贵州省毕节地区大型真菌资源调查及亲缘关系分析.pdf

中国食用菌耘阅陨月蕴耘 云哉晕郧陨 韵云 悦匀陨晕粤灾燥造援 42晕燥援4DOI：10.13629/ki.53-1054.2023.04.003中国食用菌圆园23，42（4）：1827耘阅陨月蕴耘 云哉晕郧陨 韵云 悦匀陨晕粤悦晕缘猿原员园缘源/匝陨杂杂晕 员园园猿原愿猿员园贵州省毕节地区大型真菌资源调查及亲缘关系分析*杨雨，秦利军*（贵州大学 山地植物资源与种质创新教育部重点实验室/农业生物工程研究院/生命科学学院，贵州 贵阳 550025）摘要：通过随机采样法对贵州毕节部分地区大型真菌进行调查，最终获得 30 份样品。参照 中国 贵州高等真菌原色图鉴 和 贵州大型真菌 对采集的 30 份样品进行形态学比较和分类；同时，结合 ITS 和 LSU 保守区扩增、比对，最终确定 30 份样本分属于 2 门 2 纲 5 目 13 科 15 属。其中，伞菌目（Agaricales）占比最高，约占总数的 53.3%；其次为红菇目（Russulales），占总数的 30.0%；而地星目（Geastrales）和蘑菇目（Agaricales）数量最少，均约占总数的 3.3%。基于 ITS 保守区聚类结果表明，不同菌株与其近缘物种表现出优先聚类的特点。其中 BJ-17 和 BJ-28 以 99%的支持率聚为一支，暗示两者可能为同一个种，而 BJ-7 与栎裸脚伞（Gymnopusdryophilus MW816514.1）、BJ-25 与栎裸脚伞（G.dryophilus var.MW554237.1）的 ITS 序列相似性低于 90%，则推测其可能为裸脚伞属（Gymnopus）不同种。调查发现，红菇属（Russula）和乳菇属（Lactarius）在毕节地区较为常见且经济价值较大，可作为该地区大型食用菌种质资源开发的优良菌种。关键词：大型真菌；形态特征；ITS；LSU；亲缘关系中图分类号：S646.9文献标志码：A文章编号：1003-8310（2023）04-0018-10Resources Survey and Phylogenetic Analysis of Macrofungiin Bijie Area of Guizhou ProvinceYANG Yu,QIN Li-jun(Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region,Ministry of Education,Institute of Agro-Bioengineering and College of Life Sciences,Guizhou University,Guiyang 550025,China)Abstract:Random sampling method was used to investigate macrofungi in some areas of Bijie,Guizhou,and 30 samples wereobtained.The 30 samples were compared and classified according to Colored illustration of Higher Fungi from Guizhou in P.R.China and The Macrofungi from Guizhou,China.Meanwhile,the 30 samples were classified into 2 phyla,2 classes,5 orders,13families and 15 genera by the amplification and comparison of ITS and LSU conserved regions.Among them,Agaricales ac原counted for the highest proportion,accounting for about 53.3%of the total;followed by Russulales,accounting for 30.0%of thetotal,while Geastrales and Agaricales were the least in number,both accounted for about 3.3%of the total.Clustering resultsbased on the conserved