鸡滑液囊支原体疫苗株的培养工艺研究.pdf

2023年第45卷第9期China Poultry Vol.45，No.9.2023预防兽医预防兽医鸡滑液囊支原体疫苗株的培养工艺研究鸡滑液囊支原体疫苗株的培养工艺研究吕虹雨，侯晓岚，朱晨浩，张艳平，张孝智，王宗祥，吴家奇，徐宏军*（青岛蔚蓝生物制品有限公司，山东青岛266000）摘要：为研究不同培养工艺对鸡滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae，MS）疫苗株（QD株）活菌数的影响，试验通过对培养基、血清、培养方式、培养体积等参数的筛选，优化培养工艺，提升培养物的活菌含量。结果显示：与改良Frey氏培养基相比，大溪生物培养基能够使QD株培养时间缩短为1619 h，活菌数稳定在109CCU/mL；草原绿野猪血清的添加能够使QD株培养1617 h，活菌数稳定在1091010CCU/mL；相比静置培养，100 r/min振荡培养使QD株平均培养时间缩短了2.5 h；50%培养体积的活菌数以及平均培养时间优于其他组。研究表明，鸡滑液囊支原体QD株发酵培养工艺确定为按10%比例接种于添加10%草原绿野猪血清的大溪生物培养基中，培养体积为50%，37 恒温培养，转速为100 r/min，通气量为2 L/min，培养时间为12.5 h，10L发酵罐扩大培养能够使活菌数达到1010CCU/mL。关键词：鸡滑液囊支原体；培养工艺；活菌数中图分类号：S852.62文献标识码：A文章编号：1004-6364（2023）09-38-07收稿日期：2022-11-23；修回日期：2023-03-08基金项目：2021年青岛市产业领军人才计划项目作者简介：吕虹雨（1996-），女，硕士，主要从事兽用疫苗研发工作，E-mail：*通讯作者：徐宏军（1975-），男，博士，高级兽医师，主要从事动物疫苗研发工作，E-mail：doi：10.16372/j.issn.1004-6364.2023.09.007Culture Process of Mycoplasma Synoviae Vaccine StrainL Hongyu,HOU Xiaolan,ZHU Chenhao,ZHANG Yanping,ZHANG Xiaozhi,WANG Zongxiang,WU Jiaqi,XU Hongjun*（Qingdao Vland Biological Products Co.,Ltd.,Qingdao,Shandong 266000）Abstract：In order to study the effect of different culture processes on viable bacteria count of Mycoplasma synoviae vaccinestrain(QD strain),culture mediums,serum,culture methods,culture volumes and other parameters were screened to further optimize the culture process and increase viable bacteria content.The results showed that compared with the modified Frey medium,Daxi biological medium could shorten the culture time of QD strain to 16-19 h,and the number of viable bacteria was stable at109CCU/mL.The addition of Caoyuanlvye serum could make QD strain concentrated at 16-17 h,the number of viable bacteriawas stable at 109to 1010CCU/mL.Compared with the static culture method,the average culture time of QD strain was shortenedby 2.5 h by 100 r/min oscillation culture.The number of viable bacteria and average culture