单克隆抗体制备.ppt

实验实验研究的目的性研究的目的性 功能、形功能、形态态、数量、数量实验设计实验设计的科学性的科学性 全面、全面、动态动态、鲜鲜明、明、对应对应、对对照照实验实验方法的合理性方法的合理性 确切、先确切、先进进实验实验原理的内涵性原理的内涵性 意意义义、要点、要点实验实验操作的操作的规规范性范性 准准备备、严严格、准确、重复格、准确、重复1.免疫血清和免疫血清和单单克隆抗体的制克隆抗体的制备备2.一、免疫血清的制一、免疫血清的制备备1.原理：原理：机体具有多种机体具有多种B细细胞克隆，胞克隆，将适当的抗原物将适当的抗原物质质注入人注入人或或动动物体内物体内后可被不同的后可被不同的B细细胞克隆同胞克隆同时识别时识别，经过经过一定一定时间时间，受刺激的受刺激的B细细胞克隆胞克隆针对针对抗原表位的多少而抗原表位的多少而产产生相生相应应的特异性抗体，每一抗原表位都能的特异性抗体，每一抗原表位都能诱发诱发相相应应B细细胞克隆胞克隆产产生生单单克隆抗体，此克隆抗体，此获获得的血清即得的血清即为为含多种含多种单单克隆抗体的克隆抗体的混合物，称之混合物，称之为为多克隆抗体免疫血清，多克隆抗体免疫血清，简简称免疫血清。称免疫血清。优质优质免疫血清的免疫血清的产产生，主要取决于抗原的生，主要取决于抗原的纯纯度和免疫度和免疫原性，以及原性，以及动动物的免疫物的免疫应应答能力。此外，尚需考答能力。此外，尚需考虑虑免疫途免疫途径、抗原径、抗原剂剂量、注射次数、量、注射次数、时间间时间间隔和有无佐隔和有无佐剂剂等因素。等因素。3.免疫原免疫原1.1.抗原种抗原种抗原种抗原种类类类类 微生物抗原、微生物抗原、微生物抗原、微生物抗原、组织组织组织组织抗原和免疫球蛋白抗原。抗原和免疫球蛋白抗原。抗原和免疫球蛋白抗原。抗原和免疫球蛋白抗原。2.2.抗原抗原抗原抗原纯纯纯纯度度度度 一般的抗原只要达到一般的抗原只要达到一般的抗原只要达到一般的抗原只要达到亲亲亲亲合合合合层层层层析或析或析或析或SDSSDSPAGEPAGE电电电电 泳泳泳泳纯纯纯纯即可。即可。即可。即可。3.3.抗原用量抗原用量抗原用量抗原用量 在一定范在一定范在一定范在一定范围围围围内与免疫内与免疫内与免疫内与免疫应应应应答答答答强强强强度呈正相关。在度呈正相关。在度呈正相关。在度呈正相关。在应应应应 用完全弗氏佐用完全弗氏佐用完全弗氏佐用完全弗氏佐剂时剂时剂时剂时，蛋白，蛋白，蛋白，蛋白质类质类质类质类抗原抗原抗原抗原剂剂剂剂量以量以量以量以0.50.5 1mg/kg 1mg/kg体重体重体重体重为为为为宜，加宜，加宜，加宜，加强强强强免疫免疫免疫免疫约为约为约为约为基基基基础剂础剂础剂础剂量的量的量的量的 1/2 1/21/31/3。4.4.抗原的抗原的处处理理1）颗颗粒性抗原：粒性抗原：红细红细胞、菌体等制成胞、菌体等制成悬悬液，不需佐液，不需佐 剂剂，直接免疫。菌体数，直接免疫。菌体数11010个个/ml 为为宜。宜。2）可溶性蛋白）可溶性蛋白质质抗原（如人抗原（如人IgG）、病毒抗原、）、病毒抗原、细细菌菌 可溶性抗原可溶性抗原组组分等，可以直接与弗氏完全佐分等，可以直接与弗氏完全佐剂剂 （1：1 V/V）混合、乳化。）混合、乳化。3）半抗原（多糖、多）半抗原（多糖、多肽肽、激素、化学、激素、化学药药品）需与品）需与载载 体偶体偶联联。常用。