DB22∕T 2915-2018 供血犬血液检测技术要求(吉林省).pdf

ICS 11.220 B 41 DB22 吉林省地方标准 DB 22/ T 29152018 供血犬血液检测技术要求 Technical request for canine blood detection 2018 - 11 - 12 发布 2018 - 12 - 30 实施吉林省市场监督管理厅 发 布 DB22/T 29152018 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。 本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。 本标准起草单位：长春工业大学、长春西诺生物科技有限公司。 本标准主要起草人：殷玉和、石晶、罗国良、吴丛梅、高冷、刘伟、陈宪平。 DB22/T 29152018 1 供血犬血液检测技术要求 1 范围 本标准规定了供血犬血液的术语和定义、技术要求和检测方法。 本标准适用于供血犬血液的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 中华人民共和国兽药典2015版三部 中华人民共和国药典2015版四部 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 供血犬 canine for blood 提供血源来源的健康犬。 3.2 犬血制品 canine blood products 以供血犬血液为原料，采用生物学工艺或分离纯化技术制备的生物活性制剂。 3.3 犬血清 canine serum 供血犬血液凝固后，在血浆中除去纤维蛋白原，分离出的淡黄色澄明液体。 4 技术要求 4.1 性状 4.1.1 供血犬血液 应为鲜红色或暗红色混悬、黏稠液体。 4.1.2 犬血清 应为淡黄色或黄色澄明液体，无溶血、无乳糜及可见异物。 4.2 犬血清 pH 值 应为7.28.2。 4.3 犬血清渗透压摩尔浓度 应为210 mOsmol/k g 400 mOsmol/kg。 DB22/T 29152018 2 4.4 犬血清细菌内毒素含量 应小于 10 EU/mL。 4.5 犬血清蛋白质含量 应不低于 50.0 mg/mL。 4.6 犬血清外源病毒 致细胞病变检查、 红细胞吸咐检测应为阴性， 荧光抗体检查犬瘟热病毒 （CDV） 、 狂犬病病毒 （RABV） 、犬腺病毒（CAV）和犬细小病毒（CPV）均应为阴性。 5 检测方法 5.1 性状检查 视觉感官观察。 5.2 pH 值测定 将供血犬血液分离出血清，按照附录 A 测定。 5.3 渗透压摩尔浓度测定 将供血犬血液分离出血清，按照附录 B 测定。 5.4 细菌内毒素含量检测 将供血犬血液分离出血清，按照附录 C 测定。 5.5 蛋白质含量检测 将供血犬血液分离出血清，按照附录 D 测定。 5.6 外源病毒检测 将供血犬血液分离出血清，按照附录 E 测定。 DB22/T 29152018 3 附 录 A （规范性附录） pH 值测定 A.1 检测方法 检验依据 2015版中华人民共和国兽药典三部附录3101。 A.2 实验物品 A.2.1 仪器 酸度计，应以玻璃电极为指示电极，饱和甘汞电极为参比电极的酸度计进行测定。 A.2.2 校正用标准缓冲液 A.2.2.1 磷酸盐标准缓冲液，pH 6.86（25 ） 。 A.2.2.2 硼砂标准缓冲液，pH 9.18 （25 ） 。 A.3 实验操作 A.3.1 样品测定前，取校正用缓冲液对仪器进行校正,见表A.1，使仪器示值与表列数值一致。 A.3.2 仪器校正后，用硼砂标准缓冲液核对仪器示值，误差应不大于0.02 pH值单位。如果大于此偏差，则应小心调节斜率，使示值与第二种标准缓冲液的表列数值相符。重复上述定位与斜率调节操作，至仪器示值与标准缓冲液的规定数值相差不大于0.02 pH值单位。 A.3.3 样品应置小烧杯中，取样后应当立即测定，以免空气中的CO2影响测定结果。 A.3.4 每次更换检测样品时，应用纯化水充分洗涤电极，然后将水吸尽。 