海洋真菌Fusarium sp.HL21活性次级代谢产物研究.pdf

.879.文章编号：1001-8689(2023)08-0879-06收稿日期：2023-01-31基金项目：国家自然科学基金项目(No.32022002；No.32170067)作者简介：杨骁，男，生于1994年，在读硕士研究生，主要研究方向为真菌次级代谢产物分离，E-mail:。*通信作者：刘玲，E-mail:；徐利剑，E-mail:海洋真菌Fusarium sp.HL21活性次级代谢产物研究杨骁1 任晋玮2 徐利剑1,*刘玲2,*(1 黑龙江大学 现代农业与生态环境学院，哈尔滨 150080；2 中国科学院微生物研究所 真菌学国家重点实验室，北京 100101)摘要：目的 研究海洋真菌Fusarium sp.HL21的次级代谢产物及其抗菌活性。方法 采用硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析及半制备高效液相色谱等方法，对该菌株发酵产物分离纯化；后通过核磁共振波谱(NMR)和质谱(MS)等方法并比对相关文献，鉴定化合物结构；采用96孔板微量肉汤稀释法和孢子萌发法评价其抗细菌和抗真菌活性。结果 从该菌株中分离鉴定了8个化合物，分别为plancyin G(1)、吲哚-3-乙醛酸甲酯(2)、吲哚-3-乙酸(3)、丁二酸二甲酯(4)、阿魏酸(5)、gibepyrone F(6)、6-(2S,3S)-2,3-二羟基-2-丁醇基)-3-甲基-2-吡喃酮(7)和6-(2R,3S)-2,3-二羟基-2-丁醇基)-3-甲基-2-吡喃酮(8)。结论 化合物5、7和8对青枯劳尔菌BXL018、甘蓝黑腐病菌BLY013和辣椒青枯病菌BLY014表现出一定的抑菌活性。关键词：海洋真菌；次级代谢产物；抗细菌活性；农用抗生素中图分类号：R978.1 文献标志码：ABioactive secondary metabolites from the marine-derived fungus Fusarium sp.HL21Yang Xiao1,Ren Jinwei2,Xu Lijian1,and Liu Ling2(1 College of Modern Agricultural and Ecological Environment,Heilongjiang University,Harbin 150080;2 State Key Laboratory of Mycology,Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101)Abstract Objective To investigate the secondary metabolites from a marine-derived fungus Fusarium sp.HL21 and their antifungal and antibacterial activities.Methods Silica gel chromatography,Sephadex LH-20 gel column chromatography and Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography(RP HPLC)were used to isolate and purify the secondary metabolites from the fermented crude extract of the fungus Fusarium sp.HL21.The structures of the isolated compounds were elucidated by comparing the NMR and MS spectroscopic data with those of literatures.The antibacterial and antifungal activities were evaluated by the 96-well plate broth microdilution method and spore germination assay,respectively.Results Eight compounds were isolated and identified as plancyin G(1),(1H-indol-3-yl)oxoacetic acid methyl ester(2),3-indole acetic acid(3),diethyl succinate(4),ferulic acid(5),gibepyrone F(6),6-(2S,3S)-2,3-dihydroxybutan-2-yl)-3-methyl-2H-pyran-2-one(7)and 