基因个体化治疗.ppt

个个体化体化药学服学服务与基因相关与基因相关概念概念1.人人类基因基因组计划划n1990年正式启年正式启动人人类基因基因组测序序计划划,2003年年完成。完成。识别人人类基因基因组的所有大的所有大约3万个万个DNA测定定组成人成人类基因基因组DNA的的约30亿对核苷酸核苷酸的序列的序列2.个体化用个体化用药主要潮流，大主要潮流，大势所所趋WHO：2000年提出，21世纪步入“3P”时代预防（preventive），预测（predictable)和个体化（personal）美国FDA：2006全美3600万份用药记录中，880万份（24.3%）使用了说明书中有基因组生物标记信息的药物。FDA：2013.12，已经批准超过200个需要患者基因信息指导才能准确治疗的药物，涉及约40%的患者。三甲评审标准要求：进行个体化给药方案的研究与监测3.We wouldnt think of buying shoes in a single size我们不会愿意买只有一个尺码的皮鞋So why should we be satisfied with one-size-fits-all medicine?那为什么我们就满足于千人一方呢？4.据据世世界界卫卫生生组组织织的的最最新新统统计计，各各国国住住院院病病人人发发生生药药品品不不良良反反应应的的比比率率在在10%10%至至20%20%，其其中中5%5%的的患患者者会会因因为为严严重重的的药药品不良反品不良反应应而死亡。而死亡。目目前前全全世世界界死死亡亡的的病病人人中中，约约有有1/31/3的的患患者者死死于于用用药药不不当当，药药品不良反品不良反应应致死占社会人口死因的第致死占社会人口死因的第4 4位。位。药药物物毒毒性性或或不不良良反反应应的的发发生生往往往往是是因因为为药药物物反反应应的的个个体体差异所致；个体差异使差异所致；个体差异使药药品的效果差异品的效果差异显显著。著。5.个体化个体化药学学临床床应用的意用的意义降低医疗事故发生率缩短平均住院日提高医院收入为临床用药提供更精确的指导（精准剂量,减少不良反应，药物相互作用等）6.疗效好效好疗效不好或无效不好或无疗效效毒副反毒副反应药物反物反应的个体差异的个体差异相同相同药物治物治疗的一的一组人群人群基因基因?环境境?药物不良物不良反反应药物效应7.据据世世界界卫卫生生组组织织的的最最新新统统计计，各各国国住住院院病病人人发发生生药药品品不不良良反反应应的的比比率率在在10%10%至至20%20%，其其中中5%5%的的患患者者会会因因为为严严重重的的药药品不良反品不良反应应而死亡。而死亡。目目前前全全世世界界死死亡亡的的病病人人中中，约约有有1/31/3的的患患者者死死于于用用药药不不当当，药药品不良反品不良反应应致死占社会人口死因的第致死占社会人口死因的第4 4位。位。药药物物毒毒性性或或不不良良反反应应的的发发生生往往往往是是因因为为药药物物反反应应的的个个体体差异所致；个体差异使差异所致；个体差异使药药品的效果差异品的效果差异显显著。著。8.相关相关药物的物的剂量范量范围各各类常用常用药物的有效率物的有效率9.0%0%10%10%20%20%30%30%40%40%50%50%60%60%70%70%80%80%90%90%100%100%基因基因环境因素境因素IIII糖尿病糖尿病乳腺癌乳腺癌男性心肌梗死男性心肌梗死原原发性高血性高血压病病冠心病冠心病I I糖尿病糖尿病苯妥英苯妥英锂水水扬酸酸异戊巴比妥异戊巴比妥双香豆素双香豆素阿司匹林阿司匹林安替匹林安替匹林保泰松保泰松遗传和非和非遗传因素在因素在药物代物代谢中的作用中的作用10.