表A.1 不同温度标准缓冲液 pH 值对照表 温度（） 磷酸盐标准缓冲液 硼砂标准缓冲液 0 6.98 9.64 5 6.95 9.40 10 6.92 9.33 15 6.90 9.28 20 6.88 9.23 25 6.86 9.18 30 6.85 9.14 35 6.84 9.10 DB22/T 29152018 4 A.4 结果判定 供血犬血液血清pH值应为7.28.2，在此范围判定为合格，超出此范围判为不合格。 DB22/T 29152018 5 A B 附 录 B （资料性附录） 渗透压摩尔浓度测定 B.1 检测方法 检验依据根据2015版中华人民共和国药典四部通则0632。 B.2 实验物品 B.2.1 仪器 渗透压摩尔浓度测定仪。 B.2.2 校正用标准缓冲液 取基准氯化钠试剂，于 500 650 干燥 40 min50 min，置干燥器（硅胶）中放冷至室温。根据需要按表 B.1中所列数据精密称取适量，溶于 1 kg 水中，摇匀，即得。 表B.1 渗透压摩尔浓度测定仪校正用标准溶液 每 1 kg 水中氯化钠的重量/g 毫渗透压摩尔浓度/mOsmol/kg 冰点下降温度/T/ 3.087 100 0.186 6.260 200 0.372 9.463 300 0.558 12.684 400 0.744 15.916 500 0.930 19.147 600 1.116 22.380 700 1.302 B.3 实验操作 取适量新沸放冷的水调节仪器零点， 由表中选择两种标准溶液 （供试品溶液的渗透压摩尔浓度应介于两者之间）校正仪器，再测定供试品溶液的渗透压摩尔浓度或冰点下降值。 B.4 结果判定 供血犬血液血清部分渗透压摩尔浓度应为210 mOsmol/kg400 mOsmol/kg，在此范围判定为合格，超出此范围判为不合格。 DB22/T 29152018 6 B C 附 录 C （规范性附录） 细菌内毒素检验操作规程 C.1 检测方法 检验依据2015版中华人民共和国兽药典第一部附录1143。 C.2 试剂 C.2.1 鲎试剂 灵敏度0.125 EU/支，2 8 保存，有效期为 12 个月。 C.2.2 细菌内毒素工作标准品（CSE） 系细菌内毒素工作标准品中每1 ng细菌内毒素的效价不小于2 EU，不大于50 EU。 C.2.3 细菌内毒素检查用水 系指与灵敏度为 0.03 EU/mL或更高灵敏度的鲎试剂在 37 1 条件下 24 h不产生凝集反应的灭菌注射用水。 C.3 仪器设备 C.3.1 电热鼓风干燥箱。设备验证合格，仪表校验合格，并在有效期内。 C.3.2 电热恒温水浴箱。校验合格并在有效期内。 C.3.3 水银温度计。温度范围 -30 100 1 。 C.3.4 旋涡混悬器。 C.3.5 玻璃反应管（10 mL） 。洗刷后用 4% 氢氧化钠浸泡除热原，250 干热灭菌 120 min。 C.3.6 其他试验用品。0.2 mL及 1 mL 移液器、一次性无热原吸头、封口膜、定时钟、剪刀、砂轮片、75%酒精棉球。 C.4 实验操作 C.4.1 待检样品稀释 待检样品检测，选用鲎试剂灵敏度 0.125 EU，稀释80倍检测。取原液先10倍稀释，然后倍比稀释至 80 倍稀释液，备用。 C.4.2 2 细菌内毒素溶液的稀释 取细菌内毒素工作标准品，用细菌内毒素检查用水稀释为2 细菌内毒素溶液，备用。 DB22/T 29152018 7 C.5 样品检测 取鲎试剂 8 支，其中样品2支，阴性对照 2 支，阳性对照2支，供试品阳性对照 2 支，各加入 0.1 mL溶解水溶解，然后，样品管加最大稀释倍数的样品溶液 0.1 mL，阳性管加入0.1 mL 2 内毒素标准品液，供试品阳性对照管加 0.1 mL 2 的供试品溶液，轻轻摇匀，8 支管放入37 1 水浴保温1 h，观察结果。 C.6 结果判定 将试管轻轻从水浴中取出，缓缓倒转 180 ，管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性（+），凝胶不能保持完整，并从管壁滑脱者为阴性（-），样品管均为阴性判定为符合规定，如两管均为阳性判定为不合格，如样品管 1 管为阳性 1 管为阴性，按上述方法另取 4 支复试，若 4 支管 1 管为阳性，则认为不符合规定，阳性对照管为阴性，阴性对照管为阳性，试验无效，保温和拿取试管过程中应避免受到振动造成假阳性。结果为阳性时，即表示细菌内毒素含量大于等于 10 EU/mL，判定为不合格。 