骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠蛛网膜下腔出血后铁死亡的机制研究.pdf

基金项目:国家级大学生创新创业训练计划项目(2 0 2 2 1 0 0 8 1 0 1 6);唐山市科技计划项目(2 1 1 3 0 2 2 4 C)作者简介:田子玉(2 0 0 1-),女,在读本科,研究方向:临床医学。通信作者:李建民,男,教授,主任医师,硕士生导师,研究方向:神经损伤和神经修复,E-m a i l:l i j i a n m i n 6 2 0 71 2 6.c o m。本文引用:田子玉,杨宇航,马艺瑞,等.骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠蛛网膜下腔出血后铁死亡的机制研究J.新疆医科大学学报,2 0 2 3,4 6(1 0):1 2 8 5-1 2 9 0.d o i:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 0 0 9-5 5 5 1.2 0 2 3.1 0.0 0 4骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠蛛网膜下腔出血后铁死亡的机制研究田子玉1,杨宇航1,马艺瑞1,刘俊杰1,2,王一超1,李建民1,2(华北理工大学1临床医学院,2附属医院神经外科,河北 唐山 0 6 3 0 0 0)摘要:目的 探讨骨髓间充质干细胞(B M S C s)能否通过调控核转录E 2相关因子2(N r f 2)/谷胱甘肽过氧化物酶4(G P X 4)信号通路减轻蛛网膜下腔出血(S AH)后脑组织的铁死亡。方法 1 0 0只雌性S D大鼠中随机取出2 5只作为假手术组(S h a m组)(不刺破大脑前动脉与大脑中动脉分支,仅在感到穿刺线受阻时退出)。剩余7 5只大鼠通过血管穿刺法复制S AH大鼠模型,7 5只大鼠均造模成功,随机分为蛛网膜下腔出血组(S AH组)、蛛网膜下腔出血+B M S C s移植组(B M S C s组)和蛛网膜下腔出血+B M S C s移植+N r f 2特异性抑制剂M L 3 8 5干预组(M L 3 8 5组),每组2 5只。造模3 d后,进行大鼠神经功能学评分和脑组织含水量测定;普鲁士蓝染色检测神经细胞内铁沉积情况;分光光度计法测定神经脑细胞中铁含量、丙二醛(MD A)含量、谷胱甘肽(G S H)含量及谷胱甘肽过氧化物酶4(G P X 4)活性;W e s t e r n b l o t检测大鼠脑组织中N r f 2和G P X 4蛋白表达水平。结果 BM S C s组大鼠神经功能学评分较S AH组显著增高,脑组织含水量明显低于S AH组大鼠(P均0.0 5)。BM-S C s组大鼠脑组织内铁沉积情况较S AH组明显减轻,铁含量、MD A含量明显减少,G S H含量和G P X 4活性显著升高(P均0.0 5)。与S AH组相比,BM S C s组大鼠脑组织中N r f 2、G P X 4表达水平显著增多(P均0.0 5);与BM S C s组相比,ML 3 8 5组大鼠脑组织中N r f 2、G P X 4表达水平显著减少(P均0.0 5)。结论 BM S C s可能通过N r f 2/G P X 4信号通路减轻S AH后受损脑组织铁死亡,从而修复其受损的神经功能。关键词:蛛网膜下腔出血;骨髓间充质干细胞;铁死亡;N r f 2/G P X 4通路;大鼠中图分类号:R 7 4 3.3 5 文献标识码:A 文章编号:1 0 0 9-5 5 5 1(2 0 2 3)1 0-1 2 8 5-0 6d o i:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 0 0 9-5 5 5 1.2 0 2 3.1 0.0 0 4S t u d y o n m e c h a n i s m o f i r o n d e a t h a f t e r b o n e m e s e n c h y m a l s t e m c e l l s(BM S C s)t r a n s p l a n t a t i o n i n r a t s w i t h s u b a r a c h n o i d h e m o r r h a g eT I A N Z i y u1,Y A N G Y u h a n g1,MA Y i r u i1,L I U J u n j i e1,2,WA N G Y i c h a o1,L I J i a n m i n1,2(1C l i n i c a l M e d i c a l C o l l e g e,N o r t h C h i n a U n i v e r s i t y o f S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y,2D e p a r t m e n t o f N e u r o s u r g e r y,A f f i l i a t e d H o s p i t a l o f N o r t h C h i n a U n i v e r s i t y o f S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y,T a n g s h a n H e b e i 0 6 3 0 0 0,C h i n a)A b s t r a c t:O b j e c t i v e T o e x p l o r e w h e t h e r b o n e m