新的医学模式新的医学模式:个体化治个体化治疗（PersonalizedTherapy）根据分子根据分子诊断提出治断提出治疗方案方案诊断断分子分子诊断断-预测反反应 治治疗理想反理想反应药理学理学+基因基因组学学11.12.13.14.基因是基因是载有特定生物有特定生物遗传信息的信息的DNADNA分子片断，人分子片断，人类基因包括两大基因包括两大区域区域:1.:1.编码区区(占占5%);2.5%);2.侧翼序列翼序列15.DNADNA分子是由分子是由腺腺嘌嘌呤（呤（A A）、胞、胞嘧啶嘧啶(C(C）、）、鸟鸟嘌嘌呤（呤（G G）、胸腺）、胸腺嘧啶嘧啶（T T，DNADNA专专有）和有）和尿尿嘧啶嘧啶（U U，RNARNA专专有）碱基排列有）碱基排列组组成成,每个人都存每个人都存在差异，将其称在差异，将其称为为多多态态性。性。人人类类的基因的基因发现发现几百万由几百万由单单一的碱基一的碱基变换变换而形成的位点既而形成的位点既SNPSNP，它意，它意味着个人味着个人间间最小的最小的遗传遗传差异。差异。A:腺腺嘌呤呤T:T:胸胸嘧啶G:G:鸟嘌呤呤C:C:胞胞嘧啶CGTTCTCTATTAACACGTTCTCTATTAACAGCAAGAGATAATTGTGCAAGAGATAATTGTCGTCGTG GCTCTATTAACACTCTATTAACAGCAGCAC CGAGATAATTGTGAGATAATTGT16.10q24.2Chromosome10CYP2C9 genen9Exonn55kbn490AA10q24.2CGTASNPCYP2C9*1NormalenzymaticactivityG A G G A C C G T G T T C A AGluAspArgValGln53CYP2C9*2No enzymatic activityT430CT(Arg144Cys)Cys单核苷酸多核苷酸多态性性（SNP）n导致人致人类遗传易感性的重要因素易感性的重要因素n导致人致人类药物代物代谢和反和反应差异的重要因素差异的重要因素GT突突变野生型野生型 突突变型型17.变态反反应药动学学代代谢吸收、分布、排泄吸收、分布、排泄药效学效学靶向靶向结合作用合作用免疫系免疫系统毒副作用毒副作用治治疗作用作用药物耐受物耐受药物代物代谢酶药物物转运蛋白运蛋白药物靶蛋白、受体物靶蛋白、受体人人类白血球抗原白血球抗原药物作用物作用基因与基因与药物作用的关系原理物作用的关系原理基基因因 蛋白合成蛋白合成举例例：抗抗癫痫药丙戊酸丙戊酸钠的相关代的相关代谢酶CYP2C19其基因最主要的两个突其基因最主要的两个突变位点位点 CYP2C19*2:第第5外外显子子681位位 GA CYP2C19*3:第第4外外显子子636位位 GA产生生终止密止密码，过早早终止蛋白合成，止蛋白合成，产生无活生无活性性CYP2C19CYP2C19酶，降低，降低对丙戊酸代丙戊酸代谢，使其在体，使其在体内蓄内蓄积，发生毒副反生毒副反应18.CCATTGAC.CCATTGAC.GGTAACTG.GGTAACTG.CCATTGAC.CCGTTGAC.GGTAACTG.GGCAACTG.CCGTTGAC.CCGTTGAC.GGCAACTG.GGCAACTG.A/A野生型野生型纯合子合子单核苷酸多核苷酸多态性形成三种基因型和表型性形成三种基因型和表型XXXA/a野生型野生型杂合合子子a/a突突变纯合子合子高活性高活性中活性中活性低活性低活性19.GCCCGCCCA ACCTCCTC CGCCCGCCCG GCCTCCTC C甲病人甲病人乙病人乙病人Wild typeMutationWild typeWild typeConcentrationMutationMutationConcentrationTimeTimeCYP450CYP450CYP450CYP450 相同的相同的剂量不同的血量不同的血浆浓度度20.