DB22/T 29152018 8 C D 附 录 D （规范性附录） 蛋白质含量检验 D.1 检测方法 检验依据2015版中国药典四部通则0731蛋白质测定法双缩脲法。 D.2 实验物品 D.2.1 试剂 D.2.1.1 双缩脲试剂 取硫酸铜 3.0 g、酒石酸钾钠 9.0 g、碘化钾 5.0 g、氢氧化钠 24.0 g，加水溶解并稀释至 1000 mL，摇匀，即得。 D.2.1.2 标准蛋白质溶液 精密量取牛血白蛋白标准品适量，用 0.9% 氯化钠溶液定量稀释成每 1 mL含 50 mg的溶液。 D.2.2 仪器设备 D.2.2.1 紫外分光光度计。 D.2.2.2 电热恒温水浴箱。校验合格并在有效期内。 D.2.2.3 旋涡混悬器。 D.2.2.4 玻璃反应管。10 mL。 D.2.2.5 玻璃试管，吸管（5 mL） ，吸耳球，玻璃比色皿。 D.2.2.6 其他试验用品。1 mL 移液器、定时钟。 D.3 实验操作 D.3.1 供试品溶液，精密量取适量的供试品，加水制成每 1 mL约含 50 mg的溶液。 D.3.2 分别精密量取供试品溶液与标准蛋白质溶液各 0.5 mL置玻璃试管中，分别加双缩脲试剂 4.0 mL，混匀，置 37 水浴中 30 min。 D.3.3 按照紫外-可见分光光度法，在波长 540 nm 处检测吸光度。另精密量取水 0.5 mL，自“加双缩脲试剂 4.0 mL”起，同法操作，作为空白对照。 D.4 结果计算公式 21AncAB. (D.1) DB22/T 29152018 9 式中： B为蛋白质含量，mg/mL； 1A为供试品溶液的吸光度； 2A为标准蛋白质溶液的吸光度； c为标准蛋白质溶液的浓度，mg/mL； n为供试品稀释倍数。 DB22/T 29152018 10 D E 附 录 E （规范性附录） 外源病毒检验 E.1 实验物品 E.1.1 细胞 Vero、NA、MDCK 和 F81细胞。 E.1.2 病毒 犬瘟热病毒(CDV)、狂犬病病毒(RABV)、犬腺病毒(CAV)和犬细小病毒(CPV)。 E.1.3 试剂 犬瘟热病毒荧光抗体、狂犬病病毒荧光抗体、犬腺病毒荧光抗体和犬细小病毒荧光抗体。 E.1.4 设备 倒置荧光显微镜，二氧化碳培养箱。 E.1.5 器材 T25细胞培养瓶，10 Ml 移液吸管，6 孔细胞培养板。 E.2 实验操作 E.2.1 样品的处理 将待检血液自然凝固后，以 2000 g3000 g离心 10 min，分离出血清，如为无菌采取的血清，可直接作为检品，如采取过程可能污染，应将血清用 0.22 um滤器过滤除菌后作为检品。 E.2.2 细胞的准备 E.2.2.1 开启生物安全柜或超净工作台，运行 10 min。 E.2.2.2 准备好细胞培养瓶和离心管，加入 7 mL细胞培养液。 E.2.2.3 佩戴眼镜和手套，从液氮罐中取出安瓿或冷冻管，迅速放入 38 水浴中，并不时摇动，在1min内使其完全融化。 E.2.2.4 将冻存管用 75% 酒精棉擦拭 2 遍，用吸管在无菌下取出细胞，缓慢加入含细胞培养基的离心管内，在 1000 r/min速度下离心5 min10 min，弃去上清。 E.2.2.5 用移液管吸取培养瓶内培养基 2 mL至沉淀中， 轻轻吹打均匀， 将细胞悬液加入装有培养基的培养瓶中，置 37 二氧化碳培养箱中静置培养，观察生长情况。培养 3 d5 d，细胞长成致密单层时，及时传代。 E.2.2.6 细胞传代：将原瓶中的细胞培养液倾倒干净或用吸管吸弃，加入适量PBS清洗细胞生长面，倒去PBS，加入适量消化液（一般情况下，T25培养瓶不超过 0.5 mL0.8 mL；T75培养瓶 1.0 mL1.5 DB22/T 29152018 11 mL） ，轻晃消化液，使其浸湿整个细胞面，将细胞平放温箱内或室温下消化。当观察到细胞面发白、局变出现针孔空隙或裂隙时， 轻拍细胞面后立即加入少量细胞培养液中止消化， 用吸管轻柔吹打细胞至细胞成分散良好的均匀混悬液，确保培养瓶底的每个角落都吹打下来，吹打时尽量避免产生气泡。按照1:31:5比例进行传代。用吸管将混合均匀的细胞悬液均分至细胞培养瓶内，补足细胞培养液，盖好细胞瓶盖，轻轻晃匀细胞悬液，平放置培养箱中培养。 