常用载载体有牛血清白蛋白（体有牛血清白蛋白（BSA）、）、钥钥 孔孔嘁嘁血血蓝蓝素素(KLH)、鸡鸡血清蛋白（血清蛋白（OA）；偶）；偶联剂联剂 有有过过碘酸碘酸钠钠、戊二、戊二醛醛和碳化二和碳化二亚亚胺等。胺等。KLH是最是最 常用的常用的载载体蛋白，碳化二体蛋白，碳化二亚亚胺是最常用的偶胺是最常用的偶联联 剂剂。5.佐佐佐佐 剂剂剂剂1.1.概念概念概念概念 佐佐佐佐剂剂剂剂属非特异性免疫增属非特异性免疫增属非特异性免疫增属非特异性免疫增强强强强剂剂剂剂，与抗原一起注射或，与抗原一起注射或，与抗原一起注射或，与抗原一起注射或预预预预先注入机体先注入机体先注入机体先注入机体时时时时，可增，可增，可增，可增强强强强机体免疫机体免疫机体免疫机体免疫应应应应答或改答或改答或改答或改变变变变免疫免疫免疫免疫应应应应答答答答的的的的类类类类型。型。型。型。2.2.种种种种类类类类 1 1）卡介苗（）卡介苗（）卡介苗（）卡介苗（BCGBCG）、短小棒状杆菌（）、短小棒状杆菌（）、短小棒状杆菌（）、短小棒状杆菌（CPCP）、脂）、脂）、脂）、脂 多糖（多糖（多糖（多糖（LPSLPS）、）、）、）、细细细细胞因子；胞因子；胞因子；胞因子；2 2）氢氢氢氢氧化氧化氧化氧化铝铝铝铝、明、明、明、明矾矾矾矾；3 3）双）双）双）双链链链链多聚肌苷酸：胞苷酸（多聚肌苷酸：胞苷酸（多聚肌苷酸：胞苷酸（多聚肌苷酸：胞苷酸（poly Ipoly I：C C）和双）和双）和双）和双 链链链链多聚腺苷酸：多聚腺苷酸：多聚腺苷酸：多聚腺苷酸：鸟鸟鸟鸟苷酸（苷酸（苷酸（苷酸（poly Apoly A：U U）；）；）；）；4 4）矿矿矿矿物油、脂物油、脂物油、脂物油、脂质质质质体、免疫刺激复合物体、免疫刺激复合物体、免疫刺激复合物体、免疫刺激复合物 （ISCOMsISCOMs）、）、）、）、CPGCPG寡核苷酸。寡核苷酸。寡核苷酸。寡核苷酸。6.3.弗氏完全佐弗氏完全佐剂剂 1）成分：羊毛脂、液体石蜡和）成分：羊毛脂、液体石蜡和灭灭活卡介苗。活卡介苗。2）配方：羊毛脂：液体石蜡）配方：羊毛脂：液体石蜡 为为1：2，也可，也可1：1。灭灭活卡介苗活卡介苗（2 2 20mg/ml20mg/ml）。）。4.弗氏不完全佐弗氏不完全佐剂剂，成分不含卡介苗，其他同弗氏佐，成分不含卡介苗，其他同弗氏佐 剂剂。5.用法：佐用法：佐剂剂与抗原等量混合，充分乳化。与抗原等量混合，充分乳化。7.动动 物物 选选 择择对对对对免疫免疫免疫免疫动动动动物的主要要求有：物的主要要求有：物的主要要求有：物的主要要求有：1.1.应选择应选择应选择应选择与抗原物与抗原物与抗原物与抗原物质亲缘质亲缘质亲缘质亲缘关系关系关系关系远远远远的的的的动动动动物，特物，特物，特物，特别别别别是在制是在制是在制是在制 备备备备抗免疫球蛋白血清抗免疫球蛋白血清抗免疫球蛋白血清抗免疫球蛋白血清时时时时更要注意。抗原物更要注意。抗原物更要注意。抗原物更要注意。抗原物质质质质的来源的来源的来源的来源 生物与被免疫生物与被免疫生物与被免疫生物与被免疫动动动动物物物物亲缘亲缘亲缘亲缘关系越关系越关系越关系越远远远远，免疫，免疫，免疫，免疫应应应应答能力越答能力越答能力越答能力越 强强强强，抗体，抗体，抗体，抗体产产产产生水平越高，抗体生水平越高，抗体生水平越高，抗体生水平越高，抗体亲亲亲亲和力也越和力也越和力也越和力也越强强强强。