吸收吸收 -慢慢 -快快受体受体 -缺失缺失 -丰富丰富代代谢 -慢速慢速-中等中等-快速快速-超快速超快速排泄排泄 -缓慢慢 -正常正常药物体内物体内过程程)吸收吸收药物代物代谢酶药物物转运运分布分布药物物转运运代代谢药物代物代谢酶排泄排泄药物物转运运21.CYP 450CYP 450 主要存在于肝微粒体中主要存在于肝微粒体中,它的活性决定它的活性决定药药物的代物的代谢谢速率速率,与与药药物物的清除率有着直接关系。的清除率有着直接关系。CYP 450CYP 450酶酶系的基因主要有系的基因主要有CYP1,CYP2,CYP3 CYP1,CYP2,CYP3 三家族三家族,有以下几种重要有以下几种重要的的P450 P450 酶酶:CYP 1A2:CYP 1A2、CYP2A6CYP2A6、CYP2C9CYP2C9、CYP2C19CYP2C19、CYP2D6CYP2D6、CYP2E1CYP2E1、CYP3A4CYP3A4。22.根据根据CYP2D6CYP2D6基因型基因型调整抗抑郁整抗抑郁药剂量量38383939米帕明多虑平马普替林曲米帕明地昔帕明去甲替林氯米帕明帕罗西丁文拉法辛阿米替林米安色林PMIMEMUM182182132132174174808030 012812881813838174174129129929281811321321791794141818112512598981191191521529292118118138138747475759393115115135135949411611613213270708484110110130130646411511593936060148148170170525238383838%平均剂量23.关于CYP2D6的表型判断举例：关于例：关于CYP2D6的表型判断，的表型判断，CYP2D6属于属于细胞色素胞色素P450酶常常见药物代物代谢酶基因型及表型判断基因型及表型判断24.1 1受体基因突受体基因突变药变药物物计计量量调调整整25.美托洛美托洛尔，根据根据CYP2D6基因基因调整整剂量量26.高血脂高血脂药物及硝酸甘油物及硝酸甘油27.雌激素与儿童智商相关基因雌激素与儿童智商相关基因28.【英国每日英国每日邮报邮报网站网站3 3月月2323日日报报道】科学家道】科学家发现发现了一种会增加儿童智商低下了一种会增加儿童智商低下风险风险的基的基因。因。这这个个发现发现意味着，在新生儿出生后不久意味着，在新生儿出生后不久对对其其进进行一行一项项基因基因检测检测，可能会有助于，可能会有助于发现发现存在上述存在上述问题问题的的婴婴儿，甚至儿，甚至为应对这为应对这一一问题问题确定治确定治疗疗方案做好准方案做好准备备。科学家科学家认识认识到，如果到，如果7 7岁岁以下儿童在体内出以下儿童在体内出现现一种常一种常见见基因基因变变异体的同异体的同时时，甲状腺，甲状腺激素水平也出激素水平也出现现下降，那么他下降，那么他们们的智商的智商变变得异常低下的可能性将得异常低下的可能性将为为其他儿童的其他儿童的4 4倍。倍。每年每年约约有有4%4%的新生儿的新生儿带带有有这这种基因，而且体内的甲状腺激素水平种基因，而且体内的甲状腺激素水平较较低。低。给这给这些儿童服用含有甲状腺激素的些儿童服用含有甲状腺激素的药药片，或片，或许许可以帮助其大可以帮助其大脑脑正常正常发发育并达到正常育并达到正常水平的智商。每年将会有水平的智商。每年将会有3 3万名儿童因此受益。万名儿童因此受益。这项这项新研究的关注重点是与新研究的关注重点是与细细胞内甲状腺激素的胞内甲状腺激素的产产生有关的生有关的型脱碘型脱碘酶酶。