恒温实时荧光法快速检测婴幼儿辅助食品中胡萝卜成分的研究.pdf

研究论文恒温实时荧光法快速检测婴幼儿辅助食品中胡萝卜成分的研究牛会敏1 2 3，菜蒋静1 2 3，户瀚文1 2 3，王静怡1 2 3（1.河南省食品和盐业检验技术研究院，河南郑州450 0 0 3；2.河南省特殊食品工程技术研究中心，河南郑州450003；3.国家市场监管重点实验室（食品安全快速检测与智慧监管技术），河南郑州450 0 0 3）摘要：为建立婴幼儿辅助食品中胡萝卜成分的恒温实时荧光快速检测方法，根据胡萝卜ITS1-5.8SRNA-ITS2基因序列设计合成恒温实时荧光法（LAMP）的特异性引物，以常见农产品及不同胡萝卜质量分数的白萝卜DNA分别验证方法的特异性和灵敏度，选取不同品系胡萝卜种子验证方法的适用范围，并通过预包装食品检测其实用性。结果表明：所建方法与其他物种无交叉反应，特异性强，能在1 h内检测低至质量分数为0.0 1%的胡萝卜成分，灵敏度高，适用于不同品系胡萝卜的检测。适用范围广，通过实际样本的检测验证，结果快速、准确。该方法操作简单、成本较低、数据智能判读实时同步、结果准确快速，可用于婴幼儿辅助食品中胡萝卜成分的快速检测，为婴幼儿食品标签管理及食品安全监管提供技术依据。关键词：胡萝卜，恒温实时荧光法，过敏原，婴幼儿辅助食品，快速检测中图分类号：TS207.3Study on Rapid Determination of Carrot Components in ComplementaryFoods for Infant and Young Children by IsothermalNIU Huimin 23,JIANG Jing.23,HU Hanuen 2,WAN Jingyil2(1.Henan Institute of Food and Salt Industry Inspection Technology,Zhengzhou 450003,China;2.Henan SpecialFood Engineering Technology Center,Zhengzhou 450003,China;3.Key Laboratory of Food Safety Quick Testingand Smart Supervision Technology for State Market Regulation,Zhengzhou 450003,China)Abstract:In order to establish a rapid detection method for carrot components in complementaryfoods for infant and young children using isothermal real-time fluorescence,specific primers forloop-mediated isothermal amplification(LAMP)were designed and synthesized based on the carrotITS1-5.8 SRNA-ITS2 gene sequence.The specificity and sensitivity of the method were verified byDNA from common crop and white radish with different carrot mass ratios.Different cultivars ofcarrot seeds were selected to verify the applicability of the method,and its practicality was testedthrough pre-packaged food.The results indicated that the established method exhibited strongspecificity without cross-reactivity with other species.It can detect the composition of carrot as low文章编号：1 6 7 3-1 6 8 9（2 0 2 3）1 0-0 0 9 4-0 6Real-Time Fluorescence AssayDOl:10.12441/spyswjs.20220303002收稿日期：2 0 2 2-0 3-0 3基金项目：河南省科技攻关计划项目（1 8 2 1 0 2 1 1 0 3 8 4)；河南省科技发展计划项目(2 0 2 1 0 2 2 1 0 1 9 3）；河南省市场监督管理局科技计划项目(2020sj39)。作者简介：牛会敏（1 9 8 5),女，硕士，工程师，主要从事食品微生物及分子生物学检测研究。