2.2.动动动动物生理状物生理状物生理状物生理状态态态态正常，正常，正常，正常，发发发发育成熟，体重符合育成熟，体重符合育成熟，体重符合育成熟，体重符合规规规规定。家定。家定。家定。家 兔初始免疫体重通常在兔初始免疫体重通常在兔初始免疫体重通常在兔初始免疫体重通常在2 22.5kg2.5kg。3.3.性性性性别别别别上以雄性成年上以雄性成年上以雄性成年上以雄性成年动动动动物物物物较较较较常用，也可采用雌性非妊常用，也可采用雌性非妊常用，也可采用雌性非妊常用，也可采用雌性非妊 娠娠娠娠动动动动物。不能物。不能物。不能物。不能应应应应用患病或用患病或用患病或用患病或刚刚刚刚刚刚刚刚病愈、有免疫缺陷或病愈、有免疫缺陷或病愈、有免疫缺陷或病愈、有免疫缺陷或 应应应应用免疫抑制用免疫抑制用免疫抑制用免疫抑制剂剂剂剂的的的的动动动动物。物。物。物。8.免疫方法免疫方法免疫方法免疫方法1.1.免疫途径免疫途径免疫途径免疫途径 1 1）注射方法：静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内和）注射方法：静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内和）注射方法：静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内和）注射方法：静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内和 淋巴淋巴淋巴淋巴结结结结等。等。等。等。2 2）免疫方法：小）免疫方法：小）免疫方法：小）免疫方法：小剂剂剂剂量、多点、多途径方法。量、多点、多途径方法。量、多点、多途径方法。量、多点、多途径方法。3 3）颗颗颗颗粒性抗原（粒性抗原（粒性抗原（粒性抗原（细细细细菌菌菌菌悬悬悬悬液、液、液、液、红细红细红细红细胞胞胞胞悬悬悬悬液）采用小液）采用小液）采用小液）采用小 鼠腹腔注射。鼠腹腔注射。鼠腹腔注射。鼠腹腔注射。4 4）可溶性抗原（如）可溶性抗原（如）可溶性抗原（如）可溶性抗原（如IgGIgG）采用弗氏完全佐）采用弗氏完全佐）采用弗氏完全佐）采用弗氏完全佐剂剂剂剂的乳的乳的乳的乳 剂剂剂剂（油包水型），家兔背部多点皮下注射法。（油包水型），家兔背部多点皮下注射法。（油包水型），家兔背部多点皮下注射法。（油包水型），家兔背部多点皮下注射法。9.2.可溶性抗原免疫可溶性抗原免疫 1）方法：基）方法：基础础免疫（初次免疫）后三周左右，免疫（初次免疫）后三周左右，进进行行 加加强强免疫，以后每隔免疫，以后每隔2周加周加强强免疫一次。免疫一次。2）加）加强强免疫次数取决于免疫次数取决于试试血血结结果。家兔耳果。家兔耳缘缘静脉、静脉、小鼠眶静脉少量采血，分离血清，免疫双小鼠眶静脉少量采血，分离血清，免疫双扩实验扩实验 测测定血清效价定血清效价1：32或或ELISA法法测测定抗体效价定抗体效价 1：10 000，表明抗体效价，表明抗体效价较较高，可采兔高，可采兔颈动颈动脉脉 或心或心脏脏全部血液，分离血清。全部血液，分离血清。4）如抗体效价）如抗体效价较较低，低，继续继续加加强强免疫，一般需免疫，一般需45 次。若仍不能达到抗体效价要求，次。若仍不能达到抗体效价要求，应应考考虑虑重新免重新免 疫。