研究人研究人员员此前已将此前已将这这种种酶酶的基因突的基因突变变与包括糖尿病和高血与包括糖尿病和高血压压在内的其他健康在内的其他健康问题联问题联系在一起。系在一起。在上述新研究中，加的夫大学和布里斯托在上述新研究中，加的夫大学和布里斯托尔尔大学的科学家大学的科学家对对31233123名名7 7岁岁以下儿童的基因以下儿童的基因数据数据进进行了分析。行了分析。这这些儿童也接受了智商些儿童也接受了智商测试测试。体内甲状腺激素水平体内甲状腺激素水平较较低且存在低且存在型脱碘型脱碘酶酶变变异体的那些儿童，智商低于异体的那些儿童，智商低于8585的可能的可能性是其他儿童的性是其他儿童的4 4倍。而倍。而仅仅存在甲状腺激素水平存在甲状腺激素水平较较低低问题问题的儿童不会面的儿童不会面临临更多智商低下更多智商低下的的风险风险。加的夫大学的皮特加的夫大学的皮特泰勒博士泰勒博士说说：“如果其他研究如果其他研究证实证实了我了我们们的科研成果，那么，的科研成果，那么，除了常除了常规规的新生儿甲状腺激素的新生儿甲状腺激素筛查筛查外，同外，同时进时进行行针对这针对这种基因种基因变变异体的异体的测试测试，将有助于，将有助于识别识别出今后最有可能出今后最有可能变变得智商低下的那些儿童。得智商低下的那些儿童。”相关研究相关研究结结果是在于利物浦召开的英国内分泌果是在于利物浦召开的英国内分泌协协会大会上会大会上发发布的。布的。儿童儿童DIO2DIO2基因突基因突变导致智商低下的研究致智商低下的研究29.在上述新研究中，加的夫大学和布里斯托在上述新研究中，加的夫大学和布里斯托尔尔大学的科学家大学的科学家对对31233123名名7 7岁岁以下儿童的基因以下儿童的基因数据数据进进行了分析。行了分析。这这些儿童也接受了智商些儿童也接受了智商测试测试。体内甲状腺激素水平体内甲状腺激素水平较较低且存在低且存在型脱碘型脱碘酶酶变变异体的那些儿童，智商低于异体的那些儿童，智商低于8585的可能的可能性是其他儿童的性是其他儿童的4 4倍。而倍。而仅仅存在甲状腺激素水平存在甲状腺激素水平较较低低问题问题的儿童不会面的儿童不会面临临更多智商低下更多智商低下的的风险风险。加的夫大学的皮特加的夫大学的皮特泰勒博士泰勒博士说说：“如果其他研究如果其他研究证实证实了我了我们们的科研成果，那么，的科研成果，那么，除了常除了常规规的新生儿甲状腺激素的新生儿甲状腺激素筛查筛查外，同外，同时进时进行行针对这针对这种基因种基因变变异体的异体的测试测试，将有助于，将有助于识别识别出今后最有可能出今后最有可能变变得智商低下的那些儿童。得智商低下的那些儿童。”相关研究相关研究结结果是在于利物浦召开的英国内分泌果是在于利物浦召开的英国内分泌协协会大会上会大会上发发布的。布的。儿童儿童DIO2DIO2基因突基因突变导致智商低下的研究致智商低下的研究30.本世本世纪纪，肿肿瘤的瘤的药药物治物治疗疗取得了巨大成就。但取得了巨大成就。但肿肿瘤瘤细细胞的多胞的多药药耐耐药药性和性和肿肿瘤瘤药药物治物治疗疗的个体差异常造成的个体差异常造成肿肿瘤化瘤化疗疗的失的失败败，且引起，且引起严严重重的毒副反的毒副反应应。个体个体药药物治物治疗疗的的药药效和毒性的差异在很大程度上受到效和毒性的差异在很大程度上受到遗传遗传因素如因素如药药物代物代谢谢酶酶、药药物物转转运蛋白和运蛋白和药药物作用靶点等物作用靶点等药药物相关基因的物相关基因的遗传遗传多多态态性的影响。性的影响。所以抗所以抗恶恶性性肿肿瘤瘤药临药临床有效率床有效率为为30-80%30-80%肿瘤个体化治瘤个体化治疗与与基因基因检测31.