regions of ITS and LUS showed that different strains and their relatives exhibited preferential aggrega原tion characteristics.Among them,BJ-17 and BJ-28 are clustered together with 99%support,suggesting that the two may be thesame species,and the ITS sequence similarity between BJ-7 and Gymnopus dryophilus(MW816514.1),BJ-25 and G.dryophilusvar.(MW554237.1)is less than 90%,then it is speculated that they may be the different species of Gymnopus.Through investi原gation,it was found that among these strains,Russula and Lactarius are relatively common and have great economic value,andcan be used as excellent strains for developing macrofungi germplasm resources in Bijie area.Key words:macrofungi;morphological characteristics;ITS;LUS;genetic relationship*基金项目：贵州省科技计划重点项目（黔科合支撑 2019 2451 号）。作者简介：杨雨（1996），女，硕士研究生，主要研究方向为大型真菌的调查及分类鉴定。E-mail:*通信作者：秦利军（1982），男，博士，副教授，主要从事大型真菌调查及植物生理生化方面研究。E-mail:leequine_收稿日期：2023-05-17大型真菌是一类无需借助显微镜肉眼可见、徒手可采，且具有明显子实体的真菌的统称1。我国大型真菌资源十分丰富2-3。毕节市地处贵州省西北部，位于黔、滇、川三省交界处，平均海拔为第 42 卷第 4 期王彤等：美味牛肝菌药用价值及产品开发现状1 511 m，年平均温度为 1015 益，植被类型多样，为多种大型真菌的生长提供了良好的生存环境4-6。张洁7利用传统的形态学鉴定方法，对采自毕节地区的 437 份大型真菌样品进行分类，结果显示其分属于 44 科 86 属。尽管形态学鉴定具有快速、便捷等优势，但因大型真菌的形态特性极易受环境因素的影响，常导致鉴定结果不准确8-10。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，开发出许多可用于大型真菌鉴定的分子标记，包括内转录间隔区 ITS（internal tran原scribed spacer，ITS），核 糖 体 大 亚 基 LSU（largesubunit，LSU）等11-12。因 ITS 序列和 LSU 序列结构相对保守，所受自然选择压力小，在大型真菌分子鉴定中被广泛应用13。丛倩倩等14通过分子生物学鉴定的方法，明确了根据形态特征辨别为“白灵芝（Ganoderma lucidum）”的菌株实际为乳白栓孔菌（Leiotrametes lactinea）。渠文思等14结合 ITS 和 LSU2 种分子标记技术，将 1 株野生鹅膏菌属（Amanita）菌株准确鉴定为拟橙盖鹅膏菌（Amanitac aesareoides）。本试验对贵州省毕节市大型真菌主要分布区进行种质资源调查，通过比较形态学特性及菌株 ITS和 LSU 保守区序列差异，对菌株进行准确鉴定，并基于 ITS 序列构建系统发育树，研究各菌株间的亲缘关系。试验结果将为进一步指导和完善毕节部分地区大型真菌生物多样性保护工作和系统分类奠定基础，同时为挖掘、保护和利用大型真菌资源提供依据。