化痰祛湿方对肥胖型多囊卵巢综合征大鼠的改善作用及对TGF-β_CTGF通路的影响.pdf

【实验研究】化痰祛湿方对肥胖型多囊卵巢综合征大鼠的改善作用及对 TGF-/CTGF 通路的影响岳美宏1,姜大成1,雷钧涛2(1.长春中医药大学药学院,长春 130117;2.吉林医药学院药学院,吉林吉林 132013)摘要:目的 探究化痰祛湿方对肥胖型多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)大鼠的改善作用及对卵巢组织转化生长因子-(transforming growth factor-,TGF)-/结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)通路的影响。方法选取 45 只 SD 雌性大鼠,其中随机取 8 只为对照组,其余大鼠给予来曲唑加高脂乳剂建立肥胖型 PCOS 模型。32 只大鼠建模成功并随机分为 4 组,模型组,化痰祛湿方高、低剂量组及阳性组,每组各 8 只。低、高剂量组分别给予 16.65 g/kg、83.25 g/kg 化痰祛湿汤,阳性组给予二甲双胍0.3 g/kg。21 d 后检测各组大鼠体质量,血清黄体生成素(luteinizing hormone,LH)、促卵泡生成素(follicle-stimulating hormone,FSH)、睾酮(testosterone,T)、雌二醇(estradiol,E2)水平,卵巢组织病理学变化及 TGF-/CTGF 通路 mRNA 及蛋白表达情况。结果 与对照组比较,模型组大鼠血清 LH、T 水平上升,FSH、E2 水平下降(P0.05);卵巢组织 TGF-、CTGF mRNA与蛋白表达均上调(P0.05);卵巢组织可见闭锁卵泡数增加,颗粒细胞层减少。与模型组比较,化痰祛湿方低、高剂量组及阳性组大鼠上述指标均有明显改善(P0.05),且高剂量组与阳性组的改善效果优于低剂量组大鼠(P0.05),两组大鼠卵巢内可见成熟卵泡。结论 化痰祛湿方能够改善肥胖型多囊卵巢综合征,其作用机制可能与 TGF-/CTGF 信号通路有关。关键词:化痰祛湿方;肥胖;多囊卵巢综合征;转化生长因子-;结缔组织生长因子 中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1006-3250(2023)08-1279-05 基 金 项 目:吉 林 省 科 技 发 展 计 划 重 点 科 技 攻 关 项 目(20180201004YY)作者简介:岳美宏(1996-),女,硕士研究生,从事中药品质鉴定、质量标准及其开发利用的研究。通讯作者:雷钧涛(1971-),男,教授,从事中药及其开发的研究,E-mail:qunjixin8 。Effect of Huatan Qushi Recipe on TGF-/CTGF of Ovarian Tissue in Obese Polycystic Ovary Syndrome RatsYUE Meihong1,JIANG Dacheng 1,LEI Juntao2(1.College of Medicine,Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130117,China;2.School of Pharmacy,Jilin Medical University,Jilin 132013,China)Abstract:Objective To explore the improvement effect of Huatan Qushi recipe on obese polycystic ovary syndrome(PCOS)rats,and the effect of connective tissue growth factor(CTGF)pathway on the transforming growth factor(TGF)-/CTGF pathway.Methods Forty-five SD female rats were selected,of which 8 were randomly selected as the control group,and the remaining rats were given letrozole plus high-fat emulsion to establish an obese PCOS model.Thirty-two rats were successfully modeled