E-mail：53 0 7 9 6 0 6 5 q q.c o m94JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.42 IsSue 10 2023修回日期：2 0 2 2-0 4-0 1研究论文牛会敏，等：恒温实时荧光法快速检测婴幼儿辅助食品中胡萝卜成分的研究as 0.01%mass ratio within lh,demonstrating high sensitivity.It is suitable for the detection ofdifferent carrot cultivars with a wide range of application.The method proved to be fast and accuratewhen validated with actual samples.This method offers simplicity,cost-effectiveness,real-timesynchronization of intelligent data interpretation,and accurate and rapid visualization of results.Therefore,it can be used for the rapid detection of carrot components in complementary foods forinfant and young children,providing a technical basis labeling management and food safetysupervision in complementary foods for infant and young children.Keywords:carrot,isothermal real-time fluorescence assay,allergen,complementary foods for infantand young children,rapid detection胡萝卜是伞形科草本植物，因其独特的营养价值和保健作用，常被作为食品配料用于各种饮料、糕点、面食以及功能性食品中 1-3 ,尤其在婴幼儿辅助食品中，其富含的胡萝卜素能帮助婴幼儿提高视力和免疫力，抵抗病菌侵袭，促进健康成长4。但胡萝卜也是一种常见食物过敏原，全世界约2 5%的过敏反应是由食品中的胡萝卜成分产生的 5,我国亚运食品安全食品过敏原标识标注列出的导致过敏反应的食品中，胡萝卜位列其中，目前关于胡萝卜过敏的报道也时有发生 7-9 。在婴幼儿辅助食品的生产销售中，若标签标识不规范，利用掺杂掺假、以次充好谋取利益，或擅自改变产品组成，造成产品的真实属性与标签不符，这种行为不仅涉及经济、营养价值，更直接影响婴幼儿的健康安全，引发食源性过敏反应。因此，婴幼儿辅助食品中胡萝卜成分的真实性检测是市场监管中呕待解决的问题。环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermalamplification,LAMP)是一种新型的等温核酸扩增方法，该方法针对靶基因的6 个区域设计4条特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在恒温条件下即可完成核酸扩增反应 0,缩短了检测时间,无需昂贵的温控和辅助设备且操作简单,具有简单、快速、准确等优点，可广泛应用于食品中致病微生物检测 I-12、转基因成分鉴定、掺假肉鉴别及动植物病害检测等方面。但LAMP扩增结果的表达方式有浊度分析法和目视荧光法，这2 种结果判断方式都需要靠检测人员肉眼去观察，结果判读受外界因素的影响较大。基于LAMP技术并结合实时荧光技术和恒温荧光检测设备，作者根据胡萝卜的ITS1-5.8SRNA-ITS2基因,设计特异性引物,建立了快速检测婴幼儿辅助食品中胡萝卜成分的恒温荧光PCR方法，旨在为标签管理、食品安全监管和食品质量控制提供技术支撑。1材料与方法1.1材料1.1.1试验材料从当地超市或农贸市场购买大豆、玉米、大米、白萝卜、心里美萝卜、青萝卜、水萝下、白菜、芹菜、韭菜、花生、核桃等用于特异性试验。不同品系的胡萝卜种子随机购自农贸市场，用于灵敏度和适应性试验。用于验证方法实用性的样本均为单位抽检样品。1.1.2主要试剂植物DNA提取试剂盒、植物内源恒温扩增试剂盒：广州迪澳生物科技有限公司产品；无水乙醇、异丙醇：市售分析纯试剂。1.1.33主要仪器QuantStudio7flex实时荧光定量PCR仪：赛默飞世尔科技公司产品1.2试验方法1.2.1样品制备及DNA提取利胡萝卜样品，用已灭菌的均质杯打碎混合均匀，按照植物DNA提取试剂盒说明书要求进行DNA提取。提取后的DNA使用核酸蛋白分析仪测定A260m和A280m，通过A260m/A280mm的比值确定DNA浓度和纯度。1.2.2引物设计根据Genbank上公布的胡萝卜的ITS1-5.8SRNA-ITS2基因序列，设计并合成特异性引物，包括2 条外引物F3和B3,2条内引物FIP和BIP,2条环引物FLP和BLP,由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表1。1.2.3恒温扩增反应使用实时荧光定量PCR仪进行恒温扩增反应，所有反应均设置空白对照、阴性对照和阳性对照。反应条件为：6 3,1 5s;63,45s,共6 0 个循环。反应体系见表2。食品5生物技术学报2 0 2 3 年第42 卷第1 0 期称取适量待测新鲜95NIU Huimin,et al:Study on Rapid Determination of Carrot Components inRESEARCHARTICLEComplementary Foods for Infant and Young Children byIsothermalReal-TimeFluorescenceAssay表1 胡萝卜引物序列Table 1Primer sequences of carrot成分胡萝卜Table 2Reaction system of isothermal amplification体积/uLMasterMix(2x)12.5Bst-DNA聚合酶1.0荧光染料0.5外侧上游引物F3(10mol/L）0.5外侧下游引物B3（1 0 mol/L）0.5内侧上游引物FIP(40mol/L)1.0内侧下游引物BIP（40 mol/L）1.0上游环引物FLP(20mol/L）1.0下游环引物BLP(20mol/L）1.0DNA模板2.0去离子水4.01.2.4胡萝卜成分恒温实时荧光法的特异性验证试验分别提取常见农作物如粮食类：大米、大豆、玉米；坚果类：核桃、花生；蔬菜类：芹菜、白菜、韭菜、白萝卜、青萝卜、心里美萝卜和水果萝卜等的DNA作为模板，用1.2.3 的方法进行胡萝卜特异性恒温扩增反应。