1材料与方法1.1主要试剂和仪器试剂：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）、葡萄糖（glucose）、蛋白胨（peptone），上海微生物科技有限公司；十六烷基三甲基溴化铵 CTAB（hexadecyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）、三 氯 甲 烷（trichloromethane）、乙二胺四乙酸 EDTA（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）、氯化钠（NaCl）、无水乙醇（ethanol absolute），天津科密欧化学试剂有 限 公 司；DL2 000 DNA Marker、10 伊 LoadingBuffer、2伊Premix Primes 酶，日本 TaKaRa 公司。扩增通用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。仪器：DHG-9013A 电热恒温鼓风干燥箱，上海龙跃仪器设备有限公司；EOS R5 数码相机，佳能；TP-213 电子天瓶，北京丹佛仪器有限公司；CADUV-TOC 纯水仪、Powerpac Basic 3000 琼脂糖凝胶电泳仪、C 1000 Touch PCR 仪，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；Flooc Compact 制冰机、SK-1 涡旋震荡器，上海梅香仪器有限公司；Tanon 4600SF凝胶成像系统 XRS、MDF-20 益低温冰箱，上海东曹生物科技有限公司等。1.2大型真菌野外采集野外采集参照李博、李超和张菁16-18的采样方法，略有改动。从 2020 年 5 月至 2021 年 9 月，分批在毕节市金沙县平坝镇、桂花乡，七星关区砂锅寨、熊家坟等地进行样品的野外采集。在大型真菌集中出现时进入林区，以随机观察的方式进行调查采样。同时，对菌株的生境地进行拍照并记录特征。利用手机软件 Biotracks 详细记录采样位置、海拔高度、采集人等信息。并在采集前用手机对样品进行拍照，用相机分别对子实体及其菌盖、菌柄、菌褶等部位进行拍照。拍照完毕后小心采集子实体，装入采集盒并贴上标签。随后将样品置于 48 益烘箱中烘干备用。1.3子实体形态鉴定参照 PARLUCHA 等19的方法，对采集的菌株进行形态学描述，记录子实体形状、颜色、质地、菌环和菌托的有无等，并参考 中国 贵州高等真菌原色图鉴 和 贵州大型真菌 对采集的菌株进行初步鉴定20-21。1.4分子生物学鉴定1.4.1DNA 提取参照武冬梅 22的方法，提取子实体基因组DNA，将提取物用 1%的琼脂糖凝胶于 95 V 电压下电泳 45 min，用凝胶成像系统检测条带清晰程度。将条带单一（无降解）的 DNA 样本置于-20 益冰箱保存备用。1.4.2ITS 和 LSU 序列扩增比对参照 B覵ASZKOWSKI 等23的方法，用真菌通用引物对样品的 ITS 以及 LSU 序列进行扩增，扩增得到的 PCR 产物用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测，检测合格的产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。试验所用的引物详见表 1。杨雨等：贵州省毕节地区大型真菌资源调查及亲缘关系分析19中国食用菌耘阅陨月蕴耘 云哉晕郧陨 韵云 悦匀陨晕粤灾燥造援 42晕燥援41.5ITS 序列比对及同源性分析参照刘潇文等24的方法，将测序结果在 NCBI 进行 BLAST 比对，分析其同源性，并利用 MEGA 7 构建系统发育树。2结果与分析2.1大型真菌生境调查结果采样地主要集中在毕节市金沙县和七星关区。在对采样地进行调查时发现，该地植被类型多样，且森林覆盖率都在 45%以上，年平均温度约 15 益。适宜的天气和较大的海拔差异为大型真菌的生长提供生存环境。调查地基本信息见表 2 和图 1。如表 2 和图 1 所示，毕节地区大型真菌生境地主要包括 6 种类型，即以毛竹（Phyllostachys eduli）为主的竹林，以杉木（Cunninghamia lanceolata）为主的常绿针叶林，以马尾松（Pinus massoniana）为主的常绿乔木混交林，以栎树（Quercus）为主的常绿落叶阔叶林，以马桑（Coriaria nepalensis）为主的灌木林以及草地。另外，在林地的低矮灌木层中往往伴生有蕨科（Pteridiaceae）等植物，地上留有大量的松果和枯枝落叶，这为大型真菌的生长提供了适宜的环境。2.2大型真菌形态学特征将采集的样品按顺序编号后进行形态特征描述。