and randomly divided into 4 groups,model group,Huatan Qushi recipe high,low dose groups and positive group,with 8 rats in each group.The low-dose and high-dose groups were given 16.65 and 83.25 g/kg Huatan Qushi recipe,respectively,and the positive group was given metformin 0.3 g/kg after 21 days,the body weight,serum hormone levels Luteinizing hormone(LH),follicle-stimulating hormone(FSH),testosterone(T),estradiol(E2)levels,ovarian histopathological changes and TGF-/CTGF pathway mRNA and protein expressions were detected in each group.Results Compared with the control group,the levels of serum LH and T in the model group increased,while the levels of FSH and E2 decreased(P0.05).The mRNA and protein expressions of TGF-and CTGF in ovarian tissue were up-regulated(P0.05).The number of atretic follicles increased and the granulosa cell layer decreased in ovarian tissue.Compared with the model group,the above indicators in the low-dose,high-dose and positive groups of Huatan Qushi recipe were significantly improved(P0.05).And the improvement effect of the high-dose group and the positive group was better than that of the low-dose group(P 0.05),and mature follicles were found in the ovaries of the two groups.Conclusion Huatan Qushi recipe can improve obese polycystic ovary syndrome,its mechanism of action may be related to the TGF-/CTGF signaling pathway.Key words:Huatan Qushi recipe;Obesity;Polycystic ovary syndrome;Transforming growth factor-;Connective tissue growth factor多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是常见的内分泌疾病,临床表现为月经不调,脱发及不孕等1。PCOS 的发病机制至今尚未明确,目前认为激素水平失调,胰岛素抵抗以及卵巢间质纤维化均与 PCOS 的发生密切相关2。西医主要以药物或手术为主,对于改善 PCOS 患者激素水平97212023 年 8 月第 29 卷第 8 期Aug 2023 Vol.29.No.8 中国中医基础医学杂志Journal of Basic Chinese Medicine等临床症状效果显著,但后期复发率较高,因此本研究考虑中药干预3。中医认为,痰湿蕴结是肥胖型PCOS 的重要病理特征,应以祛湿化痰为立法原则,化痰祛湿汤出自证治宝鉴卷十二,具有改善痰湿体质的功效,但作用机制尚不明确4-5。卵巢间质纤维化是导致 PCOS 的重要原因,而转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)水平与卵巢间质纤维化程度有关6-7。