生物医学工程前沿之-疾病治疗3--基因疗法.pptx

生物医学工程前沿生物医学工程前沿主讲主讲教师教师 涂秋芬涂秋芬 第一章 绪论 第二章 生物医学检测与疾病诊断 第三章 疾病治疗 1 药物治疗 2 细胞疗法 3 基因疗法 4 介入疗法 第四章 组织工程与人工器官 1 生物材料 2 种子细胞 3 生物反应器 4 3D打印技术一一：概论：概论二：基本原理二：基本原理“基因工程基因工程”三：人类遗传疾病的基因疗法三：人类遗传疾病的基因疗法四：现状及存在问题四：现状及存在问题 3 基因疗法一：基因疗法概论u经典（狭义）：经典（狭义）：针对遗传病某一基因缺陷，将外源基因导入体内予以矫正。u现在（广义）：现在（广义）：凡是在基因水平上进行操作而达到治疗疾病目的的所有疗法。（一）概念（二）分类5根据靶细胞的类型分类：1、生殖细胞（、生殖细胞（germ cell)基因治疗基因治疗 2、体细胞（、体细胞（somatic cell)基因治疗基因治疗 根据基因转移的途径分类：1、In vivo(活体直接转移或称一步法）活体直接转移或称一步法）2、Ex vivo(回体转移或称二步法）回体转移或称二步法）根据治疗策略分类：1、基因置换：用正常的基因原位置换病变细胞内的用正常的基因原位置换病变细胞内的致致病基因（等位基因）病基因（等位基因）。2、基因修复：将致病基因的突变碱基序列定点纠正，将致病基因的突变碱基序列定点纠正，可用来治疗可用来治疗点突变点突变导致的疾病。导致的疾病。3、基因增补：将目的基因导入患者体内，补偿缺陷细将目的基因导入患者体内，补偿缺陷细胞的功能，可用于胞的功能，可用于隐性遗传病隐性遗传病的治疗。的治疗。4、基因失活：利用反义技术特异性封闭、抑制有害基利用反义技术特异性封闭、抑制有害基因表达，可用于一些因表达，可用于一些显性遗传病或肿瘤的基因治疗显性遗传病或肿瘤的基因治疗。（三）发展历史时间发生事件研究者1944DNA是转化物质Avery1953DNA双螺旋结构模型Watson and Crick1963遗传密码的破译Brenner1979重组体DNA技术、基因转染Mulligan and Berg1980临床地贫研究Cline1990第一个临床试验（ADA)基因Blas and Anderson1992大量癌症临床试验美国等1993中国制定第一部基因治疗质控要点中国1997-重组病毒的产业化及其技术改进美国（三）发展历史 世界第一个基因治疗临床试验：上世纪九十年代初，一位因ADA(腺苷酸脱氨酶)基因缺陷导致严重免疫缺损的四岁女孩，由美国国立卫生研究院用ADA基因治疗，取得疗效。“基因治疗”研究热从此波及全世界，起而效颦，为保障人类健康展现了美好的前景。世界第一个基因治疗药物2003年10月16日，深圳市赛百诺基因技术有限公司研制开发的抗癌新药“重组人重组人p53p53腺病毒注射液腺病毒注射液”（商品名“今又生”）获得国家仪器药品监督管理局颁发的新药证书。这标志着我国在基因治疗药物研制和产业化方面已达世界领先水平，在国际竞争中抢占了先机。赛百诺公司负责人说，这种新药是拥有自主知识产权的广谱肿瘤基因治疗药品，可望2004年1月正式上市。亚洲中国二：基因疗法的基本原理基因工程 基基因因工工程程，也也叫叫基基因因拼拼接接技技术术或或D DN NA A重重组组技技术术，是是指指在在生生物物体体外外，通通过过对对D DN NA A分分子子进进行行人人工工“剪剪切切”和和“拼拼接接”，对对生生物物的的基基因因进进行行改改造造和和重重新新组组合合，然然后后导导入入受受体体细细胞胞进进行行无无性性繁繁殖殖（克克隆隆），使使重重组组基基因因在在受受体体细细胞胞内内表表达达，产产生生出出所需要所需要的基因产物的基因产物。操作环境生物体外？操作对象基 因操作水平DNA 分子水平基本过程剪切拼接导入表达结果人类需要的基因产物你身边的基因工程你身边的基因工程食用油转基因动物转基因植物杂交=基因工程？Two breakthroughsImitation eggs made of soybeans and imitation soybeans made of eggsCongratulations-You are the first victim of recombinant DNAI hope theres nothing genetically modified in this兴奋兴奋迷信迷信恐惧恐惧理性理性（1）DNA是遗传物质：不同基因具有相同的物质基础。地球上的一切生物，从细菌直至人类，它们的基因都是一个具有遗传功能的特定核苷酸序列的DNA片段。