子实体形态特征详见表 3。如表 3 所示，所采集的子实体多为中等大小，只有 BJ-30 子实体偏小，形似喇叭状；菌盖的形状主要为近平展、浅漏斗形和半球形，部分样品菌盖中间略微向下凹陷；菌柄多为圆柱形中空状；菌肉多为肉质，白色。2.3ITS 和 LSU 序列 PCR 扩增结果对样品基因组 DNA 的 ITS 和 LSU 片段进行 PCR扩增，扩增产物电泳检测结果详见图 2。如图 2 所示，样品的 ITS 片段目标条带长度为650750 bp；LSU 片段目标条带长 7501 000 bp。扩增产物经电泳检测条带单一，无明显的拖尾现象，符合测序要求。2.4ITS 及 LSU 序列同源性比对结果将测序获得的 ITS 和 LSU 序列分别在 NCBI 中进行 BLAST 比对，其与近缘物种的序列同源性情况详见表 4。扩增区域ITSLUS引物名称LR5ITS1ITS4LROR引物序列（5寅3）TCCGTAGGTGAACCTGCGGTCCTCCGCTTATTGATATGCACCCGCTGAACTTAAGCTCCTGAGGGAAACTTCG表 1通用引物序列Tab.1The sequences of universal primers采样地七星关区熊家坟金沙县平坝镇金沙县桂花乡七星关区砂锅寨森林覆盖率/%海拔/m57.271 51156.201 12948.501 13075.301 511年平均温度/益年降雨量/mm14.81 065.015.01 059.012.9897.412.5954.0表 2大型真菌采样地调查Tab.2Survey of sampling sites for macrofungi图 1大型真菌生境图Fig.1The growth habitat of macrofungi注：A.竹林；B.常绿针叶林；C.常绿乔木混交林；D.常绿落叶阔叶林；E.灌木林；F.草地。Notes:A.Bamboo forest;B.Evergreen coniferous forest;C.Mixedevergreen trees;D.Evergreen deciduous broad-leaved forest;E.Shrub forest;F.Grassland.20第 42 卷第 4 期王彤等：美味牛肝菌药用价值及产品开发现状编号子实体大小BJ-1中等BJ-2中等菌盖菌柄平展形，中间下凹边缘平展，橙红色圆柱形，中空，浅褐色平展形，中间略向下凹，浅绿色圆柱形，实心，白色菌褶/菌管菌肉直生，等长，白色肉质白色离生，等长，白色肉质白色BJ-3中等半球形，中间略微下凹，边缘有部分撕裂，淡紫色圆柱形，中空，深紫色直生，等长，白色肉质白色BJ-4中等漏斗形，中心淡褐色，边缘白色圆柱形，中空，白色离生，等长，白色肉质白色BJ-5中等半球形，具光泽，湿时较粘，边缘具不规则波状，浅黄色圆柱形，中空，浅棕色菌管呈不规则形，乳白色肉质乳白色BJ-6中等近平展，中间略向下凹，边缘有一个小的缺口，灰褐色圆柱形，中空，灰褐色弯生，等长，乳白色肉质浅粉色BJ-7中等斗笠形，有的边缘略微向上翘，浅褐色圆柱形，中空，浅褐色离生，等长，白色肉质白色BJ-8中等外表面灰色向下弯曲，中间有一个褐色的圆形突起，多具不规则龟裂无无膜质褐色BJ-9中等浅漏斗形，红色圆柱形，中空，浅粉色离生，等长，白色肉质白色BJ-10中等斗笠形，中间突起部分为暗红色，其余为深棕色，近边缘为乳白色圆柱形，中空，淡红褐色离生，等长，白色肉质白色BJ-11中等漏斗形，中间和边缘颜色较淡，边缘有碎裂，红色圆柱形，中空，白色直生，等长，白色肉质白色BJ-12中等半圆形，中心微向下凹，菌盖中间浅灰色，边缘乳白色圆柱形，实心，乳白色离生，等长，白色肉质白色BJ-13中等半圆形，中间部分为褐黄色，边缘颜色逐渐变淡直至白色圆柱形，中空，浅褐色直生，等长，白色肉质白色BJ-14中等半圆形，中间微微下凹，菌盖上附有一层白色的微小绒毛，浅黄色圆柱形，实心，浅褐色菌管圆形，白色肉质白色BJ-15中等平展形，中心为浅棕色，整体乳白色圆柱形，中空，浅棕色离生，等长，白色肉质白色BJ-16中等扇形、覆瓦状，菌盖近平展，橙色近无柄菌褶近平滑肉质橙色BJ-17中等半圆形，菌盖上出现不规则的龟裂，猪肝红色圆柱形，实心，猪肝红色菌孔圆形，淡黄色肉质黄色BJ-18中等近平展和斗笠形，有的边缘略微向上翘，浅褐色圆柱形，中空，浅褐色离生，等长，白色肉质白色BJ-19中等浅漏斗形，边缘下弯，浅褐色圆柱形，中空，浅褐色直生，等长，白色肉质白色BJ-20中等浅漏斗形，