根根据据病病人人的的遗遗传传特特征征,选选择择最最有有效效的的疾疾病病治治疗疗方方法法，更更好好地地控控制制疾疾病病的的进进展展甚甚至至预预防疾病的防疾病的发发生，生，实现实现最佳的医学治最佳的医学治疗疗效果。效果。在在合合适适的的时时间间(Right(Right Time)Time)给给合合适适的的病病人人(Right(Right Patient)Patient)施施行行合合适适的的治治疗疗(Right(Right Treatment),Treatment),达到达到肿肿瘤个体化治瘤个体化治疗疗肿瘤个体化治瘤个体化治疗与与基因基因检测32.肿肿瘤个体化治瘤个体化治疗疗包括包括靶向治靶向治疗疗和化和化疗疗两部分两部分:靶向治靶向治疗疗:通通过实时过实时定量、基因定量、基因测测序、序、FISHFISH等技等技术检测肿术检测肿瘤患者基因拷瘤患者基因拷贝贝及基因突及基因突变变信息，根据信息，根据检测结检测结果果进进行靶向治行靶向治疗疗。个体化化个体化化疗疗：通通过实时过实时定量、基因分型、定量、基因分型、mRNAmRNA定定量等技量等技术术，检测检测患者患者肿肿瘤瘤标标本或血液本或血液标标本的本的mRNAmRNA表达、表达、DNADNA的的SNPSNP分型，确定患者分型，确定患者对对化化疗药疗药物的敏物的敏感性和毒性反感性和毒性反应应并确定化并确定化疗剂疗剂量。量。肿瘤个体化治瘤个体化治疗与与基因基因检测33.肿瘤瘤细胞基因表达与化胞基因表达与化疗药药物物34.突突变基因与化基因与化疗药药物物35.肿瘤化瘤化疗疗效及毒副作用基因效及毒副作用基因检测36.果因PPT工作室 2014-03-1937.原 位 杂 交 技 术一一原位杂交技术的历史发展二原位杂交技术的原理及分类三原位杂交技术的一般过程四原位杂交技术的应用38.一、原位杂交技术的历史发展 原位原位杂杂交技交技术术(In situ hybridization(In situ hybridization，ISH)ISH)是分子生物学是分子生物学、组织织化学及化学及细细胞学相胞学相结结合而合而产产生的一生的一门门新新兴兴技技术术，始于，始于2020世世纪纪6060年代。年代。19691969年美国耶年美国耶鲁鲁大学的大学的GallGall等首先用爪蟾核糖体基因等首先用爪蟾核糖体基因探探针针与其卵母与其卵母细细胞胞杂杂交，将交，将该该基因基因进进行定位，与此同行定位，与此同时 BuongiornoNardelliBuongiornoNardelli和和AmaldiAmaldi等等(1970)(1970)相相继继利用同位素利用同位素标记标记核酸探核酸探针进针进行了行了细细胞或胞或组织组织的基因定位，从而的基因定位，从而创创造了原位造了原位杂杂交交技技术术。自此以后，由于分子生物学技。自此以后，由于分子生物学技术术的迅猛的迅猛发发展，特展，特别别是是2020世世纪纪7070年代末到年代末到8080年代初，分子克隆、年代初，分子克隆、质质粒和噬菌体粒和噬菌体DNADNA的构的构建成功，建成功，为为原位原位杂杂交技交技术术的的发发展奠定了深厚的技展奠定了深厚的技术术基基础础。39.二、原位杂交技术的原理及分类 概念：原位杂交技术(In situ hybridization，ISH)是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织，细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。原理：利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即 探针)与组织、细胞或染色体上待测 DNA或 RNA互补配对，结合成专一 的核酸杂交分子，经一定的检测手段 将待测核酸在组织、细胞或染色体上 的位置显示出来。