而所有生物的DNA的基本结构都是一样的。因此，不同生物的基因（DNA片段）原则上是可以重组互换的。（一）基因工程理论基础（2）DNA双螺旋结构：1953年James D.Watson和Francis H.C.Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机制。（3）中心法则，遗传密码遗传密码是通用的。一系列三联密码子（除极少数的几个以外）同氨基酸之间的对应关系，在所有生物中都是相同的。重组的 DNA分子不管导入什么样的生物细胞中，只要具备转录翻译的条件，均能转译出原样的氨基酸。即使人工合成的DNA分子（基因）同样可以转录翻译出相应的氨基酸。现在，基因是可以人工合成的。（4）基因可切割基因直线排列在DNA分子上。除少数基因重叠排列外，大多数基因彼此之间存在着间隔序列。因此，作为DNA分子上一个特定核苷酸序列的基因，允许从DNA分子上一个一个完整地切割下来。即使是重叠排列的基因，也可以把指定的基因切割下来，尽管破坏了其他基因。（5）基因可转移基因不仅是可以切割下来的，而且发现生物体内有的基因可以在染色体DNA上移动，甚至可以在不同染色体间进行跳跃，插入到靶DNA分子之中。由此表明基因不仅是可转移的。（6）基因通过复制把遗传信息传递经重组的基因一般来说是能传代的，可以获得相对稳定的转基因生物。从细胞中分从细胞中分离出离出DNADNA分离大肠杆分离大肠杆菌中的质粒菌中的质粒 DNA DNA重组重组用重组质粒用重组质粒转化大肠杆菌转化大肠杆菌培养大肠杆培养大肠杆菌，克隆大量菌，克隆大量基因基因限制酶截取限制酶截取DNADNA片断片断（二）基因工程过程示意图1、提取目的基因的方法鸟枪法将供体生物的将供体生物的DNADNA用限制酶切割用限制酶切割为为许多片段许多片段;用限制酶用限制酶切成许多切成许多片断片断再用运载体将这些片段都运载再用运载体将这些片段都运载到受体生物的不同细胞中去。到受体生物的不同细胞中去。只要有一个细胞获得了需要的只要有一个细胞获得了需要的目的基因并得以表达，基因工目的基因并得以表达，基因工程就算成功了。程就算成功了。该法最大的缺点是带有很大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能将真核生物的基因转移到原核生物中去。1、提取目的基因的方法-基因合成法逆转录法：逆转录法：以信使以信使RNARNA为模板，为模板，在逆转录酶的作用下将脱氧核在逆转录酶的作用下将脱氧核苷酸合成苷酸合成DNA(DNA(基因基因)。DNA合成仪PCR扩增仪直接合成法：直接合成法：根据蛋白质的氨根据蛋白质的氨基酸顺序推算出信使基酸顺序推算出信使RNARNA核苷酸核苷酸顺序，再据此推算出基因顺序，再据此推算出基因DNADNA的的脱氧核苷酸顺序。用游离脱氧脱氧核苷酸顺序。用游离脱氧核苷酸直接合成相应的基因。核苷酸直接合成相应的基因。What is PCR?:What is PCR?:polymerase chain reaction polymerase chain reactionThe“Reaction”ComponentsThe“Reaction”Components1)Target DNA-contains the sequence to be amplified.2)Pair of Primers-oligonucleotides that define the sequence to be amplified.3)dNTPs-deoxynucleotidetriphosphates:DNA building blocks.4)Thermostable DNA Polymerase-enzyme that catalyzes the reaction5)Mg+ions-cofactor of the enzyme6)Buffer solution maintains pH and ionic strength of the reaction solution suitable for the activity of the enzyme The ReactionTHERMOCYCLERPCR tubeDenature(heat to 95oC)Lower temperature to 56oC Anneal with primersIncrease temperature to 72oC DNA polymerase+dNTPs2、目的基因与运载体结合用用与提取目的基因相同与提取目的基因相同的的限制性内切酶切割质粒使限制性内切酶切割质粒使之出现一个切口，将目的之出现一个切口，将目的基因插入切口处，让目的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切口上基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后，的黏性末端互补配对后，在连接酶的作用下连接形在连接酶的作用下连接形成重组成重组DNADNA分子。