故本研究选用化痰祛湿方治疗肥胖型 PCOS,观察化痰祛湿方对肥胖型 PCOS 大鼠卵巢组织 TGF-、CTGF 的影响,以期为 PCOS 的治疗提供新的研究方向。1 材料与方法1.1 动物SPF 级、SD 雌性大鼠 45 只,体质量 185225 g,平均(20520)g,购于北京百奥赛图基因生物技术有限公司,实验动物许可证为SCXK(京)2020-0007,本研究已通过本院伦理委员会批准,伦理批准文号:2020-0175。1.2 药物二甲双胍片(国药准字 H20023371,中美上海施贵宝制药有限公司,规格:0.5 mg);来曲唑(国药准字 H19991001,江苏恒瑞医药股份有限公司,规格:2.5 mg)。化痰祛湿方组方:薏苡仁 30 g,泽泻 30 g,茯苓10 g,白术 15 g,半夏 10 g,藿香 10 g,猪苓 10 g,赤芍25 g,天竺黄 12 g,石菖蒲 12 g,蒲黄 12 g,陈皮12 g8。所有药材洗净后浸泡 20 min,并加入水没过药材,煮沸后文火浓缩至 50 mL,并根据配方将生药浓度调整为为 5 g/mL,作为储存液,使用进行稀释,化痰祛湿方所用药物均由本研究中心于海口市张仲景大药房集中采购。1.3 主要试剂及仪器戊巴比妥钠(CAS 号:57-33-0),上海哈灵生物科技有限公司;中性甲醛(CAS 号:50-00-0),北京华科盛精细化工产品贸易有限公司;苏木精-伊红(hematoxylin eosin,HE)染 色 试 剂 盒(货 号:YT8310),北京伊塔生物科技有限公司;RNA 提取试剂盒(货号:FT30506yy),上海梵态生物科技有限公司;实 时 荧 光 定 量 聚 合 酶 链 反 应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)试剂盒(货号:qPCR001),北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司;TGF-单克隆抗体(货号:IBIO-17268R)及山羊抗兔二抗(货号:IBIO-18015R),江西艾博因生物科 技 有 限 公 司;CTGF 单 克 隆 抗 体(货 号:A-6216-100)及山羊抗兔二抗(货号:A-6233-100),美国 Epigentek 公司;SIGMA/3-18KS 型台式高速冷冻离心机,北京博劢行仪器有限公司;BS-350 型全自动生化分析仪,深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司;UV-9000 型紫外分光光度计,上海添时科学仪器有限公司;BT-2 型电泳仪,俄罗斯 Service 公司。1.4 大鼠模型建立选用 45 只动情周期正常的雌性大鼠,于 22,湿度 50%,通风,洁净度一万级的环境下进行适应性饲养,所有大鼠均记录初始体质量,随机选取 8 只为对照组,进行基础饲料喂养,其余大鼠建立肥胖型PCOS 模型。除对照组外,其余组给予高脂混悬液联合来曲唑(letrozole,LE)进行诱导,每天给予高脂混悬液 15 mg/kg,同时给予 LE 1 mg/kg,连续给药28 d,给药 18 d 后,每日进行阴道脱落细胞涂片,第28 天记录大鼠体质量。大鼠动情周期紊乱,同时体重增长率高于对照组即判定为肥胖型 PCOS 大鼠模型建立成功9。1.5 分组及药物干预建模过程中 5 只大鼠建模失败,其余大鼠随机分为模型组,化痰祛湿方高、低剂量组及阳性组 4组,每组各 8 只。建模成功后,根据人与大鼠的体重及给药剂量换算公式,阳性组给予 0.3 g/kg 二甲双胍,低、高剂量组分别给予 16.65 g/kg、83.25 g/kg 化痰祛湿汤,对照组、模型组给予等量的氯化钠溶液,均灌胃给药,1 次/d,连续给药 21 d。1.6 取材最后一次给药后,禁食 12 h,对大鼠进行体质量称重并记录,采用 2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,采集大鼠股动脉血 5 mL,室 温 放 置 1 h,离 心(2000 r/min,10 min,离心半径 12 cm)分离上层血清,于-80 环境下冻备用。血液采集完成后迅速将大鼠处死,并于无菌环境下取出右侧卵巢组织,并将周围血管及脂肪组织分离,每组四只置于 4%多聚甲醛中固定处理,用于 HE 染色,另外四只迅速置于液氮 10 min 后,于-80 环境下冷冻保存,用于RT-qPCR 及 Western Blot 检测。