E.2.3 样品的接种与培养 E.2.3.1 取处理好的样品， 分别吸附接种到已长成良好单层的MDCK、 Vero和NA细胞的T25细胞瓶各1瓶，同时同步接种F81细胞T25细胞瓶1瓶，每瓶接种 1 mL,另分别设1瓶正常细胞对照，培养 3 d5 d，每日观察细胞生长情况，继代至少 2 代。 E.2.3.2 最后一次继代（至少为第3代）时，每种培养物传出3组培养物：3组T25培养瓶，用于致细胞病变检查和红细胞吸附检查，1组6孔板培养物，用于荧光抗体检测。 E.2.3.3 如果样品传代培养期间，任何一代培养细胞出现细胞病变，而正常细胞未出现病变，则判为阳性。当被检样品判为阳性时，不再进行其他项目检验。 E.2.4 致细胞病变检查和红细胞吸附检查用细胞培养物的接种培养 取样品进行最后一次继代时，取上一代经 2 次冻融的培养物吸附接种已长成 70%-80% 细胞单层 MDCK、Vero和NA细胞各 3 瓶，同步接种F81细胞3瓶，每瓶接种1 mL，吸附接种的细胞于37 吸附1小时后，补加含2%牛血清的MEM营养液，并设正常Vero、NA、F81和MDCK细胞对照各 3 瓶，置 37 培养箱培养 3 d5 d，每日观察细胞病变情况。 E.2.5 荧光抗体检查用细胞培养物接种培养 取样品进行最后一次继代时， 取上一代经 2 次冻融的培养物吸附接种已长成 70%-80% 细胞单层的6孔Vero细胞板（检测CDV）、MDCK细胞板（检测CAV）、NA细胞培养板（检测RABV）各1块，同时同步接种 F81细胞板（检测CPV）1 块，每块板接种 2 孔， 每孔200 L，同时将CDV阳性对照毒株、CAV阳性对照毒株、RABV阳性对照毒株，CPV阳性对照毒株稀释为100 TCID50300 TCID50, 分别吸附接种6孔Vero细胞板、MDCK细胞板、NA细胞培养板，同步接种F81细胞板，每块板接种2孔，每孔200 L，并设正常细胞对照 2 孔，置37培养箱培养 3 d5 d。 E.2.6 致细胞病变检查 将E.2.4接种的一组细胞培养瓶弃去培养液，用 PBS 洗涤 3 遍，加入 2 mL 姬姆萨染色液，室温下染色 15 min30 min，然后用PBS洗涤3次，置显微镜检查单层细胞，观察包涵体、巨细胞异常和其他由病毒引起的细胞病变（CPE）是否存在，当正常对照细胞未出现CPE，而被检样品出现CPE，则判为阳性，不再进行其他项目检验。 E.2.7 红细胞吸附检查 将E.2.4接种的另二组细胞培养瓶弃去培养液，用无钙镁离子的PBS洗涤 3 遍，向每一细胞培养瓶中加入2 mL 0.2%的豚鼠红细胞和0.5%猪红细胞的等量混合物，将培养瓶同时在 2 8 和20 25 放置 30 min，然后用无钙镁离子的PBS洗涤 3 次，用 30 倍60 倍显微镜检查吸附情况。当正常对照细胞不出现红细胞吸附现象，而被检样品出现红细胞吸附现象，则判为阳性，不再进行其他项目检验。 E.2.8 荧光抗体检查 DB22/T 29152018 12 E.2.8.1 洗涤 将E.2.5接种的细胞培养板弃去培养液，用无钙镁离子PBS洗涤 2 次3 次。每次洗涤时，每孔加入 5 mL PBS, 室温孵育 3 min5 min，弃去PBS。 E.2.8.2 固定 每孔加入 2 mL冰预冷的80%丙酮溶液，2 8 冰箱固定 30 min,PBS洗板 5 次，晾干。 E.2.8.3 加入荧光抗体 向孔中加入对应的荧光抗体工作液， 使其覆盖于细胞表面， 置于不透光湿盒中， 37 作用 60 min，弃去荧光抗体，用 PBS 洗板 5 次，自然晾干。 E.2.8.4 终止反应 用 50% 甘油封片剂封片，置于荧光显微镜下进行观察。 E.2.8.5 判定标准 对于犬瘟热病毒（CDV）、犬腺病毒（CAV）和狂犬病毒(RABV)：阳性对照孔应出现典型的特异性胞浆内黄绿色荧光，细胞对照孔未出现特异性黄绿色荧光时，试验成立。如待检细胞孔出现特异性胞浆内黄绿色荧光，则判为阳性，否则判为阴性。 对于犬细小病毒(CPV)： 阳性对照孔应出现典型的特异性胞核内黄绿色荧光， 细胞对照孔未出现特异性黄绿色荧光时，试验成立。如待检细胞孔出现特异性胞核内黄绿色荧光，则判为阳性，否则判为阴性。 如果阳性对照未出现特异性荧光，或者正常细胞出现特异性荧光，实验不成立，应重做。 E.3 结果判定 当细胞培养中CPE检查、致细胞病变检查、红细胞吸附检查、荧光抗体检查中任一项或多项为阳性时，外源病毒检查即为阳性，仅当以上检查全部为阴性时，外源病毒检查为阴性。 _