化氢封闭，避光用滤纸将切片周围的水分吸干 封闭加一抗漂洗涤加反应增强剂漂洗涤加二抗漂洗 显色蒸馏水终止显色苏木素复染脱水、透明、封片。结果判读将 作为阴性对照，阳性为 以细胞核呈黄色或棕黄色颗粒。每张切片随机选定 个区域阳性细胞平均灰度，取其平均值为子宫组织 表达水平。统计学方法采用 统计学软件分析数据，以均数 标准差（）表示实验统计数据。多组间分析采用单因素方差分析检验，以 表示差异有统计学意义。结果 各组 雌鼠体质量变化药物干预后，各组大鼠体质量比较，差异无统计学意义（）。氯米芬联合补肾种子汤组雌鼠体质量最高，补肾种子汤组雌鼠体质量最低。结果见图 。各组 雌鼠动情周期变化造模后，连续行阴道脱落涂片检测。空白对照组动情周期正常，余各模型组 雌鼠出现动情周期紊乱，电镜下见阴道涂片以白细胞为主，表明模型组 雌鼠持续处于动情间期。结果见图。各组 雌鼠血清性激素、水平比较药物 干 预 后，模 型 组 雌 鼠 血 清、水平与空白对照组比较，差异有统计学意义世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，图 各组 雌鼠体质量变化图图 各组 雌鼠动情周期变化（苏木素染色，）（）；氯米芬组 雌鼠血清、与空白对照组比较，差异有统计学意义（），、水平与模型组比较，差异有统计学意义（）；补肾种子组 雌鼠血清、水平与空白对照组比较，差异有统计学意义（），与模型 组 比 较，差 异 有 统 计 学 意 义（），水平与空白对照组比较，差异有统计学意义（），与模型组比较，差异有统计学意义（）；氯米芬联合补肾种子汤组 雌鼠血清、水平与模型组比较，差异有统计学意义（），、水平与氯米芬组、补肾种子组比较，差异有统计学意义（），水平与空白对照组比较，差异有统计学意义（），与补肾种子组比较，差异有统计学意义（）。结果见表 。各组 雌鼠卵巢 染色空白对照组和模型组 雌鼠卵巢 染色与图 所见大致相同。氯米芬组卵巢见多个黄体，卵泡形状成椭圆形，相对规则，卵泡内见大量颗粒细胞。补肾种子汤组卵巢见大量黄体，少量囊状卵泡，部分各级卵泡形态规则。氯米芬联合补肾种子表 各组 雌鼠血清性激素、水平比较（）组别（）（）空白对照组 模型组 氯米芬组 补肾种子汤组 氯米芬联合补肾种子汤组 注：与空白对照组比较，；与模型组比较，；与氯米芬组比较，；与补肾种子汤组比较，汤组卵巢见大量黄体，部分囊状卵泡内见大量颗粒细胞，部分囊状卵巢内颗粒细胞菲薄（见图 ）。经药物干预后，氯米芬组、补肾种子汤组、氯米芬联合补肾种子汤组 雌鼠卵巢 征象较前明显改善，表明药物治疗有效。各组 雌鼠子宫组织切片 染色空白对照组子宫组织切片 染色显微镜下可见子宫内膜均匀平坦，子宫壁各层组织结构完整且清晰，子宫腺体无明显变化，表现为腺体无明显增多或减少。模型组子宫出现形态异常改变，子宫腺体减少，分泌空泡，内膜增厚，内膜上皮细胞增生，呈乳头状凸起。氯米芬组子宫形态欠规则，处于正常内膜或复旧期内膜，内膜上皮细胞局灶性凸起。补肾种子汤组子宫内膜形态不规则，厚度均匀，宫腔内见大量内膜上皮细胞凸起，子宫内膜腺体较空白对照组稍减少。氯米芬联合补肾种子汤组子宫内膜较空白对照组欠平坦，较模型组规整，内膜均匀，子宫腺体无增加，无减少。结果见图 。经药物干预后，氯米芬组、补肾种子汤组、氯米芬联合补肾种子汤组 雌鼠子宫形态、内膜情况较模型组明显改善，表明药物治疗后，雌鼠宫腔更适于受精卵着床。各组 雌鼠子宫内膜 表达水平比较药物干预后，模型组、氯米芬组 积分光密度总和与空白对照组比较，差异有统计学意义（），平均灰度均值差异有统计学意义（）；氯米芬联合补肾种子汤组 积分光密度总和、平均灰度均值与模型组、氯米芬组比较，差异有统计学意义（）。结果见表 。