1.7 测量指标1.7.1 大鼠血清激素水平取 5 mL 上层血清,室温解冻,采用放射免疫法检测血清黄体生成素(luteinizing hormone,LH)、促卵泡生成素(follicle-stimulating hormone,FSH)、睾酮(testosterone,T)、雌二醇(estradiol,E2)水平,严格按照相应试剂盒说明书进行操作10。1.7.2大鼠卵巢组织病理检测取 4%中性甲醛固定的卵巢组织样本,脱水,透明,浸蜡,包埋,制备成 4 m 切片,加入染液进行 HE 染色,将切片置于光镜下观察卵巢组织病理学变化11。1.7.3RT-qPCR 检测大鼠卵巢组织 TGF-、CTGF mRNA 表达情况 取部分液氮保存的卵巢组织,根据 TRIzol 试剂盒说明书提取卵巢组织总RNA,经逆转录得到 cRNA,根据 RT-qPCR 试剂盒检0821中国中医基础医学杂志Journal of Basic Chinese Medicine 2023 年 8 月第 29 卷第 8 期Aug 2023 Vol.29.No.8测卵巢组织 TGF-、CTGF mRNA 表达。RT-qPCR反应体系:SYBR 10 mL,上游引物 0.4 L、引物0.4 L,cDNA 模板 2 L,H2O 加至 20 L;反应条件:先 95 作用 2 min;变性 95 10 s,退火 58 15 s,延伸72 10 s,循环40 次12。GAPDH 为内参基因,2-CT为目的基因相对定量,引物序列见表 1。表 1 各基因 PCR 引物序列基因引物序列引物长度GAPDHForward:5-TGGATTTGGACGCATTGGTC-320 bpReverse:5-TTTGCACTGGTACGTGTTGA-3TGF-Forward:5-TGAGTGGCTGTCTTTTGACG-320 bpReverse:5-TGGGACTGATCCVATTGATT-3CTGFForward:5-GGGCCTCTTCTGCGATTC-318 bpReverse:5-ATCCAGGCAAGTCAGGTA-31.7.4Western Blot 注检测大鼠卵巢 TGF-、CTGF 蛋白表达情况取液氮保存的卵巢组织,加入适量缓冲液研磨成匀浆,加入裂解液对卵巢组织进行裂解处理,低温环境下离心 5 min(2000 r/min,10 min,离心半径12 cm),取上清,比色法测定蛋白浓度,并进行电泳法分离蛋白质,电泳后湿转法转膜,分别加入一抗TGF-、CTGF 及内参(稀释浓度 1500),山羊抗兔二抗(稀 释 浓 度 1 1000),经 化 学 发 光 强 度(enhanced chemiluminescence,ECL)显 影 得 到 结果13。蛋白相对表达量=目的蛋白积分光密度值(integral optical density,IOD)/GAPDH IOD。1.8 统计学方法用 SPSS 22.0 软件分析数据,符合正态分布的计量资料均以均数标准差(xs)表示,多样本计量资料比较采用单因素方差分析,两两比较采用 LSD-t 检验。P0.05 为差异有统计学意义。结果2.1 大鼠体质量比较与对照组比较,模型组体质量升高(P0.05);与模型组比较,低、高剂量组及阳性组体质量降低(P0.05);高剂量组与阳性组上述指标改善效果均优于低剂量组大鼠(P0.05),具体见表 2。表 2 大鼠体质量比较(xs,n=8)组别体质量/g组别体质量/g对照组321.2318.61高剂量组338.6219.38#模型组379.3520.43阳性组336.7421.51#低剂量组357.1422.08#-注:与对照组比较P0.05;与模型组比较#P0.05;与低剂量组比较P0.052.2 大鼠血清性激素水平比较与对照组比较,模型组血清 LH、T 水平升高,FSH、E2 水平降低(P0.05);与模型组比较,低、高剂量组及阳性组血清 LH、T 水平降低(P0.05),FSH、E2 水平升高(P0.05);高剂量组与阳性组上述指标改善效果均优于低剂量组大鼠(P0.05),具体见表 3。表 3 大鼠血清性激素水平比较(xs,n=8)组别LH/(mIU/mL)FSH/(mIU/mL)T/(ng/mL)E2/(pg/mL)对照组25.574.846.460.640.810.0846.969.10模型组47.845.23a3.912.23a1.710.81a28.455.86a低剂量组24.714.02b4.521.12b0.410.29b35.207.25b高剂量组22.573.54bc5.520.97bc0.200.22bc38.796.84bc阳性组23.153.72bc5.200.72bc0.230.11bc38.166.67bc 注:与对照组比较aP0.05;与模型组比较bP0.05;与低剂量组比较cP0.05;黄体生成素(LH);促卵泡生成素(FSH);睾酮(T),雌二醇(E2)2.3 大鼠卵巢组织病理检测对照组卵泡数量多,种类丰富体积大,颗粒细胞层多,卵泡生长发育良好。