疫。3.颗颗粒性抗原免疫粒性抗原免疫 第一周注射第一周注射2次，随后每周加次，随后每周加强强免疫免疫1次，次，45天天 试试血。血。10.3.操作程序操作程序 1）健康雄性家兔体重）健康雄性家兔体重2.5 3 kg，背部皮下多点注射。，背部皮下多点注射。2）基）基础础免疫：抗原完全佐免疫：抗原完全佐剂剂(抗原抗原剂剂量量4mg/只只)2ml (1:1V/V)吸入两支注射器内，三通吸入两支注射器内，三通连连接，接，反复推拉混合至乳化反复推拉混合至乳化悬悬液。液。3）加）加强强免疫：抗原不完全佐免疫：抗原不完全佐剂剂(抗原抗原剂剂量量2.5mg/只只)，间间隔隔710天加天加强强一次。一次。约约23次。次。4）试试 血：末次注射后第血：末次注射后第7天取少量静脉血，免疫双天取少量静脉血，免疫双 扩试验扩试验血清血清检测检测，抗血清效价，抗血清效价 1：32（或（或 ELISA法法检测检测抗体效价抗体效价1：10，000）时颈时颈 动动脉放血，分离血清，分装，保存。脉放血，分离血清，分装，保存。11.二二 单单克隆抗体的制克隆抗体的制备备 1975年年 Kohler和和Milstein发现发现将小鼠骨髓瘤将小鼠骨髓瘤细细胞与胞与和和绵绵羊羊红细红细胞免疫的小鼠脾胞免疫的小鼠脾细细胞胞进进行融合，形成的行融合，形成的杂杂交瘤交瘤细细胞既可胞既可产产生抗体，又可无性繁殖，从而生抗体，又可无性繁殖，从而创创立了立了单单克隆抗体克隆抗体杂杂交瘤技交瘤技术术，这项这项技技术术上的突破使血清学上的突破使血清学的研究的研究进进入了一个高度准确的新入了一个高度准确的新纪纪元。元。12.1.1.原理原理原理原理 根据致敏的根据致敏的根据致敏的根据致敏的单单单单一一一一B B细细细细胞克隆具有分泌特异性抗体和胞克隆具有分泌特异性抗体和胞克隆具有分泌特异性抗体和胞克隆具有分泌特异性抗体和骨髓瘤骨髓瘤骨髓瘤骨髓瘤细细细细胞在体外胞在体外胞在体外胞在体外长长长长期增殖的特性，采用期增殖的特性，采用期增殖的特性，采用期增殖的特性，采用细细细细胞融合技胞融合技胞融合技胞融合技术术术术在体外可将上述两种在体外可将上述两种在体外可将上述两种在体外可将上述两种细细细细胞融合形成胞融合形成胞融合形成胞融合形成杂杂杂杂交瘤交瘤交瘤交瘤细细细细胞。胞。胞。胞。杂杂杂杂交瘤交瘤交瘤交瘤细细细细胞因具胞因具胞因具胞因具备备备备了了了了B B细细细细胞和骨髓瘤胞和骨髓瘤胞和骨髓瘤胞和骨髓瘤细细细细胞的双重特性，即可分胞的双重特性，即可分胞的双重特性，即可分胞的双重特性，即可分泌抗体，又能在泌抗体，又能在泌抗体，又能在泌抗体，又能在HATHAT培养基中培养基中培养基中培养基中长长长长期存活。因此，可通期存活。因此，可通期存活。因此，可通期存活。因此，可通过过过过HATHAT选择选择选择选择性培养，性培养，性培养，性培养，筛选筛选筛选筛选出克隆化目的出克隆化目的出克隆化目的出克隆化目的杂杂杂杂交瘤交瘤交瘤交瘤细细细细胞株，再胞株，再胞株，再胞株，再利用利用利用利用杂杂杂杂交瘤交瘤交瘤交瘤细细细细胞培养上清或胞培养上清或胞培养上清或胞培养上清或杂杂杂杂交瘤交瘤交瘤交瘤细细细细胞接种小鼠胞接种小鼠胞接种小鼠胞接种小鼠产产产产生的生的生的生的腹水，腹水，腹水，腹水，获获获获取大量的来源于取大量的来源于取大量的来源于取大量的来源于杂杂杂杂交瘤交瘤交瘤交瘤细细细细胞分泌的胞分泌的胞分泌的胞分泌的单单单单克隆抗体克隆抗体克隆抗体克隆抗体（monoclonal antibody,mAbmonoclonal antibody,mAb）。）