Beacon-Designer-使用流程.doc

引物设计的原理和程序
一、设计原理
1、选择合适的靶序列：设计引物之前，必须分析待测靶序列的性质，选择高度保守、碱基分布均匀的区域进行引物设计。
2、长度：一般来说，寡核苷酸引物长度为15-25bp。
3、Tm值：引物的Tm值一般控制在55-65℃，尽可能保证上下游引物的Tm值一致。若G+C含量相对偏低，则可以使引物长度稍长，而保证一定的退货温度。
4、G+C含量：有效引物中的G+C含量一般为40%-60%。
5、碱基的随机分布：引物中四种碱基的分布最好是随机的，不存在聚嘌呤和聚嘧啶，尤其在引物的3’端不应超过3个连续的G或C。
6、引物末端：只有引物的3’端与模板结合，PCR才能进行，所以3’端最好是G或C。
7、引物自身：引物自身不存在连续4个碱基以上的互补序列，否则会影响到引物与模板之间的结合，尤其避免3’端的互补。
8、引物之间：上下游引物之间尽量少的存在互补序列，否则上下游引物退火结合，将影响到PCR的扩增效率。

二、序列查找
根据所需检测的待检定基因，在
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide&itool=toolbar网址查询有关序列。

三、引物设计与筛选
以Beacon Designer 5.1软件为例，进行引物设计和筛选。
1、打开软件，调入序列

2、选择序列文件名，加入右框

3、序列显示如图，

4、选择引物设计方式

5、点击“Primer Search（图标）”，按照引物设计的原理，设定引物的各种参数，点击“Search”进行引物搜寻

6、等待引物搜寻，显示结束后，点击“OK”，进入下一页，

7、按照搜寻结果显示，逐条分析， 点击“All Structures”，检查该引物对的二级结构，依次筛选

四、引物比对
比对设计的引物是否满足需要和引物的特异性，在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
网址进行比对
1、输入所需比对的序列，选择数据库“nr”

2、点击“Blast”，进入下一页

3、点击“Format”，进入比对结果

5