边缘下弯，橙褐色圆柱形，中空，白色直生，等长，白色肉质白色BJ-21中等斗笠形，边缘向下弯，颜色稍微变淡，棕色圆柱形，中空，浅棕色直生，等长，浅棕色肉质棕白色BJ-22中等整体偏米白色，球形，上部中心出现一块黑褐色，外面具无数小疣和小刺具小柄米白色，粗短肉质白色BJ-23中等半圆形，中间微微下凹，浅棕色和灰褐色相间出现圆柱形，实心，浅橙色菌孔圆形，浅粉色肉质灰白色BJ-24中等漏斗形，红色圆柱形，中空，白色延生，等长，白色肉质白色BJ-25中等半球形，边缘上翘或下弯，米白色圆柱形，中空，浅褐色直生，等长，白色肉质白色BJ-26中等整体浅粉色，扫帚形向上膨大，具多分支无质脆白色BJ-27中等不规则形半圆，边缘很窄一圈为乳白色，紧贴基物生长，较难剥离，较薄，暗红色仅贴树杆生长，较短无革质白色BJ-28中等半圆形，具光泽，边缘下弯具波状，乳白色圆柱形，中空，乳白色菌管淡黄色肉质白色BJ-29中等扇形，表面光滑，边缘颜色稍淡，呈微小的波状，灰白色具有较小的菌柄，长在树干上延生，不等长，白色肉质白色BJ-30较小喇叭状，乳白色圆柱形，中空，乳白色延生，不等长，乳白色肉质白色表 3子实体形态特征Tab.3Morphology characteristics of fruit body杨雨等：贵州省毕节地区大型真菌资源调查及亲缘关系分析21中国食用菌耘阅陨月蕴耘 云哉晕郧陨 韵云 悦匀陨晕粤灾燥造援 42晕燥援4图 2PCR 产物电泳检测结果Fig.2Electrophoresis detection of PCR productsLSU样品号ITS 参考序列属种名BJ-1Russula vescaBJ-2Russula grisea参考物种 ITS序列登录号ITS 序列相似性/%MW722793.1100.00KX963792.196.72参考物种 LSU序列登录号LSU 序列相似性/%KX441240.198.40MW683730.195.75BJ-3Mycena puraMH141392.197.84MH141392.199.99BJ-4Russula flavidaAB154738.197.10MZ157246.199.77BJ-5Suillus bovinusKJ415102.197.75KT964641.199.78BJ-6Entoloma clypeatumJQ281479.199.53MK278030.199.10BJ-7Gymnopus dryophilusMW816514.188.37MW816514.185.86BJ-8Geastrum elegansKF988489.189.15KF988489.196.66BJ-9Russula sp.MH021612.198.39KX441240.198.19BJ-10Gymnopus peronatusAF223173.196.41MZ144156.199.56BJ-11Russula sp.MT505890.198.52KT933835.197.80BJ-12Lactarius chrysorrheusMK167433.199.12KF133293.198.90BJ-13Gymnopus dryophilusLT716055.198.83MW816504.191.63BJ-14Tylopilus neofelleusMK253785.180.18HQ326936.199.89BJ-15Gymnopus dryophilusMZ144150.199.87MH589984.197.59BJ-16Trametes sanguineaKC920825.198.15KY418902.199.67BJ-17Suillus phylopictusMK188416.199.84MK188400.199.78BJ-18Gymnopus dryophilusMW554237.1100.00MH589970.199.76BJ-19Lactifluus luteolusMZ622030.199.83JQ348267.199.20BJ-20Russula compactaMK167417.196.47KU237480.1100.00BJ-21Inocybe sp.OM473363.193.54AM882921.197.49BJ-22Lycoperdon perlatumMH142018.189.24MG712376.199.78BJ-23Suillus luteusMW554337.192.73MN250176.194.25BJ-24Russula