分子。提取质粒并用提取质粒并用限制酶切割限制酶切割用连接酶将目的用连接酶将目的基因和质粒连接基因和质粒连接3、将目的基因导入受体细胞并扩增基因工程中常用的受体细胞有基因工程中常用的受体细胞有大肠大肠杆菌杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌和动、枯草杆菌、土壤农杆菌和动植物细胞等。植物细胞等。导入受体细胞常用的方法是借鉴导入受体细胞常用的方法是借鉴细细菌或者病毒侵染菌或者病毒侵染细胞的途径。通常细胞的途径。通常还要对一些受体细胞进行增大通透还要对一些受体细胞进行增大通透性的处理。性的处理。目的基因可以随着受体细胞进行快目的基因可以随着受体细胞进行快速的繁殖，在很短的时间内获得大速的繁殖，在很短的时间内获得大量的基因。量的基因。将目的基因导将目的基因导入受体细胞入受体细胞将受体细胞将受体细胞进行扩增进行扩增（三）基因工程操作的主要工具将目的基因与运载体DNA连接从人体细胞内提取目的基因片断DNA连接酶限制性内切酶基因的“针线”基因的“剪刀”将目的基因运入大肠杆菌等运载体基因的“运输工具”1、基因的“剪刀”-限制性内切酶分布：分布：主要在微生物中。主要在微生物中。特点：特点：特异性特异性，即识别特定核苷酸序列，即识别特定核苷酸序列，切割切割特定切点特定切点。结果结果：产生产生黏性未端黏性未端（碱基互补配对）。（碱基互补配对）。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将DNA 分子切断。目前已发现的限制酶有200多种。限制性内切酶作用过程点击播放点击播放（1 1）两个双链两个双链DNADNA片段连接起来片段连接起来 5-ACG AATTCGT-3 T4DNA连接酶连接酶 5-ACGAATTCGT-3 3-TGCTTAA GCA-5 3-TGCTTAAGCA-52、基因的“针线”-DNA连接酶 DNADNA连连接接酶酶可可以以催催化化带带有有粘粘性性末末端端或或平平头头末末端端的的双双链链DNADNA中中一一条条链链的的33OHOH与与另另一一条条链链的的55POPO3 3H H2 2形形成磷酸二酯键而相连，从而构成一条完整的成磷酸二酯键而相连，从而构成一条完整的DNADNA长链。长链。（2 2）修补带有缺口的双链修补带有缺口的双链DNADNA分子分子T T4 4DNADNA连接酶连接酶DNA连接酶的作用过程点击播放点击播放其它一些重要的工具酶工具酶 活性 DNADNA聚合酶聚合酶 以以DNADNA为模板合成为模板合成DNA DNA 逆转录酶逆转录酶 以以RNARNA为模板合成为模板合成DNA DNA 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 切除末端磷酸，防止载体自身切除末端磷酸，防止载体自身 环化连接环化连接T4T4多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶 催化核酸催化核酸5-5-羟基磷酸化羟基磷酸化末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶 催化催化3-3-端合成同聚体尾端合成同聚体尾(1)(1)作用作用：将外源基因送入受体细胞。将外源基因送入受体细胞。(2)(2)条件条件：能在宿主细胞内能在宿主细胞内复制复制并稳定地并稳定地保存保存；具有具有多个多个限制酶切点；限制酶切点；具有某些具有某些标记基因标记基因。(3)(3)种类种类：质粒质粒、噬菌体和动植物病毒。、噬菌体和动植物病毒。3、基因的“运输工具”运载体质 粒细胞染色体外能细胞染色体外能自主复制自主复制的小型的小型环状环状DNADNA分子；分子；质粒是基因工程中质粒是基因工程中最常用最常用的运载体；的运载体；最常用的质粒是大肠杆菌的质粒；最常用的质粒是大肠杆菌的质粒；存在于许多细菌及酵母菌等生物中；存在于许多细菌及酵母菌等生物中；质粒的存在质粒的存在对宿主细胞无影响对宿主细胞无影响；质粒的复制只能在宿主细胞内完成。