6-(2R,3S)-2,3-dihydroxybutan-2-yl)-3-methyl-2H-pyran-2-one(8).Conclusion Compounds 5,7 and 8 exhibited moderate antibacterial activities against Ralstonia solanacearum BXL018,Xanthomonas campestris pv.campestris BLY013 and Ralstonia solanacearum BLY014.Key words Marine-derived fungi;Secondary metabolites;Antibacterial activity;Agricultural antibiotics微生物药物筛选 中国抗生素杂志2023年8月第48卷第8期.880.海洋真菌Fusarium sp.HL21活性次级代谢产物研究 杨骁等细菌作为主要的植物病原之一，其寄主范围广泛，能够在许多作物上造成植物病害1，它通过寄生于植物组织或表面，引起细菌性病害导致作物品质下降和产量减少。据统计，每年全球因细菌病害导致的产业链损失高达10亿美元2，伴随着真菌、病毒、卵菌等病原的共同为害，严重地威胁了农业食品安全。近年来农药的滥用，环境的压力以及水平基因转移，导致病原菌的抗药性不断提升，因此新型抗生素的研发工作也应不断推进。在当今农业病害防治中，化学农药依旧是主要防治手段，其中天然产物及其衍生物占据了目前销售农药的半数以上3-4，同时也是新型农药研发的重要来源之一。海洋真菌因生存于高盐、高压、低温、缺氧等极端环境，从而产生独特的代谢途径和交流机制5，在与这样特殊环境的交流互作下，海洋真菌能够产生种类多样、结构新颖并且活性良好的次级代谢产物6-9，是活性天然产物的重要来源。海洋镰刀属真菌的代谢产物种类丰富，能够产生如聚酮、生物碱、肽、醌等结构多样的活性次级代谢产物10，是重要的海洋真菌资源。本研究从浙江舟山东海水域的瓜螺卵内获得一株内生真菌Fusarium sp.HL21，从其大米发酵产物中分离得到8个化合物，通过波谱数据与文献比对，鉴定为plancyin G(1)、吲哚-3-乙醛酸甲酯(2)、吲哚-3-乙酸(3)、丁二酸二甲酯(4)、阿魏酸(5)、gibepyrone F(6)、6-(2S,3S)-2,3-二羟基-2-丁醇基)-3-甲基-2-吡喃酮(7)和6-(2R,3S)-2,3-二羟基-2-丁醇基)-3-甲基-2-吡喃酮(8)，并对其体外抗菌活性进行评估。化合物18化学结构如图1所示。1 材料与方法1.1 主要仪器与试剂霉菌培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；超净工作台(北京亚太科隆仪器技术有限公司)；旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)；高速离心机(美国Sigma公司)；高压灭菌锅(日本Hirayama公司)；SpectraMax多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司)；Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；Anton Paar MCP 200旋光仪(澳大利亚Anton Paar公司)；Bruker-500核磁共振仪(德国Bruker公司)；Agilent 6520液相质谱仪(美国Agilent公司)；柱层析硅胶(1040 m，200300目，青岛海洋化工有限公司)；ODS反相硅胶填料(50 m，日本YMC公司)；葡聚糖凝胶Sephadex LH-20(瑞典Amersham公司)；Reprosil-Pur Basic-C18分析色谱柱(150 mm4.6 mm，5 m，德国Dr.Maisch公司)；YMC制备反相色谱柱(250 mm 10 mm，5 m，日本YMC公司)。甲醇、二氯甲烷、无水乙醇、乙酸乙酯、石油醚与丙酮(分析纯，北京化工厂)；甲醇与乙腈(色谱纯，德国Emoon公司)；金霉素(批号：CC30112008，北京酷来搏科技有限公司)；百菌清(批号：H06M10Z82093，上海源叶生物科技有限公司)；二甲基亚砜(批号：BA03114377，北京博奥森生物技术有限公司)。1.2 实验方法1.2.1 菌株来源与分子鉴定试验菌株HL21分离自浙江舟山东海水域的瓜螺图1 化合物18的化学结构Fig.1 Chemical structures of compounds 18.881.卵，现保存于中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室。