roseaMT555414.183.38AB154751.199.32BJ-25Gymnopus dryophilus var.MW554237.188.41MH589983.1100.00BJ-26Artomyces pyxidatusKR673584.184.77MG696604.199.57BJ-27Hymenochaete porioidesMK268974.1100.00MK268974.199.62BJ-28Suillus placidusKM882921.199.69KU721389.199.89BJ-29Pleurotus pulmonariusOL455065.1100.00MH395998.199.77BJ-30Singerocybe alboinfundibuliformisMW554310.199.85MG712341.199.40ITS表 4采集样品在 NCBI 中的比对结果Tab.4Comparison results of collected samples in NCBI123456789101112131415161718192021222324252627282930M123456789101112131415161718192021222324252627282930M22第 42 卷第 4 期王彤等：美味牛肝菌药用价值及产品开发现状如表 4 所示，选择不同的保守区段进行比对，比对结果会存在一定的差异。除少数样品与参考种属于不同种外，大部分样品的 ITS 与 LSU 保守区与NCBI 中近缘物种的序列相似度相差不大。说明大多数样品与参考种为同一个属的相同种或不同种。暗示利用 ITS 与 LSU 序列进行分子生物学鉴定具有较高的可靠性。为便于分析，后续以 ITS 序列构建系统发育树。2.5不同样品亲缘关系分析以 ITS 保守序列为参考，用 MEGA 7 软件构建30 份样品的系统发育树，结果详见图 3。如图 3 的系统发育树所示，BJ-12 与黄汁乳菇（Lactarius chrysorrheus MK167433.1）以 99%的支持率聚为一支，BJ-19 与淡黄乳菇（Lactifluus luteolusMZ622030.1）以 100%的支持率聚为一支，且它们与参考物种 ITS 序列的相似性均高达 99%，即认为它们与参考菌株属于同种。BJ-17 和 BJ-28 以 99%的支持率聚为一支，推测这 2 个样品可能为同一种。BJ-23 与 褐 环 乳 牛 肝 菌（Suillus luteus.MW554337.1）以 96%的支持率聚为一支，且二者ITS 序列相似性为 92.73%，推测 BJ-23 属于乳牛肝菌的一种。BJ-19MZ622030.1 Lactifluus luteolusKR364115.1 Lactifluus rubrobrunnescensKT165286.1 Lactarius chrysorrheusMW722807.1 Lactarius sp.MK167433.1 Lactarius chrysorrheusBJ-12MZ133621.1 Lactifluus hygrophoroidesMK430041.1 Lactifluus hygrophoroidesMT555414.1 Russula roseaBJ-24BJ-9MH021612.1 Russula sp.MT505890.1 Russula sp.KX963792.1 Russula griseaBJ-2BJ-20MK167417.1 Russula compactaBJ-11BJ-4AB154738.1 Russula flavidaBJ-1MW722793.1 Russula vescaBJ-14MK253785.1 Tylopilus neofelleusKM882921.1 Suillus placidusKJ415102.1 Suillus bovinusBJ-5MK188416.1 Suillus phylopictusBJ-28BJ-17MW554337.1 Suillus luteusBJ-23MW816514.1 Gymnopus dryophilusBJ-7OL891463.1 Gymnopus dryophilusBJ-18MW554237.1 Gymnopus dryophilusBJ-15MZ144150.1 Gymnopus