基因治疗的原理演示课件.ppt

基因治疗的原理基因治疗的原理 一、基因治疗的策略一、基因治疗的策略 内容提要内容提要二、基因转移技术二、基因转移技术 三、基因干预三、基因干预一、基因治疗一、基因治疗的策略的策略 （一）基因置换（一）基因置换（gene replacementgene replacement）定义：定义：定义：定义：指将特定的目的基因导入特定细胞，通指将特定的目的基因导入特定细胞，通指将特定的目的基因导入特定细胞，通指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，以导入的正常基因置换基因组内原有过定位重组，以导入的正常基因置换基因组内原有过定位重组，以导入的正常基因置换基因组内原有过定位重组，以导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因。的缺陷基因。的缺陷基因。的缺陷基因。目的目的：将缺陷基因的异常序列进行桥正。：将缺陷基因的异常序列进行桥正。（二）（二）基因添加基因添加 基因添加或称基因增补基因添加或称基因增补（gene augmentationgene augmentation）:通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。基因。类型类型:n在在有有缺缺陷陷基基因因的的细细胞胞中中导导入入相相应应的的正正常常基基因因，而而细细胞胞内内的的缺缺陷陷基基因因并并未未除除去去，通通过过导导入入正正常常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能。基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能。n向向靶靶细细胞胞中中导导入入靶靶细细胞胞本本来来不不表表达达的的基基因因，利利用其表达产物达到治疗疾病的目的。用其表达产物达到治疗疾病的目的。（三）基因干预（三）基因干预l基因干预基因干预（gene interferencegene interference）:采用特定的方式抑制某个基因的表达，或采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。以达到治疗疾病的目的。（四）自杀基因治疗（四）自杀基因治疗自自杀杀基基因因治治疗疗:恶恶性性肿肿瘤瘤基基因因治治疗疗的的主主要方法之一。要方法之一。原原理理:将将“自自杀杀”基基因因导导入入宿宿主主细细胞胞中中，这这种种基基因因编编码码的的酶酶能能使使无无毒毒性性的的药药物物前前体体转转化化为为细细胞胞毒毒性性代代谢谢物物，诱诱导导靶靶细细胞胞产产生生“自自杀杀”效效应应，从从而而达达到到清清除除肿肿瘤瘤细胞的目的。细胞的目的。（五）基因免疫治疗（五）基因免疫治疗 通过将抗癌免疫增强细胞因子或通过将抗癌免疫增强细胞因子或MHCMHC基因基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。免疫反应。二、基因转移二、基因转移技术技术 基因转移基因转移(gene transfer)(gene transfer)技术技术 1.1.病毒介导的基因转移系统。病毒介导的基因转移系统。2.2.非病毒介导的基因转移系统非病毒介导的基因转移系统。1.1.病毒介导的基因转移系统病毒介导的基因转移系统 病毒载体病毒载体介导的基因转移效率较高，介导的基因转移效率较高，因此它也是使用最多的基因治疗载体。因此它也是使用最多的基因治疗载体。据统计，有据统计，有72%72%的临床实验计划和的临床实验计划和71%71%的的病例使用了病毒载体，其中用得最多的病例使用了病毒载体，其中用得最多的是逆转录病毒载体。是逆转录病毒载体。(1)(1)逆转录病毒载体逆转录病毒载体 逆转录病毒载体的特点逆转录病毒载体的特点 逆转录病毒包膜上由逆转录病毒包膜上由envenv编码的糖蛋白，能够被许编码的糖蛋白，能够被许多哺乳动物细胞膜上的特异性受体识别，从而使多哺乳动物细胞膜上的特异性受体识别，从而使逆转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。逆转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。逆转录病毒结构基因逆转录病毒结构基因gaggag、envenv和和polpol的缺失不影响的缺失不影响其他部分的活性。其他部分的活性。前病毒可以高效整合至靶细胞基因组中，有利于前病毒可以高效整合至靶细胞基因组中，有利于外源基因在靶细胞中的永久表达。外源基因在靶细胞中的永久表达。包装好的假病毒颗粒（携带目的基因的重组逆转包装好的假病毒颗粒（携带目的基因的重组逆转录病毒载体）以芽生的方式分泌至辅助细胞培养录病毒载体）以芽生的方式分泌至辅助细胞培养的上清液中，易于分离制备。的上清液中，易于分离制备。逆转录病毒载体的主要缺点逆转录病毒载体的主要缺点 随机整合，有插入突变、激活癌基随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危险；因的潜在危险；逆转录病毒载体的容量较小，只能逆转录病毒载体的容量较小，只能容纳容纳7 kb7 kb以下的外源基因。