time of 50%culture medium volumegroup were better than other groups.The results showed that 10%QD strain was inoculated in Daxi biological medium supplemented with 10%Caoyuanlvye serum and 50%culture volume,incubated at 37 with 100 r/min for rotational speed and 2 L/minfor aeration rate,cultured for 12.5 h in a 10 L fermenter and the number of viable bacteria could reach 1010CCU/mL.Key words：Mycoplasma synoviae;culture process;viable bacteria count鸡滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae，MS）自首次在美国发现并报道后逐渐引起畜禽养殖业的重视，MS能够引起鸡和火鸡发生鸡传染性滑膜炎，可在鸡群中长期存在，一年四季均可引起发-382023年第45卷第9期China Poultry Vol.45，No.9.2023病1。Cortes等2调查表明，蛋鸡以及肉鸡的滑液组织中MS检出率高达95%和74%，且蛋鸡血清中MS的检出率远高于肉种鸡，随着采样日龄的增加，阳性检出率也随之升高。MS可通过水平或垂直传播，各日龄鸡均易感，37周龄鸡最易感并且是重要的水平传播群体，而鸡胚感染率可达16.29%2。鸡感染MS后多表现为亚临床呼吸症状、关节肿大、滑膜炎，并导致鸡群生长发育迟缓、产蛋下降、蛋壳质量下降，种鸡生产性能降低等。鸡群一旦感染MS，极易导致与其他病原的混合感染，增加死亡率，且持续排毒，极难根除，给养殖业带来巨大的经济损失3-4。目前，防控鸡滑液囊支原体病主要通过疫苗免疫和药物控制两种方法5。由于抗生素耐药性日益严峻，治疗效果短暂且有残留风险，开发新的鸡滑液囊支原体疫苗成为防控鸡滑液支原体病的重要方向6-7。目前我国高品质支原体疫苗规模化生产仍然存在较大的难度，主要表现在高滴度支原体的培养仍然存在瓶颈，MS培养条件苛刻，对营养物质需求高，常规的支原体培养方法存在培养时间长、繁殖效果差、培养滴度低等问题，进而导致生产成本高，不利于疫苗规模化生产8。王昆9研究显示，MS CHN-J2-2016 株经扩大培养，48 h时活菌数最高只能达到108CCU/mL，需浓缩后再进行疫苗制备。通过筛选MS培养基以及优化发酵罐培养工艺，2428 h发酵培养活菌数可维持在109CCU/mL，活菌数仍未达到疫苗制备需求，需浓缩后再配制疫苗8，10。本研究通过对MS发酵培养的培养基、血清、培养方式、培养基体积等进行优化研究，以建立MS疫苗株的发酵扩大培养工艺，达到大幅提升培养物活菌含量的目的，为MS疫苗的大规模生产奠定基础。1材料与方法1.1材料1.1.1菌种MS/ShanDong/QingDao/2012 株，简称 QD 株，由青岛蔚蓝生物制品有限公司分离、鉴定及保藏，GenBank登录号为OP970229。1.1.2主要试剂改良Frey氏培养基按照 中国兽药典 进行配制 11，各成分混合后采用1 000 mL水溶解，1.0 mol/L氢氧化钠溶液调pH值至7.67.8，滤过除菌，定量分装，置28 保存，改良Frey氏液体培养基组成见表1；高糖型DMEM购自赛默飞世尔科技有限公司；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）购自北京索莱宝科技有限公司；青霉素购自山东鲁抗医药股份有限公司；鸡滑液囊支原体培养基分别购自内蒙古大溪生物有限公司（简称大溪生物）和北京中海生物科技有限公司（简称中海生物）；试验用血清信息见表2。1.1.3主要设备DHP-9052型电热恒温培养箱购自上海一恒科技有限公司；ZDP250型恒温培养振荡器购自上海精宏实验设备有限公司；BLBIO-10GJC型10L发酵罐购自上海百仑生物科技有限公司；BSC-1304IIA2型生物安全柜购自苏州安泰空气技术有限公司。