dryophilusBJ-13LT716055.1 Gymnopus dryophilusBJ-25MW554237.1 Gymnopus dryophilus var.MK512075.1 Gymnopus sp.BJ-10AF223173.1 Gymnopus peronatusMK268974.1 Hymenochaete porioides.LC533316.1 Entoloma clypeatumBJ-6JQ281479.1 Entoloma clypeatumKC582013.1 Geastrum elegansBJ-8KF988489.1 Geastrum elegansBJ-22MH142018.1 Lycoperdon perlatumDQ112575.1 Lycoperdon lambinoniiBJ-16KC920825.1 Trametes sanguineaBJ-30MW554310.1 Singerocybe alboinfundibuliformisBJ-26KR673584.1 Artomyces pyxidatusKR673580.1 Mycena rosellaBJ-21OM473363.1 Inocybe sp.OL455065.1 Pleurotus pulmonariusBJ-29BJ-27MK268974.1 Hymenochaete porioidesMW742520.1 Hymenochaete porioidesBJ-3MH141392.1 Mycena pura1001001009924439999999653792988100999810085304535991001009659548757100100989610010090989999100100100709810010010010099956962565922b.红菇属样品聚类图e.其他属样品聚类图d.裸脚伞属样品聚类图a.乳菇属样品聚类图c.牛肝菌类样品聚类图图 3基于 ITS 序列构建的系统发育树Fig.3Phylogenetic tree based on ITS sequence杨雨等：贵州省毕节地区大型真菌资源调查及亲缘关系分析23中国食用菌耘阅陨月蕴耘 云哉晕郧陨 韵云 悦匀陨晕粤灾燥造援 42晕燥援4BJ-1 菱红菇（Russula vesca）BJ-2 灰红菇（Russula grisea）BJ-3 洁小菇（Mycena prua）BJ-4 姜黄红菇（Russula flavida）BJ-5 黏盖乳牛肝菌（Suillus bovinus）BJ-6 盾状粉褶蕈（Entolomaclypeatum）BJ-7 栎裸脚伞（Gymnopus dryophilus）BJ-8 地星（Geastrum elegans）BJ-9 红菇（Russula sp.）BJ-10 靴状裸脚伞（Gymnopus peronatus）BJ-11 红菇（Russula sp.）BJ-12 黄汁乳菇（Lactarius chrysorrheus）从裸脚伞属样品聚类图可知，BJ-15 与栎裸脚伞（Gymnopus dryophilus MZ144150.1）以 99%的支持 率 聚 为 一 支，BJ-18 与 栎 裸 脚 伞（Gymnopusdryophilus MW554237.1）以 100%的支持率聚为一支，且二者与参考物种 ITS 序列的相似性都高于99%，因此推测他们同属栎裸脚伞菌。BJ-1 与菱红菇（Russula vesca MW722793.1）、BJ-2 与灰红菇（Russula grisea KX963792.1）、BJ-4 与 姜 黄 红 菇（Russula flavida AB154738.1）、BJ-20 与致密红菇（Russula compacta MK167417.1）都以 100%的支持率聚为一支，因此推测其分别为菱红菇、灰红菇、姜黄红菇和致密红菇。BJ-24 与玫瑰红菇（Russularosea MT555414.1）以 95%的支持率聚为一支，但二者 ITS 序列的相似性仅为 83.38%，推测其为红菇属的不同种。从其他属样品的聚类图可以看出，BJ-6、BJ-26、BJ-27、BJ-29 及 BJ-30 这 5 份样品均与比对样品亲缘关系较近，可认为它们跟比对样品为同种菌。BJ-30 与白漏斗辛格杯伞（Singe原rocybe alboinfundibuliformis MW554310.1）以 100%的支持率聚为一支，故可推测其同属于辛格杯伞属（Singerocybe）。