。）。）。13.2.试剂试剂与器材与器材（1）细细胞融合胞融合剂剂：聚乙二醇（：聚乙二醇（PEG）（2）0.2mol/L L-谷氨谷氨酰酰胺胺贮贮存液存液（3）200 双抗（青、双抗（青、链链霉素）溶液霉素）溶液（4）RPMI-1640培养液培养液（5）15%胎牛血清胎牛血清RPMI-1640培养液培养液（6）100 氨基蝶呤（氨基蝶呤（A）贮贮存液存液（7）100 次黄次黄嘌嘌呤和胸腺呤和胸腺嘧啶嘧啶核苷核苷贮贮存液存液（8）1 HAT培养液培养液（9）1 HT培养液培养液（10）100 8-杂杂氮氮鸟鸟嘌嘌呤呤贮贮存液存液14.（11）细细胞胞冻冻存液：存液：90ml含含30%FCS的的RPMI-1640培养培养 液液+10ml DMSO（12）0.2M pH 7.4 磷酸磷酸盐缓盐缓冲液冲液（13）主要）主要仪仪器器设备设备：CO2培养箱、超培养箱、超净净工作台、倒置工作台、倒置 显显微微镜镜、精密天平、低温和普通冰箱、液氮罐、精密天平、低温和普通冰箱、液氮罐、离心机、高离心机、高压灭压灭菌器、烤箱、水浴菌器、烤箱、水浴锅锅、除菌、除菌滤滤 器、器、酶酶联联免疫免疫测测定定仪仪等。等。（14）常）常规实验规实验器材：血器材：血细细胞胞记记数板、各种吸管、离数板、各种吸管、离心心 管、管、细细胞培养瓶、培养皿、胞培养瓶、培养皿、24孔和孔和96孔培养板、孔培养板、细细胞胞冻冻存管、注射器、微量移液器等。存管、注射器、微量移液器等。（15）抗体）抗体纯纯化器材与化器材与试剂试剂。（16）小鼠）小鼠实验实验器材：手器材：手术术剪刀、剪刀、镊镊子等解剖器材。子等解剖器材。（17）骨髓瘤）骨髓瘤细细胞：小鼠骨髓瘤胞：小鼠骨髓瘤细细胞系胞系SP2/0或或NS-1。15.3.实验实验流程流程（1）实验动实验动物免疫：物免疫：BALB/c小鼠，雌性，小鼠，雌性，68W。常常规规免疫方案：免疫方案：0、15、30天，天，72 h后制后制备备脾脾细细 胞胞悬悬液。液。基基础础免疫：免疫：10100 g抗原抗原(可溶性抗原可溶性抗原)完全佐完全佐剂剂 0.2ml(1:1V/V)，背部皮下多点注射。，背部皮下多点注射。加加强强免疫：同量抗原不完全佐免疫：同量抗原不完全佐剂剂，间间隔隔710天一天一 次。次。约约23次，皮下或腹腔注射。次，皮下或腹腔注射。试试 血：取静脉血，血：取静脉血，ELISA法法检测检测血清中抗体滴度，血清中抗体滴度，当效价达到当效价达到 1：400以上以上时时，进进行加行加强强免疫。免疫。弱免疫原免疫方案：弱免疫原免疫方案：0天、天、30天、天、45天、天、60天、天、75天。天。16.（2）免疫）免疫动动物脾物脾细细胞胞悬悬液的制液的制备备：将末次免疫后将末次免疫后3天天BALB/c小鼠小鼠处处死，消毒，无菌死，消毒，无菌取出脾取出脾脏脏，置入无菌，置入无菌PBS或培养液中。在或培养液中。在100目的目的钢钢网网上研磨脾上研磨脾脏脏。收集。收集细细胞于胞于50ml离心管中，离心管中，1500rpm离心离心5分，去上清。加入分，去上清。加入10ml PBS用吸管用吸管轻轻微混匀，微混匀，1500rpm离心离心5分，去上清，用分，去上清，用10ml RPMI培养液培养液悬悬浮。