1.2方法1.2.1鸡滑液囊支原体菌种复苏培养取一瓶鸡滑液囊支原体 QD 株冻干菌种，预防兽医预防兽医表1改良Frey氏培养基成分及含量成分氯化钠/g氯化钾/g硫酸镁（含7个结晶水）/g磷酸氢二钠（含12个结晶水）/g无水磷酸二氢钾/g葡萄糖（含1个结晶水）/g乳蛋白水解物/g酵母浸出粉/g1%NAD/mL1%L-半胱氨酸溶液/mL2%精氨酸溶液/mL猪（或马）血清/mL1%酚红溶液/mL8万单位青霉素/mL1%酚红溶液/mL含量5.00.40.21.60.2105.05.01010201001.0101.0表2试验用血清信息组别S1S2S3S4S5S6S7血清类型猪血清猪血清猪血清猪血清猪血清猪血清马血清生产厂家内蒙古奥普赛生物科技有限公司呼和浩特市草原绿野生物工程材料有限公司北京索莱宝科技有限公司浙江天杭生物科技股份有限公司山东劲牛集团股份有限公司内蒙古大溪生物科技有限公司内蒙古大溪生物科技有限公司简称奥普赛草原绿野索莱宝天杭生物劲牛集团大溪生物大溪生物批号2021061820220202S9060200604021812102022051020220508-392023年第45卷第9期China Poultry Vol.45，No.9.20232 mL/瓶，加入2 mL改良Frey氏培养基将其溶解，按10%的比例接种至改良Frey氏培养基中，置于37 恒温培养箱内静置培养，期间观察颜色变化，待培养基颜色由红色变为橙黄色时取样测定pH值，当pH值降为6.66.8时收获菌液并测定其CCU，如此继代培养。1.2.2鸡滑液囊支原体生长规律将QD株按照10%的比例接种改良Frey氏液体培养基，置37 静置培养，当培养基颜色变橙黄时收获培养液，按照上述方法连续3次传代。然后将生长状态良好的F8代菌液以10%比例接种至改良Frey氏液体培养基，置37 静置培养，接种后每4小时取样，测定pH值以及CCU，直至72 h，确定QD株培养时间与pH值、pH值与CCU的关系。1.2.3不同培养基对鸡滑液囊支原体的培养效果取复苏培养的QD株菌液，按10%比例分别接种于改良Frey氏培养基（M1）、改良Frey+10%DMEM培养基（M2）、大溪生物鸡滑液囊支原体培养基（M3）、中海生物鸡滑液囊支原体培养基（M4），均按 10%比例添加奥普赛猪血清，置于37 恒温培养箱内静置培养，期间观察颜色变化，待培养基颜色由红色变为橙黄色时取样测定pH值，当pH值降为6.66.8时收获菌液并测定其CCU，连续传代培养5代。1.2.4不同厂家血清对鸡滑液囊支原体的培养效果取复苏培养的QD株菌液，按大溪生物培养基体积的 10%分别接种于培养瓶中，再分别以10%比例添加不同厂家的血清（见表2），置于37 恒温培养箱内静置培养，期间观察颜色变化，待培养基颜色由红色变为橙黄色时取样测定pH值，待pH值降为6.66.8时收获并测定其CCU，连续传代培养4代。1.2.5不同培养基与血清组合对鸡滑液囊支原体的培养效果取复苏培养的 QD 株菌液，分别接种至含10%草原绿野猪血清的改良Frey氏培养基（C1）、含10%大溪生物猪血清的改良Frey氏培养基（C2）、含10%草原绿野猪血清的大溪生物培养基（C3）、含10%大溪生物猪血清的大溪生物培养基（C4）中，置于37 恒温培养箱内静置培养，期间观察颜色变化，待培养基颜色由红色变为橙黄色时取样测定pH值，待pH值降为6.66.8时收获并测定其CCU，连续传代培养6代。1.2.6不同培养方式对鸡滑液囊支原体的培养效果取复苏培养的QD株菌液，接种于大溪生物鸡滑液囊支原体培养基中，接种量为培养基体积的10%，所用血清为草原绿野猪血清，血清添加量为培养基体积的10%，分别置于37 恒温培养箱内静置培养和37 恒温摇床内振荡培养，转速为100 r/min。期间观察颜色变化，待培养基颜色由红色变为橙黄色时取样测定pH值，当pH值降为6.66.8时收获菌液并测定其CCU，连续传代培养4代。1.2.7不同培养体积对鸡滑液囊支原体的培养效果取复苏培养的QD株菌液，接种于大溪生物鸡滑液囊支原体培养基中，接种量为培养基体积的10%，所用血清为草原绿野猪血清，血清添加量为培养基体积的10%。培养基的总体积分别设置为培养瓶容积的10%、20%、30%、50%，置于37 恒温摇床内振荡培养，转速为100 r/min。期间观察颜色变化，待培养基颜色由红色变为橙黄色时取样测定pH值，当pH值降为6.66.8时收获菌液并测定其CCU，连续传代培养3代。1.2.8鸡滑液囊支原体发酵扩大培养验证取QD株冻干菌种进行复苏培养，得到F6代菌液20 mL。