质粒的复制只能在宿主细胞内完成。供体4、基因工程的应用1、基因工程药物（1）概念 从广义上讲凡在生产过程中涉及到从广义上讲凡在生产过程中涉及到基因基因工程工程的药物都可以称为基因工程药物。的药物都可以称为基因工程药物。（四）基因工程在生物医学工程领域的应用 先确定对某种疾病具有预防和治疗作用的先确定对某种疾病具有预防和治疗作用的蛋白质蛋白质；将控制该蛋白质合成过程的将控制该蛋白质合成过程的基因进行分离、纯化或基因进行分离、纯化或 人工合成人工合成；利用利用重组重组DNADNA技术加以改造；技术加以改造；最后将该最后将该基因导入基因导入可以大量生产的受体细胞中不断可以大量生产的受体细胞中不断 繁殖或表达；繁殖或表达；进行进行大规模生产大规模生产具有预防和治疗疾病的蛋白质。具有预防和治疗疾病的蛋白质。激素类激素类及神经递质类药物及神经递质类药物a)a)人人生长激素释放生长激素释放抑制因子抑制因子b)b)人胰岛素人胰岛素c)c)人人生长激素生长激素细胞因子细胞因子类药物类药物a)a)人干扰素人干扰素b)b)人白细胞介素人白细胞介素c)c)集落刺激因子集落刺激因子d)d)促促红细胞生长素红细胞生长素酶类酶类、凝血因子类药物、疫苗等、凝血因子类药物、疫苗等（2）：基因工程工药物的种类第一代基因工程药物第一代基因工程药物是针对因缺乏天然内源性蛋白所是针对因缺乏天然内源性蛋白所引起的疾病。应用基因工程技术去引起的疾病。应用基因工程技术去扩大这类多肽蛋白扩大这类多肽蛋白质的产量质的产量以替代或补充体内对这类活性多肽蛋白质的以替代或补充体内对这类活性多肽蛋白质的需要，主要是以需要，主要是以蛋白质激素类为代表蛋白质激素类为代表，如人胰岛素、，如人胰岛素、胰高血糖素、人生长激素胰高血糖素、人生长激素、生长激素等、生长激素等。第二代基因工程药物第二代基因工程药物是根据内源性多肽蛋白的生理活是根据内源性多肽蛋白的生理活性，应用基因工程技术大量生产这些极为稀有物质，性，应用基因工程技术大量生产这些极为稀有物质，以超正常浓度剂量供给人体，以激发它们的天然活性以超正常浓度剂量供给人体，以激发它们的天然活性作为其治疗疾病的药理基础，主要是以作为其治疗疾病的药理基础，主要是以细胞生长调节细胞生长调节因子因子为代表的，如为代表的，如G-CSFG-CSF，GM-CSFGM-CSF，-IFN-IFN等。等。第三代基因工程药物第三代基因工程药物是直接把目标基因作为药物，例是直接把目标基因作为药物，例如如“重组人重组人p53p53腺病毒注射液腺病毒注射液”。（3）用重组DNA技术生产的部分人类蛋白质及其功能利用利用微生物发酵微生物发酵、动物细胞培养动物细胞培养生产基因工程药物是生产基因工程药物是目前工业化生产基因工程药物的最主要方法。目前工业化生产基因工程药物的最主要方法。从从19821982年重组胰岛素年重组胰岛素批准上市以来，现已有近批准上市以来，现已有近4040种基种基因工程蛋白质药物因工程蛋白质药物投放市场，主要用于治疗癌症、血液投放市场，主要用于治疗癌症、血液病、艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎、细菌感染、骨损伤、病、艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎、细菌感染、骨损伤、创伤、代谢病、外周神经病、矮小症、心血管病、糖尿创伤、代谢病、外周神经病、矮小症、心血管病、糖尿病、不孕症等疑难病。病、不孕症等疑难病。利用转基因植物生产基因工程疫苗利用转基因植物生产基因工程疫苗和和利用转基因动物利用转基因动物乳腺作为生物反应器乳腺作为生物反应器，生产基因工程人类蛋白质药物的，生产基因工程人类蛋白质药物的研究也取得重大进展。研究也取得重大进展。（4）：基因工程制药的技术路径 19891989年，中国批准了年，中国批准了第一个在中国生产的基因工第一个在中国生产的基因工程药物程药物重组人干扰素重组人干扰素1b，标志着中国生产的基，标志着中国生产的基因工程药物实现了零的突破。因工程药物实现了零的突破。截止截止19981998年底，中国已批准上市的基因工程药物年底，中国已批准上市的基因工程药物和疫苗产品共计和疫苗产品共计1515种，种，中国基因工程制药产业销售中国基因工程制药产业销售额已达到了额已达到了7.27.2亿元人民币亿元人民币。预测到预测到20202020年左右，我国生物技术研究产业总产年左右，我国生物技术研究产业总产值达值达2500025000亿至亿至3000030000亿元亿元。