以下的外源基因。THANK YOUSUCCESS2024/5/8 周三15可编辑 （2 2）腺病毒）腺病毒(adenovirus(adenovirus，AV)AV)载体载体 腺病毒是一种大分子腺病毒是一种大分子(36 kb)(36 kb)双链无包膜双链无包膜DNADNA病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。不整合进入宿主细胞基因组中。腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，但目前腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，但目前尚未发现与肿瘤发生有关联。宿主细胞范围广，可尚未发现与肿瘤发生有关联。宿主细胞范围广，可感染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。感染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。腺病毒载体的优点腺病毒载体的优点1.1.1.1.基因导入效率高，对人类安全；基因导入效率高，对人类安全；基因导入效率高，对人类安全；基因导入效率高，对人类安全；2.2.2.2.宿主范围广；宿主范围广；宿主范围广；宿主范围广；3.3.3.3.基因转导与细胞分裂无关；基因转导与细胞分裂无关；基因转导与细胞分裂无关；基因转导与细胞分裂无关；4.4.4.4.重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注；入或气管内滴注；入或气管内滴注；入或气管内滴注；5.5.5.5.腺病毒载体容量较大，可插入腺病毒载体容量较大，可插入腺病毒载体容量较大，可插入腺病毒载体容量较大，可插入7.5 kb7.5 kb7.5 kb7.5 kb外源基因；外源基因；外源基因；外源基因；腺病毒载体的缺点腺病毒载体的缺点2.2.2.2.宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。3.3.3.3.有两个环节可能产生复制型腺病毒。有两个环节可能产生复制型腺病毒。有两个环节可能产生复制型腺病毒。有两个环节可能产生复制型腺病毒。4.4.4.4.靶向性差。靶向性差。靶向性差。靶向性差。1.1.1.1.不能整合到靶细胞的基因组不能整合到靶细胞的基因组不能整合到靶细胞的基因组不能整合到靶细胞的基因组DNADNADNADNA中。分裂增殖快中。分裂增殖快中。分裂增殖快中。分裂增殖快的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂而丢失的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂而丢失的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂而丢失的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂而丢失的机会增多，表达时间相对较短。的机会增多，表达时间相对较短。的机会增多，表达时间相对较短。的机会增多，表达时间相对较短。2.2.非病毒载体介导的基因转移系统非病毒载体介导的基因转移系统 （1 1）脂质体介导的基因转移技术）脂质体介导的基因转移技术 脂质体介导的基因转移技术使用方便、脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。成本低廉。基本原理基本原理:利用阳离子脂质体单体与利用阳离子脂质体单体与DNADNA混合后，可以自动形成包埋外源混合后，可以自动形成包埋外源DNADNA的的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源细胞内吞作用将外源DNADNA（即目的基因）转（即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。移至细胞内，并进行表达。（2 2）受体介导转移技术）受体介导转移技术 将将DNADNA与与细细胞胞或或组组织织亲亲和和性性的的配配体体偶偶联联，可可使使DNADNA具具有有靶靶向向性性。这这种种偶偶联联通通常常通通过过多多聚聚阳阳离离子子（如如多多聚聚赖赖氨氨酸酸）来来实实现现。多多聚聚阳阳离离子子与与配配体体共共价价连连接接后后，又又通通过过电电荷荷相相互互作作用用与与带带负负电电荷荷的的DNADNA结结合合，将将DNADNA包包围围，只只留留下下配配体体暴暴露露于于表表面面。这这样样形形成成的的复复合合物物可可被被带带有有特特异异性性受受体体的的靶靶细细胞胞吞吞饮饮，从从而将外源而将外源DNADNA导入靶细胞。导入靶细胞。（3 3）基因直接注射技术）基因直接注射技术 不需要进行基因工程的繁琐操作，不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露基因直接将裸露基因DNADNA注入动物肌肉或某些注入动物肌肉或某些器官组织内。