将F6代菌液继续按照10%的接种量接种至培养基中，当培养基pH值降为6.66.8时收获菌液并测定其CCU，培养得到F7代菌液50 mL。将F7代菌液继续按照10%的接种量接种至培养基中，当培养基pH值降为6.66.8时收获菌液并测定其CCU，培养得到F8代菌液500 mL。基于上述不同培养条件的筛选结果，在10 L发酵罐中加入体积为50%的大溪生物鸡滑液囊支原体培养基，所用血清为草原绿野猪血清，血清添加量为培养基体积的10%。取上述继代培养所得的菌液F8代500 mL接种到发酵罐中。培养温度为37，培养转速为100 r/min，通气量为2 L/min，持续通气或间歇通气培养，待培养基pH值降为6.66.8时收获菌液F9代，并测定其CCU，如此重复发酵培养3次。1.2.9CCU检测方法按照 中国兽药典 方法进行11。采用10倍稀释法，即1.8 mL培养基添加200 L菌种样品倍预防兽医预防兽医-402023年第45卷第9期China Poultry Vol.45，No.9.2023比稀释。取菌种样品在无菌条件下依次按照1 9比例进行倍比稀释，稀释梯度达到10-1、10-210-11，以培养基作为空白对照，于37 培养箱内静置培养7 d，每日观察记录培养基颜色变化。与空白对照比较，10 倍梯度颜色变黄计为一个滴度，即101CCU/mL。每日观察培养基颜色变化，对照培养基颜色应无明显变化，记录出现颜色变黄的最高稀释度，即为CCU滴度。1.3统计与分析使用Microsoft Excel对试验数据进行初步处理，采用 SPSS 26.0 软件对试验数据进行方差分析、多重比较，结果以“平均值标准差”表示，以P0.05作为差异显著性判断标准。2结果与分析2.1鸡滑液囊支原体菌种复苏培养结果采用改良Frey氏液体培养基复苏QD株冻干菌种得到的菌液为F6代，培养时长为24 h，活菌数为108109CCU/mL。2.2鸡滑液囊支原体生长规律结果结果见图1、图2。结果显示，随着培养时间的延长，培养液的pH值逐渐降低，培养液pH值降至 6.87.0 时，活菌数开始升高，当 pH 值降至6.66.8时，活菌数相对稳定且达到最高水平，因此，确定培养液pH值达到6.66.8作为收获菌液的标准。2.3不同培养基对鸡滑液囊支原体的培养效果不同培养基对QD株的培养效果见表3。由表3可知，4种培养基各添加10%的奥普赛猪血清经连续传代培养，QD 株培养时间在 1623 h 之间，其活菌数分布在108109.33CCU/mL；培养至F7代和F8代时，M3和M4组活菌数显著高于M1和M2组（P0.05）；F9代时，M4组活菌数显著高于M1和M3组（P0.05），可见M4组活菌数在连续传代过程中较稳定。因此，选择M4组培养基作为QD株生产培养基。图1鸡滑液囊支原体培养液培养时间与pH值的关系图2鸡滑液囊支原体培养液pH值与活菌数的关系活菌数/lg（CCU/mL）表3不同培养基对鸡滑液囊支原体的培养效果培养基M1M2M3M4P值F7代培养时间/h1820.52319活菌数/lg（CCU/mL）8.000.00B8.000.00B8.670.58A9.000.00A0.037F8代培养时间/h16181616活菌数/lg（CCU/mL）8.000.00B8.000.00B9.000.00A9.000.00A0.012F9代培养时间/h16161717活菌数/lg（CCU/mL）8.330.58B9.000.00A8.330.58B9.000.00A0.037F10代培养时间/h17171716活菌数/lg（CCU/mL）9.000.009.000.009.000.009.330.580.999F11代培养时间/h20.5161716活菌数/lg（CCU/mL）9.000.009.330.589.330.589.330.580.999注：同列数据肩标不同大写字母表示差异显著（P0.05），下同。2.4不同厂家血清对鸡滑液囊支原体的培养效果不同厂家血清对QD株的培养效果见表4。由表4可知，在改良Frey氏培养基中分别添加7种不同厂家的血清，经连续传代培养后，QD株培养时间在1622h之间，活菌数分布在104.331010CCU/mL，其中S7组活菌数较低，且无法连续传代生长，不适宜培养QD株；F7代时，S2组和S6组的活菌数显著高于其他组（P0.05）；F8代时，S6组的活菌数显著高于其他组（P0.05）；F9代时，S2、S3和S6组的活菌数显著高于S1、S4和S5组（P0.05）；F10代时，S6组的活菌数显著高于S3组和S5组（P0.05）。