40.原位杂交法分类1、基因基因组原位原位杂交技交技术基因基因组组原位原位杂杂交交(GISH)(GISH)技技术术是是2020世世纪纪8080年代末年代末发发展起来的一种原位展起来的一种原位杂杂交技交技术术。它主要是利。它主要是利用物种之用物种之间间DNADNA同源性的差异，用另一物种的基因同源性的差异，用另一物种的基因组组DNADNA以适当的以适当的浓浓度作封阻，在靶染色体上度作封阻，在靶染色体上进进行原位行原位杂杂交。交。2 2、荧荧光原位光原位杂杂交技交技术术荧荧光原位光原位杂杂交交(FISH)(FISH)技技术术是在已有的放射性是在已有的放射性 原位原位杂杂交技交技术术的基的基础础上上发发展起来的一种非放展起来的一种非放 射性射性DNADNA分子原位分子原位杂杂交技交技术术。它利用。它利用荧荧光光标记标记 的核酸片段的核酸片段为为探探针针，与染色体上或，与染色体上或DNADNA显显微切微切 片上的特异片上的特异性性杂杂交，通交，通过荧过荧光光检测检测系系 统统(荧荧光光显显微微镜镜)检测检测信号信号DNADNA序列在染色体或序列在染色体或 DNADNA显显微切片上的目的微切片上的目的DNADNA序列，序列，进进而确定其而确定其杂杂 交位点。交位点。41.3、多彩色多彩色荧荧光原位光原位杂杂交技交技术术多彩色荧光原位杂交(mFISH)是在荧 光原位杂交技术的基础上发展起来的 一种新技术，它用几种不同颜色的荧 光素单独或混合标记的探针进行原位 杂交，能同时检测多个靶位，各靶位 在荧光显微镜下和照片上的颜色不同，呈现多种色彩。4、原位原位PCRPCR原位PCR技术是常规的原位杂交技术与PCR技术的有机结合，即通过PCR技术对靶核酸序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增使其拷贝数增加，然后通过原位杂交技术进行检测，从而对靶核酸序列进行定性、定位和定量分析。原位杂交法分类42.三、原位杂交技术的一般过程以经过标记的已知核酸分子为探针以细胞内与探针序列互补的特异核酸分子为靶分子在一定条件下使探针与靶核酸分子在原位发生杂交再对其探测43.探探针标记靶核酸靶核酸分子分子杂交交检测44.一）、探针 是含有互补顺序的外源性被标记的DNA或RNA片段，是在原位杂交中用于检测细胞内特定DNA或RNA顺序定位的特殊试剂，探针的碱基序列是已知的，只能与特定的核酸分子结合上1、cDNA2、RNA 3、寡核苷酸45.1、cDNA (complementary DNA)克隆于质粒中，可以无限繁殖，取之不尽 较稳定，不易被降解 标记方法可靠易行优点46.优点：杂交效率比DNA探针高 在检测mRNA时所形成的RNA-mRNA杂交体 比DNA-mRNA杂交体稳定 可以同时得到同义RNA链和反义RNA链 缺点：2、RNA容易受容易受容易受容易受RNARNA酶酶酶酶的的的的污污污污染而被降解染而被降解染而被降解染而被降解47.这类探针是根据靶分子而设计序列 在DNA合成仪上用化学方法合成 优点：形成杂交体快速 （序列短链，杂交时易于穿透）缺点：特异性较低（短链和简单）短链探针(长度10-50个核苷酸)3、寡核苷酸48.