1.2.5胡萝卜成分恒温实时荧光法的灵敏度试验称取新鲜的胡萝卜1 0 g、白萝卜9 0 g,用均质杯充分均质混匀，制备成含胡萝卜质量分数为1 0%的样本，取样本1 0 g、白萝卜9 0 g，充分均质混匀，制备成含胡萝卜质量分数为1%的样本，同法，分别制备质量分数为0.1%、0.0 5%、0.0 1%、0.0 0 5%和0.0 0 1%的样本,分别提取DNA进行恒温扩增,确定胡萝卜源性成分的恒温扩增检测灵敏度。1.2.6胡萝卜成分恒温实时荧光法适用性试验为验证引物和方法的适用性，购买不同品系的7 种胡萝卜种子（改良八寸红、农大红芯胡萝卜、三红特选八寸参、韩红参王九寸红、豫丰红笋9 0 8、红龙特级三红七寸参、新红秀胡萝卜）,以确定方法的适用范围。基因名称5.8SRNA表2 恒温扩增的反应体系组分引物序列F3:5-GAAATTGGCTCCCGTGC-3B3:5-GCTTAAACTCAGCGGGTAGT-3FIP:5-AACCACCGATGTCGCGATGCCTTTTGTGTGCGGTTGGC-3BIP:5-GTCGTTGTGTATACCCGCCGCGGGTCACAATCGAAGTGCA-3FLP:5-CGTCACCAGAGACTCATTTTTGA-3BLP:5-GGCCCTTGGGCACAGCAAA-31.2.7预包装食品中胡萝卜成分恒温实时荧光法检测试验选择单位抽检的7 种食品，其中包括婴幼儿辅助食品米粉、果泥、面条等（6 种食品标签标识含有胡萝卜成分，1 种食品无胡萝卜成分标识），提取DNA，按照1.2.3 的方法进行检测，通过核对检测结果与标签标示是否相符，确定本方法检测实际样本中胡萝卜成分的能力。2结果与讨论2.1引物特异性试验基于胡萝卜的ITS1-5.8SRNA-ITS2基因设计的内、外及环引物对胡萝卜DNA有显著扩增,见图1,对其他1 1 种常见农作物尤其是白萝卜、心里美萝卜、青萝卜等物种均无DNA扩增，说明该引物对胡萝卜源性成分恒温扩增检测有良好的特异性，与上述物种没有交叉反应。2.2灵敏度试验提取含有胡萝卜质量分数为1 0%、1%、0.1%、0.05%、0.0 1%0.0 0 5%和0.0 0 1%样品的DNA，分别进行恒温扩增，结果见图2。结果显示，质量分数为10%、1%、0.1%、0.0 5%，0.0 1%的样品均出现典型的“S形扩增曲线，且随着胡萝卜质量分数增加，开始出现指数扩增的时间越短，循环阈值（cyclethreshold)越小，而0.0 0 5%和0.0 0 1%的样品未呈现典型扩增曲线，因此本检测方法对胡萝卜检测限可低至质量分数0.0 1%。将新鲜胡萝卜、白萝卜样品粉碎后按比例进行均匀混合，模拟实际样本的混合情况,相对于直接对DNA进行梯度稀释,考虑了DNA提取效率的影响，因此按质量比进行灵敏度的测试,更能准确反映检测方法的技术指标。2.3适用性试验提取不同品系的7 种胡萝卜种子的DNA，按96JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.42 IsSUe 10 2023研究论文牛会敏，等：恒温实时荧光法快速检测婴幼儿辅助食品中胡萝卜成分的研究照1.2.3 的方法，对7 个样本进行检测，结果见图3。实验数据表明，7 个样本均获得典型的荧光扩增曲350000325000300.000275000250000225000200.000175.00015000012500010000075.00050000250007.842.35101405Y：阳性对照；1 1 2：大米、大豆、玉米、芹菜、白菜、韭菜、核桃、花生、白萝卜、青萝卜、心里美萝卜、水果萝卜；1 3：胡萝卜；N：阴性对照。Fig.1Results of real-time fluorescence isothermal specific amplification of carrot and others90000080000070000060000050000040000030000020000010000030.967.1167280510Y：阳性对照；1 7:1 0%、1%、0.1%、0.0 5%、0.0 1%、0.0 0 5%、0.0 0 1%;N：阴性对照。图2 胡萝卜恒温实时荧光灵敏度检测扩增结果Fig.2 Results of real-time fluorescence isothermal sensitivity amplification of carrot375000350000325000300000275000250000225000200000175000150000125000100.00075.00050000250015.206.39390205Y：阳性对照；1 7：豫丰红笋9 0 8、新红秀胡萝卜、农大红芯胡萝卜、红龙特级三红七寸参、韩红参王九寸红、改良八寸红；N：阴性对照。Fig.3Amplification results of different cultivars of carrot by isothermal real-time fluorescence amplification线，说明建立的方法能检测出不同品系的胡萝卜，方法实用性良好。