因此，选取连续传代条件下活菌数较高的S2组和S6组血清与培养基进行组合研究。预防兽医预防兽医8.07.57.06.56.05.55.04.54.0pH值4812 16202428 323642 4650 5660 6672培养时间/h1210864204.04.55.05.56.06.57.07.58.0pH值-412023年第45卷第9期China Poultry Vol.45，No.9.20232.5不同培养基与血清组合对鸡滑液囊支原体的培养效果不同培养基与血清组合对QD株的培养效果见表 5。由表 5 可知，4 个组的培养时间分布在1016.5 h，F17代时，C2组活菌数显著低于其他组（P0.05）。因此，根据实际生产成本选择草原绿野猪血清作为培养基添加血清。表4不同厂家血清对鸡滑液囊支原体的培养效果组别S1S2S3S4S5S6S7P值F7代培养时间/h20171722222222活菌数/lg（CCU/mL）8.000.00B8.670.58A8.330.58B8.000.00B8.000.00B9.000.00A4.330.58C0.014F8代培养时间/h181618221618ND活菌数/lg（CCU/mL）8.670.58B9.000.00B9.000.00B8.000.00C8.000.00C10.000.00AND0.009F9代培养时间/h181618161616ND活菌数/lg（CCU/mL）8.330.58B10.000.00A9.670.58A9.000.00B9.000.00B10.000.00AND0.013F10代培养时间/h171618171716ND活菌数/lg（CCU/mL）9.000.00AB9.330.58AB7.670.58B8.330.58AB8.000.00B9.330.58AND0.014注：ND为无数据。表5不同培养基与血清组合对鸡滑液囊支原体的培养效果组别C1C2C3C4P值F12代培养时间/h16.516.516.516.5活菌数/lg（CCU/mL）9.000.009.000.009.000.009.000.001.000F13代培养时间/h15151515活菌数/lg（CCU/mL）8.330.589.000.009.330.009.000.000.107F14代培养时间/h15151010活菌数/lg（CCU/mL）9.000.009.670.589.000.009.000.000.086F15代培养时间/h14.514.514.514.5活菌数/lg（CCU/mL）9.000.008.330.589.000.009.330.000.107F16代培养时间/h16161515活菌数/lg（CCU/mL）9.000.009.670.589.330.009.000.000.214F17代培养时间/h15151515活菌数/lg（CCU/mL）9.670.58A9.330.58B10.000.00A10.000.00A0.0412.6不同培养方式对鸡滑液囊支原体的培养效果不同培养方式对 QD 株的培养效果见表 6。由表6可知，QD株接种至含10%草原绿野猪血清大溪生物培养基中，在振荡或者静置条件下培养，其活菌数均稳定在1091010CCU/mL，F9代时，振荡组的活菌数显著高于静置组（P0.05）。振荡条件下的平均培养时间相对静置的培养时间缩短2.5 h，表明振荡条件可以缩短其培养时间。表6不同培养方式对鸡滑液囊支原体的培养效果培养方式静置振荡P值F7代培养时间/h2321活菌数/lg（CCU/mL）9.000.009.000.001.000F8代培养时间/h1817活菌数/lg（CCU/mL）9.000.009.330.580.317F9代培养时间/h1915活菌数/lg（CCU/mL）9.000.0010.000.000.025F10代培养时间/h1815活菌数/lg（CCU/mL）9.670.589.330.580.4562.7不同培养体积对鸡滑液囊支原体QD株的培养效果不同培养体积对鸡滑液囊支原体的培养效果见表7。由表7可知，培养基体积分别为培养瓶的10%、20%、30%、50%时，QD株接种至含10%草原绿野猪血清的大溪生物培养基中，100 r/min振荡培养，活菌数均稳定在1091010CCU/mL。F9代时，50%体积组活菌数显著高于其他三个组（P0.05）。2.8鸡滑液囊支原体发酵扩大培养验证结果鸡滑液囊支原体发酵扩大培养验证结果见表8。