使用CTAB法11提取DNA，使用ITS1/ITS4通用引物12，扩增菌株ITS(Internal transcribed spacer region)基因序列，送至擎科生物科技公司完成测序。测序结果通过BLAST工具(https:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对确定最相近分类单元，并结合形态学鉴定确定菌株分类地位。1.2.2 菌株发酵菌株接种至PDA培养基(土豆20%，葡萄糖2%，琼脂2%，蒸馏水配置)放置于霉菌培养箱中28 培养7 d，在超净工作台中切取34块0.5 cm2菌块接种于灭菌种子液中(葡萄糖0.4%，酵母提取物0.4%，麦芽提取物1%，蒸馏水配制)，28 恒温摇床200 r/min培养3 d获得种子液。将获得的种子液按照每瓶10 mL的接种量接种至装有灭菌大米固体培养基(大米80 g，蒸馏水120 mL)的100个500 mL锥形瓶中，28 恒温静置避光发酵30 d。1.2.3 化合物分离与纯化发酵产物经乙酸乙酯(EtOAc)萃取3次后，获得乙酸乙酯萃取浸膏(40.0 g)。浸膏通过正相硅胶柱层析分离，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱(体积比20:10:1)，后用100%甲醇洗脱，得到11个馏分(Fr.1Fr.11)。Fr.9(石油醚-乙酸乙酯，体积比1:2)(2.8 g)使用ODS反相柱层析，甲醇-水(体积比1:41:0)梯度洗脱，分析合并获得7个馏分(Fr.9.1Fr.9.7)，其中Fr.9.2(甲醇-水，1:33:7)(27.5 mg)经过半制备高效液相色谱(HPLC)(乙腈-0.1%甲酸水，体积比43:57，2.0 mL/min)得到化合物1(4.0 mg，tR=12.0 min)。Fr.4(石油醚-乙酸乙酯，体积比10:1)(2.3 g)经过正相硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱(体积比20:10:1)，后用100%甲醇洗脱，分析合并获得8个馏分(Fr.4.1Fr.4.8)，其中Fr.4.5(石油醚-乙酸乙酯，体积比6:1)(0.3 g)经半制备HPLC(甲醇-0.1%甲酸水，体积比45:55，2.0 mL/min)得到化合物2(1.5 mg，tR=44.0 min)。Fr.7(石油醚-乙酸乙酯，体积比4:1)(3.2 g)经过正相硅胶柱层析，石油醚-二氯甲烷-甲醇梯度洗脱(体积比10:1:00:0:1)获得11个馏份(Fr.7.1Fr.7.11)，其中Fr.7.7(石油醚-二氯甲烷，体积比5:1)(476.5 mg)经过半制备HPLC(甲醇-0.1%甲酸水，体积比36:64，2.0 mL/min)获得化合物3(4.0 mg，tR=22.0 min)和5(3.5 mg，tR=20.0 min)。Fr.5(石油醚-乙酸乙酯，体积比8:1)(1.3 g)，经过石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱(体积比15:10:1)，后用100%甲醇洗脱共获得8个馏份(Fr.5.1Fr.5.8)，其中Fr.5.2(石油醚-乙酸乙酯，体积比12:1)(300.3 mg)经过半制备HPLC(甲醇-0.1%甲酸水，体积比43:57，2.0 mL/min)获得化合物4(10.0 mg，tR=20.0 min)。Fr.1(石油醚-乙酸乙酯，体积比20:1)(200 mg)，经过半制备HPLC(甲醇-0.1%甲酸水，体积比30:70，2.0 mL/min)获得化合物6(20.0 mg，tR=18.6 min)，7(5.0 mg，tR=19.6 min)和8(3.1 mg，tR=22.6 min)。1.2.4 抗细菌活性实验抗细菌活性采用微量肉汤稀释法13，评估化合物对4种病原细菌的活性。供试菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌8325-4(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)，青枯劳尔菌(Ralstonia solanacearum BXL015)，甘蓝黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris BLY013)和辣椒青枯病菌(Ralstonia solanacearum BLY014)。在96孔板内第1列加入1.6 L的8 mg/mL待测化合物母液和198.4 L接种了细菌(1106 CFU/mL)的LB培养基(蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化钠1%)，在96孔板内倍比稀释，获得化合物终浓度为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125 g/mL，相同处理的金霉素和DMSO，分别为阳性对照和阴性对照，不接菌的LB为空白对照，重复3次。