BJ-16 与血红栓菌（Trametes san原guinea KC920825.1）以 98%的支持率 聚为一 支，BJ-21 与丝盖伞（Inocybe sp.OM473363.1）以 96%的支持率聚为一支，BJ-22 与网纹马勃（Lycoperdonperlatum MH142018.1）以 96%的支持率聚为一支，说明三者与参考物种可能为同属的不同种菌株25。2.6大型真菌鉴定结果通过形态学和分子生物学相结合的方法对所采集的样品进行鉴定，最终确定了 30 份样品的分类学地位，其子实体形态特征及鉴定结果详见图 4。24第 42 卷第 4 期王彤等：美味牛肝菌药用价值及产品开发现状图 4大型真菌子实体形态特征Fig.4Morphological characteristics of fruit body of macrofungiBJ-13 栎裸脚伞（Gymnopus dryophilus）BJ-14 苦粉孢牛肝菌（Tylopilusneofelleus）BJ-15 栎裸脚伞（Gymnopus dryophilus）BJ-28 乳牛肝菌（Suillus sp.）BJ-29 肺形侧耳（Pleurotus pulmonarius）BJ-30 白漏斗辛格杯伞（Singerocybe alboinfundibuliformis）BJ-16 血红栓菌（Trametes sanguinea）BJ-17 乳牛肝菌（Suillus sp.）BJ-18 栎裸脚伞（Gymnopus dryophilus）BJ-19 淡黄乳菇（Lactarius luteolus）BJ-20 致密红菇（Russula compacta）BJ-21 丝盖伞（Inocybe sp.）BJ-22 网纹马勃（Lycoperdon perlatum）BJ-23 乳牛肝菌（Suillus sp.）BJ-24 红菇（Russula sp.）BJ-25 裸脚伞（Gymnopus sp.）BJ-26 杯冠瑚菌（Artomyces pyxidatus）BJ-27 锈革菌（Hymenochaete porioides）杨雨等：贵州省毕节地区大型真菌资源调查及亲缘关系分析25中国食用菌耘阅陨月蕴耘 云哉晕郧陨 韵云 悦匀陨晕粤灾燥造援 42晕燥援42.7不同样品分类统计分析根据鉴定结果，参照参考文献 20-21 对样品的种属关系进行了统计分析，结果详见图 5 和表 5。如图 5 和表 5 所示，所采集的大型真菌样品分属于 2 门 2 纲 5 目 13 科 15 属。所有样品中，伞菌目占比最高，约占总数的 53.3%；其次是红菇目，占总数的 30.0%；而地星目和蘑菇目数量最少，都约占总数的 3.3%。3结论与讨论贵州毕节地区生物资源丰富，物种类型多样，森林覆盖率高（最高可达 48.04%），适宜栽培多种食用菌，素有竹荪（Dictyophora indusiata）和天麻（Gastrodia elata）之乡的美称26。调查表明，该地区植被主要包括杉木、马尾松、鳞毛 蕨类（Dry原opteris）、马桑、青冈（Cyclobalanopsis glauca）等树种，为大型真菌的生长提供了良好的生存环境，生境的多样性造就了大型真菌物种的多样性27-28。本试验分批对毕节部分地区的大型真菌进行随机采样调查，共收集到大型真菌资源 30 份。其中大多数样品着生于腐质土壤中，仅 BJ-29 着生于立木上。通过形态学比较发现，除 BJ-30 外大多数样品子实体为中等大小；菌盖的形状多为平展形、漏斗形和半球形，部分中间略向下凹陷；菌柄多为圆柱形中空状；菌肉多为肉质白色。依据菌盖、菌柄等特征对样品进行了初步鉴定，再对各样品的 ITS 和 LSU序列进行 PCR 扩增、序列比对，结合系统发育分析结果，最终确定 30 份样品隶属于 2 门 2 纲 5 目 13科 15 属29。从科学水平来看，红菇科（Russulaceae）样品的占比最多，达 30%，这与张洁7等对毕节野生大型经济真菌的调查结果类似。说明毕节地区的生境适宜红菇科真菌生长，可将其作为毕节地区食用菌开发的潜在物种。红菇属（Russula）、牛肝菌类以及裸脚伞属（Gymnopus）样品各有 5 份，约占总数的 16.6%；而侧耳属（Pleurotus）、马勃属（Lycoper原don）、锈革菌属（Hymenochaete）等均只采集到 1份样品，都占总数的 3.3%。通过 ITS 和 LSU 序列比对发现，尽管同一样品以不同保守区