二）、探针标记1、标记物 （1）放射性标记物 （2）非放射性标记物2、标记方法 （1）DNA探针标记 （2）RNA探针标记 （3）寡核苷酸探针标记 49.1、标记物高度灵敏性；高度灵敏性；标记标记物与核酸探物与核酸探针结针结合，合，应绝对应绝对不能影响核酸探不能影响核酸探针针与模与模板的板的结结合能力及合能力及结结合的特异性；合的特异性；当用当用酶酶促方法促方法进进行行标记时标记时，应对应对酶酶促活性（促活性（KmKm值值）无）无多大影响，以保多大影响，以保证标记证标记反反应应的效率和的效率和标记产标记产物的比活性；物的比活性；高度特异性；高度特异性；较较高的化学高的化学稳稳定性，保存定性，保存时间长时间长，标记标记及及检测检测方法方法简单简单；对环对环境无境无污污染，染，对对人体无人体无损伤损伤；价格低廉等。价格低廉等。50.标记物分类放射性标记物：同位素 3 3 3 35 5S S、3333P P、3232P P 和和 3 3H H等等非放射性标记物：荧荧光素光素 生物素生物素 地高辛地高辛 溴脱氧尿溴脱氧尿嘧啶嘧啶等等标记标记标记标记分子：分子：分子：分子：某种某种单单核苷酸核苷酸 在在单单核苷酸分子中核苷酸分子中导导入某个原子、入某个原子、功能基功能基团团或或侧链侧链分子作分子作为标记为标记物，物，对对碱基配碱基配对对不造成影响不造成影响51.标记标记分子：分子：放射性放射性标记分子：分子：35S-UTP35S-dATP35S-dCTP32P-UTP32P-dATP等等等等非放射性非放射性标记分子：分子：四甲基四甲基罗罗达明达明-UTP生物素生物素-UTP(Bio-UTP)地高辛地高辛-dUTP(Dig-dUTP)溴脱氧尿溴脱氧尿嘧啶嘧啶本身本身为标记为标记分子分子52.2、标记方法（1）DNADNA探探针标记 切口移位法切口移位法 随机引物法随机引物法（2）RNARNA探探针标记 在体外在体外转录转录技技术术中与探中与探针针制制备备同同时时完成完成（3）寡核苷酸探寡核苷酸探针标记 末端末端转转移法移法将放射性或非放射性的将放射性或非放射性的将放射性或非放射性的将放射性或非放射性的标记标记标记标记分子分子分子分子 在各种在各种在各种在各种酶酶酶酶促反促反促反促反应应应应中参入探中参入探中参入探中参入探针针针针分子分子分子分子53.切口平移法54.随机引物法55.三）、靶核酸分子靶分子靶分子靶分子靶分子（或靶序列）：或靶序列）：指所要探指所要探测测的核酸分子或核苷酸序列的核酸分子或核苷酸序列（DNA或或RNA）DNADNA可以是中期染色体上的或是可以是中期染色体上的或是间间期期细细胞核内的，也可以是胞核内的，也可以是线线粒体粒体DNA或或病毒病毒DNARNARNA可以是可以是编码细编码细胞合成的任何蛋白胞合成的任何蛋白质质分子分子的的mRNA，也可以是核糖体，也可以是核糖体rRNA线线粒体或病毒粒体或病毒RNA56.四）、杂交 1 1.杂杂交体交体 2.2.杂杂交条件交条件 3.3.严严格度的概念格度的概念57.1、杂交体 hybrids DNA-DNADNA-RNARNA-DNA-DNADNA-RNARNA-RNARNA稳定定性性依次是：依次是：DNA-DNA DNA-DNA DNA-RNA DNA-RNARNA-RNARNA-RNA58.DNA-DNA杂杂交双交双链链分子分子变变变变性性性性复性复性复性复性59.2、杂交条件（1 1）杂杂交液交液 （2 2）探）探针浓针浓度（度（3 3）温度（）温度（4 4）pH pH（5 5）时间时间（1 1）、）、杂交液交液 钠盐钠盐（杂杂交效率交效率 非特异反非特异反应应）甲甲酰酰胺（使胺（使杂杂交所需温度降低交所需温度降低裂解裂解红细胞胞）硫酸葡聚糖（提高探硫酸葡聚糖（提高探针浓针浓度）度）牛血清白蛋白和牛血清白蛋白和载载体体DNADNA等等 （阻断探（阻断探针针与与组织组织非特异非特异结结合，合，背景）背景）60.杂交条件（2）、探针浓度 探针浓度影响杂交反应的速度 放射性标记探针0.5g/ml 非放射性为2g/ml 最适宜的探针浓度要经实验摸索得到确定（1 1）杂杂交液交液 （2 2）探）探针浓针浓度（度（3 3）温度（）温度（4 4）pH pH（5 5）时间时间61.