浮。细细胞胞计计数（数（细细胞数胞数/ml=N/4 104 稀稀释释倍数）倍数）用用1640培养液培养液调调整整细细胞胞浓浓度至度至1 108/ml 17.（3 3）饲饲养养细细胞制胞制备备 在在组织组织培养中，培养中，单单个或少数分散的个或少数分散的细细胞不易生胞不易生长长繁繁殖，若加入其他活殖，若加入其他活细细胞胞则则可促可促进这进这些些细细胞生胞生长长繁殖，所繁殖，所加入的加入的细细胞称胞称饲饲养养细细胞。常用的是小鼠腹腔巨噬胞。常用的是小鼠腹腔巨噬细细胞胞。将正常将正常BALB/cBALB/c小鼠腹部消毒后，注射小鼠腹部消毒后，注射预预冷的无血清冷的无血清培养液培养液5ml5ml，轻轻揉腹部数次，于腹部左下揉腹部数次，于腹部左下处处剪开腹膜，剪开腹膜，吸取吸取细细胞胞悬悬液，反复液，反复2 23 3次，用培养液离心洗次，用培养液离心洗涤涤2 2次。次。用用15%FCS-RPMI-164015%FCS-RPMI-1640调细调细胞胞浓浓度度为为2 2 10105 5/ml/ml，将，将细细胞胞接种于接种于9696孔培养板，孔培养板，100100 l/l/孔。孔。18.（4 4）骨髓瘤）骨髓瘤细细胞的准胞的准备备 复复苏苏骨髓瘤骨髓瘤细细胞用胞用1010FCS-RPMI-1640FCS-RPMI-1640培养液培养培养液培养1 1周，周，2 23 3天天换换液一次，依液一次，依细细胞生胞生长长情况情况3 34 4天天传传代一代一次，适宜密度次，适宜密度3103105 5/ml/ml。融合之前。融合之前3 3天，每天天，每天换换一半一半培养液，使培养液，使细细胞保持在胞保持在对对数生数生长长期。取期。取对对数生数生长长骨髓骨髓瘤瘤细细胞离心，用无血清培养液洗胞离心，用无血清培养液洗2 2次，次，调细调细胞胞浓浓度度为为12 107/ml备备用。用。19.（5 5 5 5）细细细细胞融合胞融合胞融合胞融合1 1 1 1）将骨髓瘤）将骨髓瘤）将骨髓瘤）将骨髓瘤细细细细胞与脾胞与脾胞与脾胞与脾脏细脏细脏细脏细胞按胞按胞按胞按1 1 1 1：10101010或或或或1 1 1 1：5 5 5 5的比例混的比例混的比例混的比例混 合，在合，在合，在合，在50ml50ml50ml50ml离心管中用无血清培养液洗离心管中用无血清培养液洗离心管中用无血清培养液洗离心管中用无血清培养液洗1 1 1 1次，离心次，离心次，离心次，离心 弃上清；弃上清；弃上清；弃上清；2 2 2 2）1min1min1min1min内加入内加入内加入内加入37373737预预预预温的温的温的温的1ml 501ml 501ml 501ml 50PEGPEGPEGPEG溶液，溶液，溶液，溶液，边边边边加加加加边边边边 摇摇摇摇37373737水浴水浴水浴水浴1min1min1min1min；3 3 3 3）加）加）加）加37373737预预预预温的不完全培养液以温的不完全培养液以温的不完全培养液以温的不完全培养液以终终终终止止止止PEGPEGPEGPEG作用，每隔作用，每隔作用，每隔作用，每隔 2min 2min 2min 2min分分分分别别别别加入加入加入加入1ml1ml1ml1ml、2ml2ml2ml2ml、3ml3ml3ml3ml、4ml4ml4ml4ml、5ml5ml5ml5ml和和和和6ml6ml6ml6ml；4 