（5）：中国基因工程制药的现状 19901990年以来利用转基因植物生产基因工程疫苗的研年以来利用转基因植物生产基因工程疫苗的研究得到了迅速的发展。究得到了迅速的发展。利用转基因植物生产基因工程疫苗，是将抗原基因导利用转基因植物生产基因工程疫苗，是将抗原基因导入植物，让其在植物中表达，入植物，让其在植物中表达，人或动物摄入该植物或其人或动物摄入该植物或其中的抗原蛋白质，以产生对某抗原的免疫应答。中的抗原蛋白质，以产生对某抗原的免疫应答。转基因转基因植物生产疫苗的研究主要集中在烟草、马岭薯、蕃茄、植物生产疫苗的研究主要集中在烟草、马岭薯、蕃茄、香蕉等植物香蕉等植物。转基因植物基因工程疫苗与传统疫苗相比，转基因植物疫苗具有突出的优点：生产成本低，生产成本低，可直接供人服用或饲喂动物，不需要分离提纯。易于保存。易于保存。转基因植物疫苗常温下就可以保存，无须冷藏保存，生产过程也无须严格无菌条件。具有更好的免疫原性。具有更好的免疫原性。植物细胞的全能性及其完整的真核细胞表达系统使抗原蛋白保持了自然状态下的免疫原性，而目前医药生产常用的微生物发酵系统不能对真核蛋白质疫苗进行正确的翻译后加工，往往导致其免疫原性变弱。比传统的免疫途径更安全。比传统的免疫途径更安全。转基因植物疫苗不需要注射器和针头之类的设备，避免由于消毒不严格而通过注射器和针头传播疾病的可能。比传统的免疫途径更有效。比传统的免疫途径更有效。植物细胞壁的存在可以抵抗胃酸、胰蛋白酶以及其他消化酶对抗原蛋白的直接消化，使其在小肠中逐渐释放，利于激起较强的黏膜免疫反应，达到免疫的目的。应用范围广，易于推广。应用范围广，易于推广。转基因植物疫苗不仅可以直接应用于人，而且可以通过添加到饲料中饲喂家畜和野生动物，以达到免疫的目的。利用转基因动物乳腺作为生物反应器，生产基因工程人类蛋白质药物，其生产成本较微生物发酵、动物细胞培养法有显著的降低。其基本方法是：将药用蛋白质基因连接到乳汁蛋白质药用蛋白质基因连接到乳汁蛋白质基因的调节元件下游基因的调节元件下游，然后将连接产物显微注射到哺乳动物受精卵或胚胎干细胞，当转基因胚胎长成个体后，在泌乳期药用蛋白质基因表达，从动物乳汁可获得基因工程药物。乳腺生物反应器生产基因工程药物的研究已取得了一些成功经验，但离商业化生产还有距离。转基因动物乳腺生物反应器生产基因工程药物三：人类遗传疾病的基因疗法狭义：针对遗传病某一基因针对遗传病某一基因缺陷缺陷，将外源基，将外源基 因导入体内予以矫正。因导入体内予以矫正。广义：应该包括基因的应该包括基因的增补增补、基因的、基因的矫正矫正、基因的基因的沉默沉默。1、基因治疗的概念（一）概论2、基因治疗的步骤特异正常基因的分离与克隆 人类基因组计划的主要任务之一就是要从大片段基因组区域或整条染色体DNA 上鉴定出基因表达序列(gene expressed sequences)或转录单位(transcription units)。测定基因表达序列可直接鉴别人类目前认定的61 0万(或仅35万)个基因在染色体上的位置和排列顺序，这就是人类基因组计划所要构建的第四张图谱基因表达图谱，又称基因转录图谱。外源基因的转移a）化学法：将正常基因DNA（及其拷贝）与带电荷物质和磷酸钙、DEAE葡萄糖或与若干脂类混合，形成沉淀的DNA微细颗粒，直接倾入培养基中与细胞接触，由于钙离子有促进DNA透过细胞有作用，某些化合物可扰乱细胞膜，故可将DNA输入细胞内，并整合于受体细胞的基因组中，在适当的条件下，整合基因得以表达，细胞亦可传代。这种方法简单，但效率极低，一般1000100000个细胞中只有一个细胞可结合导入的外源基因。要达到治疗目的，就需要从病人获得大量所需的受体细胞。当然，可以通过选择培养的方法来提高转化率。b）物理法：电穿孔法：将细胞置于高压脉冲电场中，通过电击使细胞产生可逆性的穿孔，周围基质中的DNA可渗进细胞，但有时也会使细胞受到严重损伤。显微注射法：在显微镜直视下，向细胞核内直接注射外源基因，这种方法应是有效的。但一次只能注射一个细胞，工作耗力费时。此法用于生殖细胞时，有效率可达10%。直接用于体细胞却很困难。在动物实验中，应用这种方法将目的基因注入生殖细胞，使之表达而传代，这样的动物就称为转基因动物，目前成功使用得较多的是转基因小鼠它可作为繁殖大量后代的疾病动物模型。脂质体法：脂质体（liposome）法是应用人工脂质体包装外源基因，再与靶细胞融合，或直接注入病灶组织，使之表达。