杂交条件（3）、温度杂杂交交时时温度一般低于相温度一般低于相应杂应杂交体的交体的TmTm值值2525TmTm值值：是核酸的融解温度，是一半双：是核酸的融解温度，是一半双链链分子解分子解链时链时的温度）的温度）当当杂杂交液含交液含50%50%甲甲酰酰胺、胺、盐浓盐浓度度0.75mol/L0.75mol/L左右左右时时 杂杂交温度：交温度：对对DNADNA探探针针是是4242 对对RNARNA探探针针是是50-5550-55 对对寡核苷酸探寡核苷酸探针针是是37371）杂杂交液交液（2）探）探针浓针浓度（度（3）温度（）温度（4）pH（5）时间时间62.杂交条件（4 4）、）、PHPHpH在在5-9范范围围内，内，杂杂交体形成不受影响交体形成不受影响常用常用缓缓冲液冲液pH为为6.5-7.5（5 5）、）、时间一般探一般探针浓针浓度下，度下，杂杂交反交反应应在在4-64-6小小时时内完成内完成 孵育孵育6 6小小时时后后-杂杂交信号不再增交信号不再增强强 反反应应超超过过2424小小时时后后-已形成的已形成的杂杂交体可能交体可能发发生解生解 链链，杂杂交信号反而减弱交信号反而减弱（1 1）杂杂交液交液 （2 2）探）探针浓针浓度（度（3 3）温度（）温度（4 4）pH pH（5 5）时间时间63.五）、杂交体的探测使使标记标记的的杂杂交体在光交体在光镜镜或或电镜电镜下可下可见见 （一）（一）放射自放射自显显影方法影方法 （二）（二）免疫免疫细细胞化学方胞化学方法法64.（一）、放射自显影方法方法：方法：切片上涂覆核子乳胶膜切片上涂覆核子乳胶膜 置于暗盒中于置于暗盒中于44干燥干燥处处自自显显影影 经显经显影和定影后在影和定影后在显显微微镜镜下下观观察察银银粒粒 在在细细胞和胞和细细胞器的分布情况胞器的分布情况用同位素用同位素标记标记探探针针来来显显示示杂杂交反交反应应的方法的方法65.66.（二）、免疫细胞化学方法报报告分子（告分子（reportermolecules）在在杂杂交后探交后探测测技技术术中，中，为显为显示探示探针标记针标记物而使用的物而使用的免疫免疫细细胞胞化学化学标记标记物物常被叫做常被叫做报报告分子告分子即与抗体即与抗体（或（或亲亲和素、和素、A蛋白、）蛋白、）联结联结，最，最终终在在显显微微镜镜下可下可见见的分子：的分子：荧荧光素光素胶体金胶体金酶酶-过过氧化物氧化物酶酶-H2O2和和DAB碱性磷酸碱性磷酸酶酶-NBT/BCIP用地高辛用地高辛标记标记的探的探针针用用荧荧光素、胶体金、光素、胶体金、酶酶标记标记抗地高辛抗体来抗地高辛抗体来显显示示依据免疫依据免疫细细胞化学原胞化学原理用直接法或理用直接法或间间接法接法来来显显示探示探针标记针标记物物67.四、原位杂交技术的应用1.细胞特异mRNA转录的定位，用于基因图谱、基因表达和基因组进化的研究。2.感染组织中病毒DNA/RNA的检测和定位。3.癌基因、抑癌基因和各种功能基因在转录水平的表达和变化的检测。4.基因在染色体上的定位和检测染色体序列确定染色体核型。5.间期细胞遗传学的研究6.疾病的基因变化的研究68.探探针杂交交采集采集标本本提取基因提取基因组DNA/RNADNA/RNAPCRPCR扩增增显色色/扫描描电泳泳检测纯化化PCRPCR产物物基因芯片基因芯片焦磷酸焦磷酸测序序双脱氧双脱氧标记毛毛细管管电泳泳焦磷酸焦磷酸测序序双脱氧双脱氧测序序RT-PCRRT-PCR实时荧光光PCRPCR采集采集标本本标本本预处理理杂交交测序序 个体化个体化药学服学服务平台平台出出现污染的高染的高风险环节 低低风险环节69.70.