模型组囊状卵泡和闭锁卵泡数增加,颗粒细胞层减少,可见闭锁卵泡。与模型组比较,低、高剂量组:扩张卵泡数、闭锁卵泡数明显减少,卵泡颗粒细胞层逐渐增厚,其中高剂量组及阳性组卵巢内可见成熟卵泡,具体见图 1。注:黑色箭头表示颗粒细胞层,红色箭头表示成熟卵泡A.对照组;B.模型组;C.低剂量组;D.高剂量组;E.阳性组图 1 大鼠卵巢组织病理图(HE,40)2.4大鼠卵巢组织 TGF-、CTGF mRNA 及蛋白表达量情况与对照组比较,模型组 TGF-、CTGF mRNA 水平升高(P0.05),TGF-、CTGF 蛋白表达上调(P 0.05);与模型组比较,低、高剂量组及阳性组的TGF-、CTGF mRNA 水平降低,TGF-、CTGF 蛋白表达下调(P0.05);高剂量组与阳性组上述指标改善效果均优于低剂量组大鼠(P0.05),具体见图2、表4。18212023 年 8 月第 29 卷第 8 期Aug 2023 Vol.29.No.8 中国中医基础医学杂志Journal of Basic Chinese Medicine表 4 大鼠卵巢组织 TGF-、CTGF mRNA 及蛋白表达量比较(xs,n=8,pg/mL)组别TGF-mRNACTGF mRNATGF-蛋白CTGF 蛋白对照组1.740.041.010.030.630.040.440.05模型组2.180.021.970.061.250.051.360.05低剂量组1.550.06#1.630.04#1.110.04#1.270.04#高剂量组1.270.05#1.380.09#0.960.03#1.040.04#阳性组1.320.03#1.410.05#0.750.03#0.800.03#注:与对照组比较P0.05;与模型组比较#P0.05;与低剂量组比较P0.05;转化生长因子-(TGF-);结缔组织生长因子(CTGF)A.对照组;B.模型组;C.低剂量组;D.高剂量组;E.阳性组图 2 大鼠卵巢组织转化生长因子-(TGF-)、结缔组织生长因子(CTGF)蛋白表达图 3 讨论PCOS 是常见的内分泌综合征,可导致女性月经紊乱、排卵障碍,不孕不育等,半数以上的患者伴随肥胖14。PCOS 的病因复杂,其发生由多种因素相互作用形成,目前发病机制尚不清楚。中医将PCOS 归属于“月经失调”“不孕症”及“肥胖”等范畴。其中肾虚痰湿型最为常见,主要由于脾肾亏虚导致体内水液代谢失常,形成痰湿,逐渐使卵巢表现出多囊性15。西医治疗 PCOS 短期效果显著,但后期病情反复无法根治,目前研究证实中药对于PCOS 具有一定的疗效,根据 PCOS 的中医证型,本研究选用化痰祛湿方进行中药调理,该方由薏苡仁、泽泻、茯苓、陈皮等药物组成,其中薏苡仁、泽泻具有利水除湿,清热泄热的功效,茯苓、白术则具有健脾益气,渗湿利水的功效;天竺黄、石菖蒲具有清热化痰,凉心安神,化湿开胃的功效;半夏能燥湿,化痰,止呕;藿香芳香化湿;猪苓利水渗湿;赤芍清热凉血,散瘀止疼;蒲黄止血,散瘀,利尿;陈皮则可健脾化痰。综合用药该方具有健脾、化痰以及祛湿等的功效,符合脾虚痰湿型、痰瘀互结型及肾虚血瘀型等大部分类型的 PCOS,旨在改善卵巢功能,促进排卵。本研究通过建立胖型 PCOS 大鼠模型发现,模型组血清 LH、T 水平、体质量升高,FSH、E2 水平降低,说明 PCOS 大鼠能够导致肥胖,同时性激素水平紊乱。不同剂量的化痰祛湿方干预后,低、高剂量组及阳性组血清 LH、T 水平、体质量降低,FSH、E2 水平升高,提示化痰祛湿方对于改善大鼠激素水平,促进排卵效果明显,其中高剂量化痰祛湿方效果尤为显著,提示化痰祛湿方在改善大鼠激素水平方面具有一定的效果,同时对于肥胖型大鼠的体重具有一定的控制作用。临床药理学显示,天竺黄、石菖蒲、半夏及陈皮等化痰类药物可以降低机体脂肪堆积,从而降低 PCOS 大鼠体重增厚卵巢细胞层,改善卵巢形态16。研究证实,补肾、化痰等药方能够有效降低机体行性激素与胰岛素水平,促进排卵,半夏、天竺黄等具有化痰作用,能够激活腺苷酸,从而进一步活化蛋白激酶 基因,使脂质代谢紊乱得到明显的改善,因此对肥胖型 PCOS 起到治疗作用,从而引起卵巢闭锁卵泡数减少,卵泡颗粒细胞层增厚,PCOS 的改善效果明显17-18。近年来研究证实卵巢纤维化是 PCOS 的发病机制之一19。