器官组织内。三、基因干预三、基因干预基因干预的种类：n n1.1.反义反义RNA(antisense RNA)RNA(antisense RNA)n n2.2.干扰干扰RNA(RNA interference)RNA(RNA interference)（一）反义（一）反义RNARNA 1.1.反义反义RNARNA与基因表达调控与基因表达调控 利用反义利用反义RNARNA对体外培养的细胞进行基因对体外培养的细胞进行基因表达调控，通常采用的方法有两种：表达调控，通常采用的方法有两种：（1 1）体外合成反义）体外合成反义RNARNA，直接作用于培养，直接作用于培养细胞，细胞吸收细胞，细胞吸收RNARNA后，发挥作用。后，发挥作用。（2 2）构建能转录反义）构建能转录反义RNARNA的重组质粒，将的重组质粒，将质粒转入细胞，转录出反义质粒转入细胞，转录出反义RNARNA而发挥作用。而发挥作用。2.2.受体介导反义受体介导反义RNARNA技转移术技转移术 基基 本本 原原 理理：将将 脱脱 唾唾 液液 酸酸 血血 清清 类类 粘粘 蛋蛋 白白（ASGPASGP）与与多多聚聚赖赖氨氨酸酸（PLPL）共共价价连连接接，得得到到ASGP-PLASGP-PL复复合合物物，成成为为运运载载核核酸酸的的工工具具。ASGP-PLASGP-PL反反义义RNARNA复复合合物物可可以以专专一一性性地地被被肝肝细细胞胞表表面面的的ASGPASGP受受体体所所识识别别，并并吞吞噬噬到到肝肝细细胞胞中中，反反义义RNARNA进进入入肝肝细胞后，可被逐渐释放出来发挥作用。细胞后，可被逐渐释放出来发挥作用。借借助助受受体体介介导导DNADNA转转移移方方法法把把DNADNA换换成成反反义义RNARNA，就可以实现受体介导的反义就可以实现受体介导的反义RNARNA的转移。的转移。（二）干扰（二）干扰RNARNA 1.RNA1.RNA干扰现象干扰现象 RNA干扰（干扰（RNA interference，RNAi）是一种由双链）是一种由双链RNA诱发的基因诱发的基因沉默现象。在此过程中，与双链沉默现象。在此过程中，与双链RNA有有同源序列的信使同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，）被降解，从而抑制该基因的表达。从而抑制该基因的表达。2.RNA2.RNA干扰的机制干扰的机制 RNARNARNARNA干扰过程主要有干扰过程主要有干扰过程主要有干扰过程主要有2 2 2 2个步骤：个步骤：个步骤：个步骤：（1 1 1 1）小干扰性）小干扰性）小干扰性）小干扰性RNARNARNARNA（siRNAsiRNAsiRNAsiRNA）（2 2 2 2）siRNAsiRNAsiRNAsiRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为体，称为体，称为体，称为RNARNARNARNA诱导的沉默复合体（诱导的沉默复合体（诱导的沉默复合体（诱导的沉默复合体（RNA-induced RNA-induced RNA-induced RNA-induced silencing complex,RISC)silencing complex,RISC)silencing complex,RISC)silencing complex,RISC)。该复合体可识别与该复合体可识别与该复合体可识别与该复合体可识别与siRNAsiRNAsiRNAsiRNA有同源序列的有同源序列的有同源序列的有同源序列的mRNAmRNAmRNAmRNA，并在特异的，并在特异的，并在特异的，并在特异的位点将该位点将该位点将该位点将该mRNAmRNAmRNAmRNA切断。切断。切断。切断。长双链长双链长双链长双链RNARNARNARNA被细胞内的双链被细胞内的双链被细胞内的双链被细胞内的双链RNARNARNARNA特异性核酸酶特异性核酸酶特异性核酸酶特异性核酸酶DicerDicerDicerDicer切成切成切成切成21-2321-2321-2321-23个碱基对的短双链个碱基对的短双链个碱基对的短双链个碱基对的短双链RNARNARNARNA，称为小干扰性，称为小干扰性，称为小干扰性，称为小干扰性RNARNARNARNA（small small small small interfering RNAinterfering RNAinterfering RNAinterfering RNA，siRNAsiRNAsiRNAsiRNA）。）。）。）。3.RNA3.RNA干扰的应用前景干扰的应用前景 RNARNA干扰研究目前已经在功能基因干扰研究目前已经在功能基因组学研究、微生物学研究、基因治疗和组学研究、微生物学研究、基因治疗和信号转导等广泛领域取得了令人瞩目的信号转导等广泛领域取得了令人瞩目的进展，使其在医学、生物学领域的应用进展，使其在医学、生物学领域的应用有着广阔的前景。有着广阔的前景。谢谢观看THANK YOUSUCCESS2024/5/8 周三30可编辑