由表8可知，常规培养继代过程中，QD株培养时间为1619 h，活菌数稳定在109CCU/mL，经发酵罐扩大发酵后，培养时间缩短为12.5 h，活菌数可稳定在1010CCU/mL，在三次发酵试验中，F9代发酵收获的活菌数均显著高于常规培养表7不同培养体积对鸡滑液囊支原体的培养效果培养基体积10%20%30%50%P值F7代培养时间/h17222518活菌数/lg（CCU/mL）9.000.009.000.009.000.009.330.580.392F8代培养时间/h18172218活菌数/lg（CCU/mL）9.000.009.670.009.000.009.000.000.086F9代培养时间/h18181818活菌数/lg（CCU/mL）9.330.00B9.000.00B9.000.00B10.000.00A0.041预防兽医预防兽医-422023年第45卷第9期China Poultry Vol.45，No.9.2023（P0.05）。3讨论鸡滑液囊支原体由于分子量小、合成能力有限、生长速度慢，又需要添加NAD以及血清等成分，导致其生产成本过高，这是MS疫苗研发过程中亟待解决的问题12。因此，筛选培养时间短、活菌数高的培养基是关键环节。目前改良Frey氏培养基是培养支原体较为常用的培养基，但存在活菌数低等不足13。本试验将MS QD株接种至4种不同的培养基中连续传代，通过比较生长时间和活菌数，确定大溪生物培养基在提高活菌数方面优于改良Frey氏培养基以及改良Frey+10%DMEM培养基，且性价比优于中海生物培养基，成品培养基成分相对稳定，批间差异小，可降低不同批次发酵菌种的生长差异。研究显示，在改良Frey氏培养基中添加高糖型DMEM有利于提高支原体活菌数，其含有多种氨基酸以及糖酵解反应中的丙酮酸，可能有助于支原体繁殖14-15。本试验结果显示，改良 Frey 氏培养基与添加 10%DMEM的改良Frey氏培养基对MS活菌数提高作用并不显著，其具体作用机制有待进一步研究。血清可以提供脂肪酸、胆固醇等支原体繁殖所需的营养成分，其中猪血清与马血清在MS培养过程中最为常用16。李慕瑶等17提出，相同体积条件下的马血清含有的胆固醇低于猪血清。本试验结果显示，在改良Frey氏培养基中添加马血清来培养MS，培养获得的活菌数较低，且无法连续继代生长，说明马血清中含有的胆固醇、氨基酸、脂肪酸等成分低于猪血清，无法维持MS的繁殖需求，与李慕瑶等17的研究结果一致。李天增等18研究表明，不同厂家猪血清配制的培养基对猪肺炎支原体的活菌数相差可达100倍。本试验结果显示，不同厂家猪血清配制的培养基最终培养菌数相差101 000倍不等，可见不同厂家猪血清处理工艺可能存在不同，最终导致培养效率出现差异。培养条件是支原体培养的重要影响因素，通过对培养基成分、接种量、培养方式、培养体积等进行优化，能为支原体提供适合高效发酵培养的生长环境，进而提高支原体活菌数8，19。本研究在筛选培养基和血清基础上，对MS培养方式和培养体积进行了优化，鉴于MS具有兼性厌氧的特性，对溶氧需求量低且对机械搅拌剪切较为敏感，确定100 r/min低速震荡培养、50%培养基体积的培养条件，采用10 L发酵罐培养，使QD株活菌数达到1010CCU/mL，且发酵罐培养时间缩短至12.5 h。刘鹏等20研究表明，在低通气量和低转速条件下进行大规模发酵培养有利于菌群繁殖。本试验经重复试验证明确定的MS培养工艺稳定，QD株活菌量可达到较高水平，与刘鹏等20结论一致。4结论本研究确定 MS QD 株发酵培养工艺为：按10%体积比例接种于添加10%草原绿野猪血清的大溪生物培养基中，培养体积为50%，37 恒温培养，转速为100 r/min，通气量为2 L/min，10 L发酵罐扩大培养能够使活菌数达到1010CCU/mL，培养时间为12.5 h，结果为MS疫苗大规模发酵生产提供数据支撑。参考文献：1 SUN S K，LIN X，CHEN F，et al.Epidemiological investigationof Mycoplasma synoviae in native chicken breeds in China J.BMC veterinary research，2017，13（1）：1-9.2 CORTES V，SEVILLA-NAVARRO S，GARCIA C，et al.Seroprevalence and prevalence of Mycoplasma synoviae in layinghens and broiler breeders in Spain J.Poultry science，2020，100（3）：100911.3 张丽冬.