在37 培养24 h后观察96孔板菌液浑浊程度，培养液清澈的最小浓度为该化合物的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)。1.2.5 孢子萌发实验实验使用孢子萌发法14，评价分离获得的化合物对病原真菌孢子萌发的活性。供试菌为灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea FLY006)与链格孢菌(Alternaria alternata LW37)。用含葡萄糖0.5%的无菌水冲洗病原菌培养基，通过4层灭菌纱布过滤获得孢子悬浮液并稀释至1106 个/mL。在96板内第一列加入3.2 L的 中国抗生素杂志2023年8月第48卷第8期.882.8 mg/mL待测化合物母液和196.8 L的孢子悬浮液，在96孔板内倍比稀释，获得化合物终浓度为128、64、32、16、8、4、2和1 g/mL，相同处理的百菌清和DMSO，分别为阳性对照和阴性对照，含葡萄糖0.5%的无菌水为空白对照，重复3次。在28 培养 48 h后，在显微镜下观察并计数萌发的孢子，计算萌发率。2 实验结果2.1 菌株鉴定结果试验菌株通过BLAST比对ITS序列，确定与其最相近的菌株为Fusarium acutatum CBS 402.97(Genbank No.NR_111142.1)相似度为99.43%。结合形态学特征分析(图2)，将试验菌株HL21初步鉴定为Fusarium sp.，ITS序列上传至Genbank数据库(Genbank No.OQ236525)。2.2 化合物的结构鉴定化合物1：黄色固体，根据ESI-MS显示离子峰m/z 387.1 M+H+，结合1H NMR和13C NMR谱图数据推测其分子式为C20H18O8，显示有12个不饱和度。1H NMR(500 MHz，CD3OD)H:7.60(d，J=16.0 Hz，H-7)，7.43(d，J=1.7 Hz，H-2)，7.35(s，H-7)，7.31(d，J=1.7 Hz，H-2)，7.08(dd，J=8.3，1.7 Hz，H-6)，7.06(dd，J=8.3，1.7 Hz，H-6)，6.78(d，J=8.3 Hz，H-5)，6.74(d，J=8.3 Hz，H-5)，6.38(d，J=16.0 Hz，H-8)，3.97(s，H3-10)，3.70(s，H3-10)。13C NMR(125 MHz，CD3OD)C:170.8(C-9)，167.7(C-9)，150.5(C-3)，149.6(C-4)，149.4(C-4)，148.9(C-3)，146.0(C-7)，139.9(C-8)，130.4(C-1)，128.2(C-7)，126.2(C-6)，126.0(C-1)，123.2(C-6)，117.8(C-8)，116.2(C-5)，114.7(C-5)，113.8(C-2)，112.6(C-2)，56.7(C-10)，56.0(C-10)。综上数据比对参考文献15，确定化合物1为plancyin G。化合物2：黄色粉末，根据ESI-MS显示离子峰m/z 204.1 M+H+，结合1H NMR和13C NMR谱图数据推测其分子式为C11H9NO3，显示有8个不饱和度。1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)H:8.44(s，H-2)，8.15(dd，J=7.2，1.5 Hz，H-4)，7.54(dd，J=7.2，1.5 Hz，H-7)，7.29(td，J=7.2，1.5 Hz，H-6)，7.27(td，J=7.2，1.5 Hz，H-5)，3.89(s，H3-10)。13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)C:178.7(C-8)，164.0(C-9)，138.5(C-7a)，136.8(C-2)，125.5(C-3a)，123.8(C-6)，122.8(C-5)，121.1(C-4)，112.8(C-3)，112.4(C-7)，52.5(C-10)。综上数据与参考文献16比对，确定化合物2为吲哚-3-乙醛酸甲酯。化合物3：棕色固体，根据ESI-MS显示离子峰m/z 176.0 M+H+，结合1H NMR和13C NMR谱图数据推测其分子式为C10H9NO2，显示有7个不饱和度。