c）同源重组法：将外源基因定位导入受体细胞的染色体上，在该座位因有同源序列，通过单一或双交换，新基因片段替换有缺陷的片段，达到修正缺陷基因的目的。如在新基因片段旁组装一Neo基因，则在同源重组后，因有Neo基因，可在含有新霉素（neomycin）的培养基中生长，从而使未插入新基因片段的细胞死亡。对于体细胞基因治疗，体外培养细胞的时间不能过长，筛选量大，故在临床上应用也受限制难以进行。今后如能改进技术，提高重组率，这种定点修正基因的方法仍是有前景的。d）病毒介导的基因转移法：以病毒为载体（vector），将外源目的基因通过基因重组技术，将其组装于病毒上，让这种重组病毒去感染受体宿主细胞，这种病毒称为病毒运载体（viral vector）。目前应用的有两种病毒介导基因转移方法，即反转录病毒载体和DNA病毒介导载体。反转录病毒载体 反转录病毒虽是RNA病毒，但有反转录酶，可使 RNA转录为DNA，再整合到宿主细胞基因组。在反转录病毒载体中，最常用于人类的是莫洛尼（Mooney）鼠白血病病毒（Mo-MLV）。反转录病毒载体有以下的优点：首先是具有穿透细胞的能力，可使近100%的受体细胞被感染，转化细胞效率高；能感染广谱动物物种和细胞类型而无严格的组织特异性；随机整合的病毒可长期存留，一般无害于细胞。但也存在缺点：这种载体只能把其DNA整合到能旺盛分裂细胞的染色体，而不适合于那些不能正常分裂的细胞，如神经元。最严重的问题是由于病毒自身含有病毒蛋白及癌基因，就有使宿主细胞感染病毒和致癌的危险性。因此，人们有目的地将病毒基因及其癌基因除去，仅留它们的外壳蛋白，以保留其穿透细胞的功能，试图避免上述缺点。这种改造后的病毒称为缺陷型病毒。DNA病毒介导载体 DNA病毒包括腺病毒、SV40、牛乳头瘤病毒、疱疹病毒等，一般认为这类病毒难于改造成缺陷型病毒。1993年美法等国成功采用腺病毒载体进行心、脑、肺、肝内胆管和肌肉组织的体内基因转移。美国设计了一个新的腺病症载体，它是用一个化学连接器即赖氨酸链将DNA栓在病毒外壳上，这样组成的运输器，通过一个表面抗体而进入细胞核，使宿主基因与治疗基因共同表达。这个新病毒载体称为腺病毒多赖氨酸DNA复合体。采用复制缺陷的腺病毒进行基因治疗有以下优点：该病毒可感染分裂和非分裂的细胞，并能得到大量基因产物，对神经细胞、心肌细胞等基因缺陷的纠正有特殊意义；病毒颗粒相对稳定，并易于纯化和浓缩，且感染力不降低；可有效转导多种靶细胞而少游离于细胞基因组外，并持续表达；已用于基因治疗的Ad5属腺病毒C亚群，无致癌性。前述的新腺病毒载体还有一大优点是可以成功地运载48000bp的基因，而其它病毒只能运输7000bp的基因。3、选择靶细胞的原则（体细胞）必须较坚固，足以耐受处理，并易于由人体分离又便于输回体内；具有增殖优势，生命周期长，能存活几月至几年，最后可延续至病人的整个生命期；易于受外源遗传物质的转化；在选用反转录病毒载体时，目的基因表达最好具有组织特异性的细胞。目前使用得较多的是骨髓干细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞和肌细胞等。皮肤成纤维细胞易于移植和从体内分离，又可在培养中生长，并易存活，故有人用之于乙型血友病的基因治疗。有不少遗传病表现了肝细胞功能缺陷，因此，在家族性高胆固醇血症的治疗中，有将低密度脂蛋白（LDL）受体基因转移至肝细胞的尝试。在动物实验中已证明：半乳糖苷酶基因、ADA基因、小肌营养不良蛋白（minidystrophin）基因都已证明能在肌细胞中表达。4、举例说明进行基因治疗必须具备下列条件：选择适当的疾病，并对其发病机理及相应基因的结构功能了解清楚；纠正该病的基因已被克隆，并了解该基因表达与调控的机制与条件；该基因具有适宜的受体细胞并能在体外有效表达；具有安全有效的转移载体和方法，以及可供利用的动物模型。5、基因治疗临床应用的前提三：遗传疾病的基因疗法（二）癌症的基因治疗 1、癌症的发生p 致癌病毒的感染是人类癌症的病因之一；致癌病毒的感染是人类癌症的病因之一；p 细胞原癌基因的恶性激活是另外一个主细胞原癌基因的恶性激活是另外一个主要原因（基因点突变、染色体异位等）要原因（基因点突变、染色体异位等）正常细胞DNA损伤DNA修复体细胞基因突变原癌基因活化抑癌基因失活凋亡基因失调细胞增生细胞死亡肿瘤细胞DNA损伤DNA修复失败C-rasH基因P21ras产物突变后GGC甘氨酸GTC缬氨酸点突变膀胱癌的癌基因突变镰刀形红细胞贫血（sickle cell anemia）2、癌症的诊断p内窥镜诊断：内窥镜诊断：使用胃镜检查胃中的方法是最具代使用胃镜检查胃中的方法是最具代表性的一种，其优点是一面观察、一面拍照临床上表性的一种，其优点是一面观察、一面拍照临床上应用比较广泛。