辽中地区鸡滑液囊支原体感染的流行病学调查及vlhA基因进化分析 D.沈阳：沈阳农业大学，2022.4 BUIM M R，BUZINHANI M，YAMAGUTI M，et al.Mycoplasma synoviae cell invasion：elucidation of the Mycoplasmapathogenesis in chicken J.Comparative immunology microbiology&infectious diseases，2011，34（1）：41-47.5 石晓磊.鸡滑液囊支原体的分离鉴定及其活疫苗免疫效果的评价 D.杨凌：西北农林科技大学，2018.6 BRADBURY J M，YAVARI C A，GILES C J.In vitro evaluation of various antimicrobials against Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae by the micro-broth method，andcomparison with a commercially-prepared test system J.Avian pathology journal of the W.V.P.A，1994，23（1）：105-115.表8鸡滑液囊支原体发酵扩大培养验证结果代次F6代F7代F8代F9代P值发酵-1培养时间/h18171712.5活菌数/lg（CCU/mL）9.000.00B9.000.00B9.000.00B10.000.00A0.012发酵-2培养时间/h19181612.5活菌数/lg（CCU/mL）9.000.00B9.670.00A9.000.00B10.000.00A0.037发酵-3培养时间/h18171712.5活菌数/lg（CCU/mL）9.000.00B9.330.58B9.330.58B10.000.00A0.012预防兽医预防兽医-432023年第45卷第9期China Poultry Vol.45，No.9.20237 LYSNYANSKY I，GERCHMAN I，MIKULA I，et al.Molecularcharacterization of acquired enrofloxacin resistance in Mycoplasma synoviae field isolates J.Antimicrobial agents&chemotherapy，2013，57（7）：3072-3077.8 朱晓玮.鸡滑液囊支原体灭活疫苗（HN01株）生产工艺探索 D.南京：南京农业大学，2018.9 王昆.禽滑液囊支原体灭活疫苗的初步研究 D.兰州：甘肃农业大学，2018.10王艳丰，张丁华，朱金凤.鸡滑液囊支原体病流行现状及防控技术研究进展 J.中国畜牧兽医，2021，48（8）：3038-3049.11中国兽药典委员会.中国兽药典 S.2020年版三部.北京：中国农业出版社，2021.12田亚琴，文玉康，王豪举，等.鸡滑液囊支原体疫苗研究进展 J.中国家禽，2020，42（9）：96-102.13李书光，苗立中，程立坤，等.滑液囊支原体研究进展 J.动物医学进展，2020，41（5）：116-120.14石刚.牛支原体灭活疫苗佐剂的筛选与培养基的改良 D.石河子：石河子大学，2013.15袁宗辉，郝海红，王淑歌，等.一种液体培养基及利用其分离培养鸡毒支原体的方法：CN109913396A P.2019-06-21 2023-02-13.16赵玉龙，刘业兵，石勇，等.鸡毒支原体灭活疫苗抗原制备工艺的优化研究 J.畜牧兽医科技信息，2018（3）：21-23.17李慕瑶，沈青春，刘羿均，等.鸡毒支原体培养基的选择及其效果评价 J.当代畜牧，2014（27）：31-32.18李天增，候凤，李新苹，等.不同厂家猪血清配制的培养基培养猪肺炎支原体的比较研究 J.甘肃畜牧兽医，2019，49（9）：66-68，72.19李寅，高海军，陈坚.高细胞密度发酵技术 M.北京：化学工业出版社，2006.20刘鹏，李鹏昊，张翼，等.猪肺炎支原体HN0613株高密度发酵工艺研究及效力评价 J.畜牧与饲料科学，2018，39（11）：10-15，23.预防兽医预防兽医-44