1H NMR(500 MHz，CD3OD)H:7.54(d，J=8.0 Hz，H-4)，7.34(d，J=8.0 Hz，H-7)，7.16(s，H-2)，7.10(td，J=8.0，1.2 Hz，H-6)，7.01(td，J=8.0，1.2 Hz，H-5)，3.73(s，H2-8)。13C NMR(125 MHz，CD3OD)C:176.6(C-9)，138.0(C-7a)，128.7(C-3a)，124.6(C-2)，122.4(C-6)，119.8(C-5)，119.5(C-4)，112.2(C-7)，109.0(C-3)，32.1(C-8)。查阅文献17比对数据，确定化合物3为吲哚-3-乙酸。化合物4：黄色油状，根据ESI-MS显示离子峰m/z 175.2 M+H+，但1H NMR和13C NMR谱图数据显示只有4个碳信号，7个氢信号，确定其为对称结构，分子式为C8H14O4，显示有2个不饱和度。1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)H:4.04(q，J=7.0 Hz，H2-2，H2-7)，2.47(overlap，H2-4，H2-5)，1.16(t，J=7.0 Hz，H3-1，H3-8)。13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)C:172.1(C-3，C-6)，59.9(C-2，C-7)，28.8(C-4，C-5)，14.1(C-1，C-8)。比对参考文献18图2 HL21的形态学图片(显微图片标尺为20 m)Fig.2 The morphology of HL21(scale bar is 20 m)小孢子大孢子瓶梗结构菌落正(左)反(右)面图片一株海洋真菌Fusarium sp.HL21活性次级代谢产物研究 杨骁等.883.的数据，可确定化合物4为丁二酸二甲酯。化合物5：黄色粉末，根据ESI-MS显示离子峰m/z 195.1 M+H+，结合1H NMR和13C NMR谱图数据推测其分子式为C10H10O4，显示有6个不饱和度。1H NMR(500 MHz，CD3OD)H:7.56(d，J=16.0 Hz，H-7)，7.17(d，J=2.0 Hz，H-2)，7.05(dd，J=8.0，2.0 Hz，H-6)，6.80(d，J=8.0 Hz，H-5)，6.31(d，J=16.0 Hz，H-8)，3.89(s，H3-10)。13C NMR(125 MHz，CD3OD)C:150.4(C-3)，149.4(C-4)，146.6(C-7)，127.9(C-1)，123.9(C-6)，116.6(C-5)，116.4(C-8)，111.6(C-2)，56.4(C-10)。综合数据和参考文献19比对，可以确定化合物5为阿魏酸。化合物6：无色油状，根据ESI-MS显示离子峰m/z 153.1M+H+，结合1H NMR和13C NMR谱图数据推测其分子式为C8H8O3，显示有5个不饱和度。1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)H:7.52(dd，J=6.8，1.1 Hz，H-4)，7.14(d，J=6.8 Hz，H-5)，2.42(s，H3-8)，2.07(d，J=1.1 Hz，H3-9)。13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)C:190.5(C-7)，161.0(C-2)，152.3(C-6)，138.8(C-4)，130.8(C-3)，109.3(C-5)，25.6(C-8)，16.9(C-9)。与参考文献20比对，确定化合物6为gibepyrone F。化合物7：黄色油状，+13.0(c 0.1，MeOH)，根据ESI-MS显示离子峰m/z 199.1 M+H+，结合1H NMR和13C NMR谱图数据推测其分子式为C10H14O4，显示有4个不饱和度。1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)H:7.34(dd，J=6.8，1.1 Hz，H-4)，6.32(d，J=6.8 Hz，H-5)，5.10(s，8-OH)，4.60(brs，7-OH)，3.74(m，H-8)，1.95(s，H3-9)，1.24(s，H3-10)，1.02(d，J=6.5 Hz，H3-11)。13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)C:167.3(C-6)，162.9(C-2)，140.5(C-4)，121.1(C-3)，101.6(C-5)，75.2(C-7)，70.6(C-8)，22.7(C-10)，17.1(C-11)，16.2(C-9)。综上数据与参考文献21比对，确定化合物7的结构为6-(2S,3S)-2,3-二羟基-2-丁醇基)-3-甲基-2-吡喃酮。