应用比较广泛。p超声波诊断：超声波诊断：超声波穿可透软的组织，当这种声超声波穿可透软的组织，当这种声波碰到柔软的组织中的硬块，便会反射回来。乳房波碰到柔软的组织中的硬块，便会反射回来。乳房检查时，对乳腺的柔软块发出超声波，会透过柔软检查时，对乳腺的柔软块发出超声波，会透过柔软的块状物从身体的另一侧出去，碰到癌肿等硬细胞的块状物从身体的另一侧出去，碰到癌肿等硬细胞群时，便会反射回来。群时，便会反射回来。p细胞学诊断：一般是配合内窥镜检查一并细胞学诊断：一般是配合内窥镜检查一并进行，对疑似肿瘤部位取出部分细胞作为进行，对疑似肿瘤部位取出部分细胞作为诊断用。最常见的也是很简单的是对子宫诊断用。最常见的也是很简单的是对子宫癌的细胞诊断，这种癌肉眼看得到，使用癌的细胞诊断，这种癌肉眼看得到，使用仪器从有问题的部位采取细胞，对子宫癌仪器从有问题的部位采取细胞，对子宫癌的早期发现率已提高很多。的早期发现率已提高很多。p血液生化诊断：一般只有男性前列腺癌、血液生化诊断：一般只有男性前列腺癌、以及肝癌检查才使用，前者检测血液中的以及肝癌检查才使用，前者检测血液中的酸性酸性磷酸酵素磷酸酵素异常增加，就可诊断为癌；异常增加，就可诊断为癌；后者检测血液中的后者检测血液中的甲胎蛋白。甲胎蛋白。这是一种精这是一种精密度可信度教高的方法。密度可信度教高的方法。p基因诊断：应用分子生物学技术基因诊断：应用分子生物学技术,从从DNA/RNA水平检测分析致病基因的存在水平检测分析致病基因的存在,变变异和表达状态从而对疾病作出诊断的技术。异和表达状态从而对疾病作出诊断的技术。样品抽提PCR扩增分子杂交杂交信号检测DNARNA基因诊断的基本流程cDNASouthern 印迹（印迹（Southern blot)杂交杂交p早期、超早期诊断：是肿瘤治愈的关键早期、超早期诊断：是肿瘤治愈的关键（1 1）蛋白质指纹）蛋白质指纹 通过对蛋白质不同片断的变异情况检测，对肿瘤及其它疾病的检测准确率可以达到90以上，并将疾病发现的时间提前3年至5年，对人体不同类型肿瘤或其他疾病进行预警。早在人体某部位发生癌变前的数年前，人体内的多种蛋白质构成就已经发生改变。但在目前的国内临床肿瘤检测中，大都只采取某一种蛋白质标记物，所以导致检测的阳性率较低。而蛋白质指纹图谱可以针对人体多种蛋白质进行测定，绘制出专属蛋白质的“指纹”图谱，大大提高了癌症诊断的阳性率。比如10个有可能发生卵巢癌的人中，一般只有3个会被目前临床采用的方法检测出来，阳性率为30；而通过蛋白质指纹图谱，这个准确率可达98。（2 2）基因芯片）基因芯片 美国人类基因组研究所（NHGRI），使用DNA微阵列的方法同时观察了6567个基因。在这些基因芯片上，每个基因的活性通过染色深浅来显示。为了确定基因的表达形式，研究者们然后通过一种称为人工神经网络的程序运行了这些颜色深浅数据。这个程序模拟了大脑中神经元的行为，可以通过试验和错误进行自我学习。Meltzer说：“这样就可以获得癌症中发生的完整信息了。”研究者在2001年6月的Nature Medicine上报告说，这个程序在学习了每种癌症的特点之后，正确地鉴定了所有20个试验样品。还象排除健康细胞一样，正确地排除了五个其它类型癌症的样品。3、癌症的基因治疗p抑癌基因的导入和癌基因的反义核酸导入抑癌基因的导入和癌基因的反义核酸导入疗法。疗法。在超过50%的肿瘤中都发现有p53基因的突变。将野生型p53基因转染肿瘤细胞，肿瘤细胞会发生凋亡，在动物体内致瘤能力下降。Clayman等采用腺病毒携带p53基因治疗头颈部肿瘤取得了较好的疗效。在癌基因的反义基因治疗中，目前已经选取的靶基因很广泛，癌基因包括c-src、c-fos、H-ras、K-ras、c-myc等；自分泌的生长因子及其受体基因包括IGF-1、IGF-1受体、EGF、TGF-等。Amini等首先将表达src反义基因的质粒导入v-src过度表达的转化细胞，结果该细胞的致瘤性下降。Laird将带有TGF-反义基因的反转录病毒转染肝癌细胞株，细胞在裸鼠体内的致瘤性下降；Lian将IGF-1反义基因导入C6大鼠胶质瘤细胞，该细胞致瘤性下降。由于在肿瘤的发生发展过程中存在机体免疫系统对肿瘤细胞的免疫耐受状态，而这种状态可能源于肿瘤细胞本身的免疫原性不强（如MHC表达量不足），也可能源于抗原递呈细胞不能提供足够的共刺激信号（如B7）或者机体免疫因子分泌不足等。因此可以通过以下方法纠正机体肿瘤的免疫耐受状态。