4 4 4）离心，弃上清，用含）离心，弃上清，用含）离心，弃上清，用含）离心，弃上清，用含20202020小牛血清小牛血清小牛血清小牛血清HATHATHATHAT选择选择选择选择培养液培养液培养液培养液 重重重重悬悬悬悬；5 5 5 5）将上述）将上述）将上述）将上述细细细细胞加入已有胞加入已有胞加入已有胞加入已有饲饲饲饲养养养养细细细细胞的胞的胞的胞的96969696孔培养板内，孔培养板内，孔培养板内，孔培养板内，每孔每孔每孔每孔100100100100 l l l l，放入放入放入放入37 537 537 537 5COCOCOCO2 2 2 2培养箱培养。培养箱培养。培养箱培养。培养箱培养。20.（6）融合）融合细细胞胞观观察、察、换换液及液及杂杂交瘤抗体交瘤抗体检测检测 细细胞培养胞培养3天后，使用天后，使用HAT培养液培养液换换液；液；3天后，再天后，再次使用次使用HAT培养液培养液换换液。液。当当细细胞克隆集落大于胞克隆集落大于3mm时时，利用，利用间间接接ELISA法法筛筛选选分泌分泌单单克隆抗体的阳性克隆抗体的阳性杂杂交瘤交瘤细细胞克隆。胞克隆。21.（7）杂杂交瘤交瘤细细胞克隆化胞克隆化 将分泌将分泌单单克隆抗体阳性的克隆抗体阳性的杂杂交瘤交瘤细细胞克隆按有限稀胞克隆按有限稀释释法稀法稀释细释细胞（用胞（用HAT培养液稀培养液稀释细释细胞），于胞），于96孔培孔培养板中加入养板中加入0.1ml/孔，培养孔，培养2周，利用周，利用间间接接ELISA法挑法挑选单选单个阳性个阳性杂杂交瘤交瘤细细胞克隆孔并再次胞克隆孔并再次进进行行亚亚克隆，直至克隆，直至亚亚克隆克隆时时全部克隆孔全部克隆孔细细胞培养上清中抗体胞培养上清中抗体检检出阳性率出阳性率为为100%为为止。止。22.（8）杂杂交瘤交瘤细细胞胞冻冻存与复存与复苏苏 将阳性将阳性细细胞克隆在培养板或培养瓶中胞克隆在培养板或培养瓶中扩扩大培养，大培养，收集收集细细胞，离心胞，离心1000转转、5分，弃上清，加入分，弃上清，加入细细胞胞冻冻存存液，移至液，移至冻冻存管，存管，-70冰箱冰箱过过夜，然后液氮夜，然后液氮长长期保存。期保存。将将冻冻存管从液氮中取出，立即放入存管从液氮中取出，立即放入37水浴中，水浴中，使之迅速融化。用培养液洗使之迅速融化。用培养液洗涤涤1次后，加入培养液次后，加入培养液继续继续培养。培养。23.（9）单单克隆抗体的大量制克隆抗体的大量制备备 BALB/c雌性小鼠接种雌性小鼠接种杂杂交瘤交瘤细细胞前胞前12周，腹腔注周，腹腔注射降植射降植烷预处烷预处理。用无血清培养液洗理。用无血清培养液洗涤杂涤杂交瘤交瘤细细胞胞23次，次，调细调细胞胞浓浓度度12 106/ml，每只小鼠腹腔注射，每只小鼠腹腔注射0.51ml细细胞胞悬悬液。待小鼠腹部明液。待小鼠腹部明显显膨大膨大时时，收集腹水，离心，收集，收集腹水，离心，收集上清，分装，上清，分装，-80保存。保存。24.（10）单单克隆抗体克隆抗体纯纯化化盐盐析法析法 腹水腹水10ml等量生理等量生理盐盐水混匀，在水混匀，在电电磁磁搅搅拌下逐拌下逐滴滴缓缓慢加入慢加入饱饱和硫酸胺和硫酸胺20ml，4放置放置0.5h以上或以上或过过夜。夜。离心（离心（3000rpm）30min，弃上清。沉淀加生理，弃上清。