化合物8：黄色油状，+7.0(c 0.1，MeOH)，根据ESI-MS显示离子峰m/z 199.1 M+H+，结合1H NMR和13C NMR谱图数据推测其分子式为C10H14O4，显示有4个不饱和度。1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)H:7.34(dd，J=6.8，1.2 Hz，H-4)，6.31(d，J=6.8 Hz，H-5)，5.19(brs，8-OH)，4.67(brs，7-OH)，3.72(m，H-4)，1.95(s，H3-9)，1.31(s，H3-10)，0.96(d，J=6.5 Hz，H3-11)。13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)C:167.1(C-6)，162.7(C-2)，140.5(C-4)，121.3(C-3)，101.4(C-5)，74.6(C-7)，70.3(C-8)，21.9(C-10)，17.5(C-11)，16.1(C-9)。与参考文献21比对，确定化合物8的结构为6-(2R,3S)-2,3-二羟基-2-丁醇基)-3-甲基-2-吡喃酮。2.3 抗菌活性结果在抑制孢子萌发活性实验中，化合物在最高浓度128 g/mL下均未表现出明显的萌发抑制作用。而抗细菌实验结果表明化合物5、7和8对甘蓝黑腐病菌和辣椒青枯病菌具有抑菌活性，MIC值均为 64 g/mL，阳性对照金霉素MIC值分别为0.25和 0.5 g/mL。此外，化合物5还对青枯劳尔菌有一定的抑菌活性，MIC值为64 g/mL，阳性对照金霉素的MIC值为2 g/mL。3 讨论与结论本文对舟山水域瓜螺卵来源的真菌Fusarium sp.HL21进行次级代谢产物研究，分离获得8个化合物，其中1为少见的norlignan类化合物，目前仅报道过肾纤维化治疗的研究内容16。化合物2和3为吲哚类生物碱，化合物2对KB细胞系具有细胞毒活性22，而化合物3作为植物生长激素成分，在调节植物的生长与分化中具有重要作用，并具有抑制根癌农杆菌活性23。化合物4为琥珀酸衍生物，具有一定的免疫抑制活性24。化合物5为肉桂酸衍生物，对黑曲霉、黄曲霉以及金黄葡萄球菌具有抑制活性25-26。68为吡喃-2-酮类化合物，化合物6未表现抗菌活性，但是其C-6侧链变化的衍生物gibepyrones A和B却具有抗金黄葡萄球菌，枯草芽胞杆菌以及白色念珠菌活性27，化合物7和8未见抗菌活性研究。本研究首次从镰刀属真菌中分离获得化合物1、2和4，并且首次报道了化合物5、7和8对甘蓝黑腐病菌和辣椒青枯病菌的体外抑菌活性，此外还发现化合物5对青枯劳尔菌具有一定抑菌活性。本研究不仅丰富了镰刀菌属天然产物结构多样性，同时为新型农用抗生素的研发奠定一定基础。致谢：感谢浙江大学吴斌教授为本研究提供菌株。中国抗生素杂志2023年8月第48卷第8期.884.参 考 文 献1 Strange R N,Scott P R.Plant disease:a threat to global food securityJ.Annu Rev Phytopathol,2005,43(1):83-116.2 Mansfield J,Genin S,Magori S,et al.Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathologyJ.Mol Plant Pathol,2012,13(6):614-629.3 Cantrell C L,Dayan F E,Duke S O.Natural products as sources for new pesticidesJ.J Nat Prod,2012,75(6):1231-1242.4 Lorsbach B A,Sparks T C,Cicchillo R M,et al.Natural products:A strategic lead generation approach in crop protection discoveryJ.Pest Manag Sci,2019,75(9):2301-2309.5 Gladfelter A S,James T Y,Amend A S.Marine fungiJ.Curr Biol,2019,29(6):R191-R195.6 Xu L J,Meng W,Cao C,et al.Antibacterial and antifungal compounds from marine fungiJ.Mar Drugs,2015,13(6):3479-3513.7 逯佩玉,贾佳,毕洪凯,等.1株海洋真菌Aspergillus 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