空白对照组 阳性表达呈深棕色，面积较广，分布均匀且密集；模型组 阳性表达呈淡黄色，面积较小且分布稀疏；氯米芬组、补肾种子汤组、氯米芬联合补肾种子汤组阳性表达较模型组均有不同程度增加，主要表现：较多颗粒状分 世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，注：黄体；各级卵泡；囊状卵泡图 各组 雌鼠卵巢 染色（）图 各组 雌鼠子宫组织切片 染色（）表 各组 雌鼠子宫内膜 表达水平比较（）组别积分光密度总和平均灰度均值空白对照组 模型组 氯米芬组 补肾种子汤组 氯米芬联合补肾种子汤组 注：与空白对照组比较，；与模型组比较，；与氯米芬组比较，布，颜色呈黄色或者较深的棕黄色，整体密集且面积较广，但与空白对照组比较，阳性表达均有不同程度减弱。结果见图 。讨论补肾种子汤由我院妇科专家团队研讨组成，临床应用效果显著，可明显提高 患者受孕率，其治疗机制可能和促进患者子宫内膜厚度增加、提高子宫容受性相关。补肾种子汤以补肾养血、滋阴健脾为法，主要药物组成包括中药菟丝子、乌药、巴戟天、淫羊藿、仙茅、鸡血藤、熟地黄、续断、女贞子、墨旱莲，彝药紫丹参（呆乃色）、茯苓（涛铺）等组成。菟丝子：补肾益精、顾护精血；巴戟天、淫羊藿：补肾助阳；鸡血藤：行气补血、调经；熟地：补血填精；续断：补益肝肾；女贞子、墨旱莲滋补肾阴；当归：补血活血、调和经血；紫丹参（呆乃色）：祛瘀生新、活血调经，为妇科要药；茯苓（涛铺）：理气健脾。全方补肾为本，兼顾脾胃。刘颖等 研究发现多数补肾活血类中药具有扩张子宫内膜血管、改善内膜血供、提高营养供应的功效，从而提高妊娠概率。研究表明 ，补肾中药具有类雌激素样作用，能够改善下丘脑 垂体 卵巢轴的调节功能，且补肾中药对于改善子宫内膜容受性的促进作用已得到证实。刘新玉 研究发现，菟丝子及其有效部位提取物药理作用类似减味寿胎丸，有抑制流产模型大鼠的流产率，增加胚胎数，调节血清 、以及 、基因的表达，具有补肾安胎的作用。本研究通过丙酸睾酮 建立 动物模型，经药物干预后处死雌鼠，氯米芬组、补肾种子汤世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，图 各组 雌鼠子宫内膜 表达水平比较（光学显微镜，）组及氯米芬联合补肾种子汤组大鼠血清、值均较模型组明显升高，比值明显降低。卵巢 染色见颗粒细胞层增厚，逐步恢复正常卵泡，卵泡形态趋向于正常，见少量黄体。子宫形态学见内膜上皮细胞局灶性凸起，管腔微扩张，见少部分腺体且腺体形态较迂曲，分泌物明显增多。由此可以得出结论：药物干预后，雌鼠治疗有效，其中氯米芬联合补肾种子汤组疗效较单纯运用氯米芬或补肾种子汤疗效更佳。子宫内膜容受性是对子宫内膜接受胚胎着床能力的概括，子宫内膜容受性降低是影响 患者生育能力的另一重要因素 。是与生殖 系 统、胚 胎 植 入 密 切 相 关 的 转 录 调 节 基因 ，可促进子宫内膜发育成熟、胚胎着床，对子宫内膜容受性起决定性作用 。模型组、氯米芬组、补肾种子汤组、氯米芬联合补肾种子汤组 积分光密度总和、平均灰度均值均较空白对照组减少，氯米芬联合补肾种子汤组 积分光密度总和、平均灰度均值较模型组、氯米芬组、补肾种子汤组均增加。宋玉荣等 研究结果提示子宫 基因表达提高，能显著改善子宫内膜容受性。有研究 通过观察滋肾育胎丸对促排卵小鼠不同着床期的影响，发现与模型组比较，治疗组 表达上调，表达下调，进而推测滋肾育胎丸提高小鼠受孕能力可能是和上调 表达、下调 表达的机制相关，许春燕 采用归肾丸治疗肾虚 薄型子宫内膜大鼠，通过增强 基因的表达，上调子宫内膜的 蛋白，从而达到改善子宫内膜容受性的作用。