卵巢局部产生的生物活性因子在多囊卵巢纤维化的过程有着重要作用,TGF-,CTGF 与卵巢间质纤维化密切相关。TGF-是生物活性因子中的一种,能够调节细胞生长、分化,同时能够促进成纤维细胞的生长,同时,TGF-是纤维化发生与发展的启动按钮,CTGF 是在 TGF-的刺激下诱导产生,主要介导 TGF-的促纤维化作用,二者相互作用,加速 ECM 沉积,促进卵巢器官纤维化的发展,在PCOS 等多种组织器官纤维化疾病中发挥重要作用20-21。本研究中模型组 TGF-、CTGF mRNA 水平升高,TGF-、CTGF 蛋白表达上调,提示肥胖型PCOS 由 TGF-/CTGF 信号传导通路诱导,化痰祛湿方干预后,TGF-、CTGF mRNA 水平降低,TGF-、CTGF 蛋白表达下调,表明化痰祛湿方对肥胖型PCOS 可能通过抑制 TGF-/CTGF 信号通路发挥作用。化痰祛湿方能够抑制 TGF-/CTGF 信号通路的表达,抑制 TGF-诱导产生 CTGF,阻碍卵巢纤维化的发展,从而起到改善 PCOS 的作用。综上所述,化痰祛湿方能够改善肥胖型 PCOS,其作用机制可能与 TGF-/CTGF 信号通路有关。未来可通过 TGF-/CTGF 的抑制剂进一步探究该通路对肥胖型 PCOS 的调控作用,为化痰祛湿方在肥胖型 PCOS 中的广泛应用提供更加全面的科学依据。参考文献:1 吴丹,王晓滨,丛慧芳,等.针灸对肥胖型多囊卵巢综合征患者卵巢功能的影响J.世界中医药,2020,15(16):2482-2485.2 WANG F,ZHANG Z F,HE Y R,et al.Effects of dipeptidyl peptidase-4 inhibitors on transforming growth factor-beta1 signal transduction pathways in the ovarian fibrosis of polycystic ovary syndrome ratsJ.J Obstet Gynaecol Res,2019,45(3):600-608.3 熊梦欣,邓阿黎.中西医结合改善多囊卵巢综合征血脂代谢疗效系统评价J.中国中医基础医学杂志,2020,26(9):2821中国中医基础医学杂志Journal of Basic Chinese Medicine 2023 年 8 月第 29 卷第 8 期Aug 2023 Vol.29.No.81317-1323.4 潘爱珍,易伟民,陈珂,等.基于 oatp3a1 表达的苍附导痰汤治疗肥胖型多囊卵巢综合征模型大鼠机制的探讨J.时珍国医国药,2018,29(4):817-820.5 KABEL A M,ASHOUR A M,OMAR M S,et al.Effect of fish oil and telmisartan on dehydroepiandrosterone-induced polycystic 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年创刊以来始终坚持“以提高为主,兼顾普及”的办刊方针,是我国中医药界创刊早、发行量大、具有较高权威性和学术影响力的国家级中医药期刊之一,是中文核心期刊和科技核心期刊、中国精品科技期刊、首届国家期刊奖获得者和中国期刊方阵双奖期刊、新中国 60 年有影响力的期刊、中国百强科技期刊、中国百种杰出学术期刊,中医药科技期刊分级目录 T1 级期刊。荣获第五届中国出版政府奖期刊奖,第二届、第三届、第四届中国出版政府奖期刊奖提名奖。中医杂志主要栏目中当代名医和临证心得分别介绍名老中医和临床医生辨证用药治疗疑难病的经验;临床研究介绍中医药治疗的新方法、新成果;学术探讨、思路与方法、循证中医药、病例讨论、综述、百家园等栏目,提供最新学术观点、研究成果与治疗方法,成为学习中医药、研究中医药,不断提高临床及研究水平的良师益友。中医杂志为半月刊,每月2 日和17 日出版,每期定价30.00 元,全年720 元。国内读者可以到全国各地邮局办理订阅手续(邮发代号:2-698),也可以与本刊读者服务部联系邮购,邮购免邮费。电话:[phone]。国外发行:中国国际图书贸易集团有限公司(北京 399 信箱,邮编:100044,代号:SM140)。本社地址:北京市东城区东直门内南小街 16 号,邮政编码:100700。网址:http:/。38212023 年 8 月第 29 卷第 8 期Aug 2023 Vol.29.No.8 中国中医基础医学杂志Journal of Basic Chinese Medicine