沉淀加生理盐盐水水20ml溶解后，再次加入溶解后，再次加入饱饱和硫酸胺和硫酸胺10 ml，4放置放置0.5h或或过过夜。离心（夜。离心（3000rpm）30min，弃上清。沉淀加尽，弃上清。沉淀加尽量少生理量少生理盐盐水溶解，装入透析袋中，用流水溶解，装入透析袋中，用流动动自来水透析自来水透析40min，再用生理，再用生理盐盐水透析水透析24h，中，中间换间换液液34次，次，检测检测无无NH4离子存在即可。离子存在即可。-20备备用。用。25.凝胶柱凝胶柱层层析析 实验实验原理：原理：凝胶本身是多孔的分子凝胶本身是多孔的分子筛筛，在交，在交联剂联剂作用下形成作用下形成三三维维空空间间网状网状结结构，蛋白构，蛋白质质溶液流溶液流经经凝胶柱凝胶柱时时，根据，根据蛋白蛋白质质分子量的大小不同，由大到小洗脱而分子量的大小不同，由大到小洗脱而进进行分离。行分离。（大分子蛋白（大分子蛋白质质不能不能进进入凝胶粒内部，在胶粒入凝胶粒内部，在胶粒间间隙随隙随洗脱液最先流出。而小分子蛋白洗脱液最先流出。而小分子蛋白质进质进入胶粒内部洗脱入胶粒内部洗脱较较慢。）慢。）关关键键点：点：1.装柱切忌有气泡和断装柱切忌有气泡和断层层，有断，有断层层要重装柱；要重装柱；2.加加样时缓样时缓冲液面恰好在冲液面恰好在滤纸滤纸片上，及片上，及时时加加样样避免柱避免柱 干涸，干涸凝胶不能干涸，干涸凝胶不能继续继续使用；使用；3.因操作因操作时间长时间长，宜在，宜在4操作，防止影响免疫球蛋白操作，防止影响免疫球蛋白 活性。活性。26.（1111）单单克隆抗体免疫学性克隆抗体免疫学性质检质检定定 1 1）单单克隆抗体特异性克隆抗体特异性测测定；定；2 2）单单克隆抗体克隆抗体亚类测亚类测定；定；3 3）单单克隆抗体效价克隆抗体效价测测定；定；4 4）亲亲和力和力测测定；定；5 5）识别识别抗原表位的抗原表位的测测定。定。27.28.4.单单克隆抗体制克隆抗体制备备的几的几处处要点：要点：1）相）相对对分子量分子量为为4000的的PEG融合效率最高。融合效率最高。2）免疫原性）免疫原性较较强强的抗原可不用佐的抗原可不用佐剂剂，但一般可溶性蛋白，但一般可溶性蛋白 抗原免疫抗原免疫时时需要佐需要佐剂剂，并且乳化要充分。一般多采用，并且乳化要充分。一般多采用 背部多点注射法免疫小鼠背部多点注射法免疫小鼠35只。只。3）选选用高用高质质量血清，量血清，细细胞融合胞融合时时可不用可不用饲饲养养细细胞，但胞，但亚亚 克隆克隆时应时应加入加入饲饲养养细细胞。胞。29.4）为为防止骨髓瘤防止骨髓瘤细细胞胞发发生次黄生次黄嘌嘌呤呤鸟鸟嘌嘌呤磷酸核糖呤磷酸核糖转转 化化酶酶的逆的逆转转，应应定期用定期用8-杂杂氮氮鸟鸟嘌嘌呤呤处处理骨髓瘤理骨髓瘤细细 胞。胞。5）应选应选用用对对数生数生长长期的骨髓瘤期的骨髓瘤细细胞胞进进行融合。胎牛血行融合。胎牛血 清的清的质质量直接影响量直接影响细细胞融合，胞融合，应选应选用高用高质质量的血量的血 清。清。6）在克隆化）在克隆化过过程中，程中，应应逐逐渐渐用普通的用普通的RPMI-1640培养培养 液以液以1/2的速度替代的速度替代HAT培养液；用生培养液；用生长长良好的阳良好的阳 性性杂杂交瘤交瘤细细胞胞进进行行扩扩大培养。大培养。7）通）通过过有限化稀有限化稀释释，使每孔含，使每孔含0.51个个杂杂交瘤交瘤细细胞，胞，这样这样有利于挑有利于挑选单选单一的一的细细胞克隆。胞克隆。30.