本研究基于此，通过氯米芬联合补肾种子汤，改善卵巢组织形态及子宫内膜环境，使雌孕激素水平上升，使 表达水平上调，睾酮水平下降则可阻断其表达能力 ，降低 比值，上调 雌鼠子宫 表达水平，从而达到提升 雌鼠子宫内膜容受性的目的，研究中彝药对 不孕的助孕机制，并探索氯米芬联合补肾种子汤对子宫内膜容受性的作用靶点。参考文献 ，：，（），（）：，（）：，（）：，：（），（）：姚莉娟，徐晓娟，王婧婧，等 体现中医病因病机的多囊卵巢综合征动物模型评价及筛选 世界科学技术 中医药现代化，（）：张伟卿，刘霞，李栗，等 补肾调经方对 模型大鼠性激素、卵巢形态及 通路的影响 现代中西医结合杂志，（）：卢凤娟，丛晶，王宇，等 多囊卵巢综合征子宫内膜容受性障碍机制研究进展 生殖医学杂志，（）：秦川，魏泓 实验动物学 版 北京：人民卫生出版社，刘颖，林晓华，赵玉娇 补肾活血方对不孕症患者子宫内膜容受性及妊娠率的影响 现代中西医结合杂志，（）：邵雪艳，崔芳，王希浩 补肾中药促排卵作用机制的研究概况 中医临床研究，（）：刘新玉 菟丝子及其有效部位提取物补肾安胎药效研究 广州：广州中医药大学，（下转第 页）世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，来维持基因组的完整性，从而防止肿瘤的发生和发展 。当细胞受到各种应激因子刺激时，被激活的 迁移至细胞核与促自噬基因结合，促进自噬发生，是促自噬基因之一；当刺激达到一定程度，会迁移至线粒体反式激活 和 ，进而促进 的形成，诱导 及 寡聚化，诱发线粒体外膜透化作用，引起 家族级联反应，最终引发凋亡。本研究结果显示芪灵组 、蛋白表达较空白组增加，自噬标志性蛋白 、凋亡因子 蛋白表达量也同样增加，相应蛋白的 结果与蛋白表达趋势平行，进一步证明芪灵扶正清解颗粒可能是通过 信号通路调节肝癌细胞的自噬和凋亡，从而抑制其增殖。自噬的发生受 信号通路调节，这一过程与雷帕霉素（）有关，抑制 通路能够促进细胞自噬 。本研究中，细胞中经芪灵扶正清解颗粒干预后，、蛋白表达降低，磷酸化的 、降低更为明显，同时 和 的表达增加。信号通路，信号通路均能促进自噬的发生，而高度自噬会引导癌细胞走向凋亡 。综上所述，本研究通过网络药理学数据挖掘分析并结合研究报道，推测芪灵扶正清解颗粒是通过谷甾醇、麦角胺、山奈酚、染料木素等多个活性成分作用于 、等 个靶点，调节 、等信号通路，参与抗炎、抗氧化应激、促凋亡、自噬等多种生物过程，发挥对肝癌细胞的干预作用。并通过 和 结果证实芪灵扶正清解颗粒主要成分抑制 细胞生长与 、信号通路相关，造成细胞凋亡和自噬，该结果为深入研究芪灵扶正清解颗粒抗肝癌作用及进一步为临床合理利用芪灵扶正清解颗粒、开发抗肝癌药物提供了实验依据。参考文献 应倩，汪媛 肝癌流行现况和趋势分析 中国肿瘤，（）：，（）：童光东，王宇新，邢宇锋，等 从“虚、毒、瘀、积”论慢性乙型肝炎及相关肝硬化、肝癌的治疗 中医杂志，（）：李文亭，赵瑛 细胞培养的相关条件 黑龙江医药，（）：章尤权，王清泰，魏建威，等 芪灵扶正清解颗粒对人 肝癌细胞 基因蛋白表达的影响 福建中医药，（）：，：（），（）：，（）：，？，（）：，（）：，（）：，（）：（收稿日期：）（上接第 页），：，（）：李丽娜 在子宫内膜异位症不孕患者血清中的表达及意义 吉林医学，（）：符免艾，黄林，冼梅兰，等 启动子区基因多态 睦与子宫内膜容受性的相关性研究 海南医学，（）：杨娟，林秋平，游秀密，等 针药结合治疗对肾虚血瘀型多囊卵巢综合征子宫内膜容受性及血清 表达的影响 中国针灸，（）：，宋玉荣，王文艳，卫兵 定坤丹对多囊卵巢模型大鼠生殖功能的影响 安徽医科大学学报，（）：，（）：许春燕 基于 调控作用探讨归肾丸治疗肾虚 薄型子宫内膜大鼠的机制研究 广州：广州中医药大学，孙兰 高孕激素通过 调节 、和 对子宫内膜容受性的影响 昆明：昆明理工大学，（收稿日期：）