p免疫基因疗法：免疫基因疗法：（1）MHC抗原MHC抗原与免疫识别和免疫应答有关，只有T细胞识别了抗原呈递细胞上的MHC抗原后，才能识别外来抗原并产生免疫应答。由于肿瘤细胞存在功能性MHC I类抗原和/或共刺激信号表达较少，因而可能逃避免疫系统的监视。可以将一些与免疫识别有关的基因（如HLA、B7等）转染到体外培养的肿瘤细胞，经照射后再植入患者体内；或将表达HLA、B7的病毒载体或质粒DNA与脂质体复合物直接注射到瘤体内，以增强肿瘤细胞对机体免疫系统的免疫原性，激活机体的抗肿瘤免疫活性。（2）制备肿瘤DNA瘤苗许多肿瘤都能表达一些肿瘤特异的抗原，将这些在正常机体内不表达的肿瘤特异抗原的编码基因导入患者体内，通过其在机体内的表达从而可以激发机体对编码抗原的免疫反应。如黑色素瘤相关抗原MAGE、酪氨酸酶、癌基因融合基因产物P210bcl-abl和病毒基因产物HPV-E6、E7及癌胚抗原CEA等，这些肿瘤特异性抗原编码基因可用于制备肿瘤DNA瘤苗。肿瘤DNA瘤苗的转移途径包括重组病毒感染、直接注射等。（3）细胞因子基因转移抗肿瘤免疫效应细胞将细胞因子基因（如IL-2、IL-4、IL-1、INF-、TNF-、G-CSF、GM-CSF等）导入抗肿瘤的免疫效应细胞，如TIL(tumor infiltrating lymphocyte,肿瘤浸润淋巴细胞)、LAK（lymphokine activated killer cell，淋巴因子活化的杀伤细胞）及CTL（cytotoxotity T lymphcyte，细胞毒T淋巴细胞）中，以提高机体免疫系统对肿瘤细胞的识别和反应能力，这实际上是免疫治疗和基因治疗技术的组合，一定程度上克服了细胞因子注射疗法需反复多次、副作用大等缺点，疗效也有所提高。肿瘤免疫细胞因子基因治疗因其简单、有效、安全，已成为肿瘤免疫基因治疗研究的最常用方法。102（4）细胞因子基因转移肿瘤细胞肿瘤细胞经过细胞因子转移后，其MHC抗原分子表达增强，成为免疫原性更强的瘤苗，使多种免疫细胞在肿瘤局部浸润，增强机体对肿瘤的免疫功能。103（5）“自杀基因”疗法将“自杀基因”（suicide gene)导入肿瘤细胞，其能将无毒性前体药物在肿瘤细胞内代谢为毒性产物，进而选择性的杀伤肿瘤细胞。能够编码产生将非活性或无毒性前体药物转化成活性活毒性药物的酶的基因，称“自杀基因”。三：遗传疾病的基因疗法（四）基因治疗面临的挑战基因治疗的发展经历了“乐观与热情失望与怀疑理性与挑战”的过程，这是符合事物发展规律的。目前，基因治疗领域存在的主要问题是有效性和安全性有效性和安全性。1.基因导入系统缺乏靶向性，效率也较低。如以腺病毒为载体的p53基因转移治疗恶性肿瘤的方案中，只能直接将腺病毒注射到肿瘤局部。若静脉注射，病毒颗粒将很快被清除，真正能够到达肿瘤组织的很少，难以达到治疗效果，且增加了副作用。前面提到的第一例逆转录病毒介导ADA 基因转移成功治疗SCID 的病例，因为导入效率较低，前后经历了11 次体外转导和回输。2.目前针对遗传性疾病的基因治疗方案大多采用逆转录病毒载体，其插入或整合到染色体的位置是随机的，有引起插入突变及细胞恶性转化的潜在危险。而理想的基因治疗方案应该是在原位补充、置换或修复致病基因，或者将治疗基因插入到宿主细胞染色体上不致病的安全位置。3.理想的基因治疗应能根据病变的性质和严重程度不同，调控治疗基因在适当的组织器官内和以适当的水平或方式表达。但目前还达不到这一目标，其主要原因是：现有的基因导入载体容量有限，不能包容全基因或完整的调控顺序，同时人们对导入的基因在 体内的转录调控机理的认识有限。不幸的悲剧!基因治疗一人死亡:1999年10月美国宾州大学JM Wilson 在开展腺病毒OTC（鸟氨酸氨甲酰基转移酶）基因治疗肝脏遗传病时,一位亚利桑那州的十八岁的青年 Gelsinger 接受了高剂量治疗后死亡。基因治疗前景?基因治疗是不是一场梦?自2000 年以来，法国巴黎内克尔医院Fischer 教授对17 名患SCID的小孩实施基因疗法，当时疗效很显著，但是在2003 年，其中2名患者出现白血病症状，目前有一个患病小孩已经死亡，现在第三个小孩也出现了白血病症状。因此，美国FDA 已经停止了3 个与Fischer 教授临床试验类似结果的治疗方案，另外还暂时推迟了27 个基因治疗临床试验，直到他们能够确定这种导致癌症的副作用是由于特殊的环境引起的方可继续进行。目前，科学家们把焦点集中在基因治疗的传递系统上，Fischer 教授的临床试验方案用的是逆转录病毒，这种病毒可以非特异性地插入到宿主细胞的基因组