231011101520图1 胡萝卜恒温实时荧光特异性扩增结果11%10%10.1%10.01%10.05%0.001%10.005%NY151015图3 不同品系胡萝卜的恒温实时荧光检测扩增结果451121325303540循环次数2025循环次数42025循环次数6NY45505530354063035食品5生物技术学报2 0 2 3 年第42 卷第1 0 期60455055N40455055606097NIU Huimin,et al:Study on Rapid Determination of Carrot Components inRESEARCHARTICLEComplementary Foods for Infant and Young Children byIsothermal Real-TimeFluorescenceAssay2.4实际样本检测采用恒温荧光扩增方法对抽检的7 种预包装食品，其中5种是婴幼儿辅助食品的样本进行胡萝卜成分检测，检测结果和扩增曲线见表3 和图4。7种食品中有6 种检出胡萝卜源，标签标识有胡萝卜成分的食品均有检出，与配料表中胡萝卜成分标识结果一致，表明作者建立的恒温扩增方法可用于实际样本尤其是婴幼儿辅助食品中胡萝下成分的检测，结果准确可靠。42500040000037500035000032500030000027500025000022500020000017500015000012500010000075000500002500045.206.3939020Y：阳性对照；1 7：胡萝卜苹果泥、婴幼儿营养小米胡萝卜米粉、思念胡萝卜饺子、鲜邦胡萝卜面条、牛肉胡萝卜粥、农夫果园混合果蔬汁饮料、有机营养米粉；N：阴性对照。Fig.4 Results of isothermal real-time fluorescence amplification of carrots from different pre-packaged foods3结语作者设计了胡萝卜成分恒温荧光PCR法快速检测的特异性引物和反应体系，使用多种不同植物物种进行特异性验证，证实了该方法具有较高的特异性，且可在1 h内检测低至质量分数0.0 1%的胡萝卜成分，方法灵敏度较高，采用多种不同品系胡萝卜进行适用性验证，适用性广泛且结果准确。同时对多种不同种类的预包装食品尤其是婴幼儿辅助食品进行验证，证明该方法对成分复杂、加工程参考文献：1阮婉贞.胡萝卜的营养成分及保健功能 .中国食物与营养,2 0 0 7,1 3(6):51-53.RUAN W Z.Nutritional components and health care functions of carrotsJJ.Food and Nutrition in China,2007,13(6):51-53.(in Chinese)2王鹏，王文亮.胡萝卜的保健功能及其食品开发前景 .农产品加工(学刊),2 0 0 9(1 2)：54-56.98JOURNALOF FOOD.SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.42 IsSue 10 2023表3 实际样品的恒温扩增结果Table3Results of isothermal amplification of actualsamples样品样品名称编号123456768INY510图4不同预包装食品的胡萝卜恒温实时荧光扩增结果成分检测提供了依据。标示是否含检测有胡萝卜结果牛肉胡萝卜粥是婴幼儿营养小米胡萝卜米粉是胡萝卜苹果泥是思念胡萝卜饺子是鲜邦胡萝卜面条是农夫果园混合果蔬汁饮料是有机营养米粉否1520检出检出检出检出检出检出未检出25303540循环次数度不同的市售食品中胡萝卜成分的实际检测亦有较好的适用性。作者利用恒温实时荧光PCR技术,建立的胡萝卜成分快速检测的新方法，集恒温扩增、实时荧光检测、智能数据判读及实时数据同步等优势，将样品中存在的微量胡萝卜核酸，扩大转化为设备可读的荧光信号，快速检测婴幼儿辅助食品中的胡萝卜成分，为婴幼儿辅助食品的标签规范管理及过敏原45505560研究论文牛会敏，等：恒温实时荧光法快速检测婴幼儿辅助食品中胡萝卜成分的研究WANG P,WANG W L.The healthy protection of carrot and the development prospects of foodJJ.Academic Periodical of FarmProducts Processing,2009(12):54-56.(in Chinese)3陈瑞娟，毕金峰,陈芹芹，等.胡萝下的营养功能、加工及其综合利用研究现状 .食品与发酵工业,2 0 1 3,3 9(1 0):2 0 1-2 0 6.CHEN R J,BI J F,CHEN Q Q,et al.Research status nutritional and healthy function of carrot and its processing andcomprehensive utilizationJ.Food and Fermentation Industries,2013,39(10):201-206.(in Chinese)【4 杨文智，李斌，马力.研究婴幼儿辅助食品胡萝卜泥加工工艺和配方 .中外食品工业，2 0 1 4(1 1):1-3.YANG W Z,LI B,MA L.To study the processing technology and formula of carrot puree in infant foodJJ.Sino-Foreign 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