e s e n c h y m a l s t e m c e l l s(BM S C s)c a n r e d u c e f e r r o p t o s i s i n b r a i n t i s s u e o f s u b a r a c h n o i d h e m o r r h a g e(S AH)r a t s b y r e g u l a t i n g N r f 2/G P X 4 p a t h w a y.M e t h o d s 2 5 o u t o f 1 0 0 f e m a l e S D r a t s w e r e r a n d o m l y s e l e c t e d a s s h a m s u r g e r y g r o u p(S h a m g r o u p)(w i t h o u t p u n c t u r i n g t h e b r a n c h e s o f t h e a n t e r i o r a n d m i d d l e c e r e b r a l a r t e r i e s,o n l y e x i t i n g w h e n t h e p u n c t u r e l i n e w a s o b s t r u c-t e d).T h e r e m a i n i n g 7 5 r a t s r e p l i c a t e d t h e S AH r a t m o d e l t h r o u g h v a s c u l a r p u n c t u r e,a n d a l l 7 5 r a t s w e r e 第4 6卷 第1 0期新 疆 医 科 大 学 学 报V o l.4 6 N o.1 0 2 0 2 3年1 0月J o u r n a l o f X i n j i a n g M e d i c a l U n i v e r s i t yO c t.2 0 2 3 s u c c e s s f u l l y m o d e l e d.T h e y w e r e r a n d o m l y d i v i d e d i n t o s u b a r a c h n o i d h e m o r r h a g e g r o u p(S AH g r o u p),s u b a r a c h n o i d h e m o r r h a g e+BM S C s t r a n s p l a n t a t i o n g r o u p(BM S C s g r o u p),a n d s u b a r a c h n o i d h e m o r r h a g e+BM S C s t r a n s p l a n t a t i o n+N r f 2 s p e c i f i c i n h i b i t o r ML 3 8 5 i n t e r v e n t i o n g r o u p(ML 3 8 5 g r o u p),w i t h 2 5 r a t s i n e a c h g r o u p.A f t e r 3 d a y s o f m o d e l i n g,t h e n e u r o l o g i c a l s c o r e a n d b r a i n t i s s u e w a t e r c o n t e n t o f t h e r a t s w e r e m e a s u r e d,P r u s s i a n b l u e s t a i n i n g w a s u s e d t o d e t e c t f e r r o p t o s i s i n n e r v e c e l l s.I r o n c o n t e n t,m a l o n d i-a l d e h y d e(MD A)c o n t e n t,g l u t a t h i o n e(G S H)c o n t e n t a n d g l u t a t h i o n e p e r o x i d a s e 4(G P X 4)a c t i v i t y i n c e r e b r a l c o r t e x w e r e d e t e r m i n e d b y s p e c t r o p h o t o m e t r y.T h e e x p r e s s i o n l e v e l s o f N r f 2 a n d G P X 4 w e r e d e-t e c t e d b y W e s t e r n b l o t.R e s u l t s T h e n e u r o l o g i c a l f u n c t i o n s c o r e i n t h e BM S C s g r o u p w a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h a t i n S AH g r o u p,a n d t h e b r a i n w a t e r c o n t e n t w a s s i g n i f i c a n t l y l o w e r t h a n t h a t i n S AH g r o u p(b o t h P0.0 5).T h e i r o n d e p o s i t i o n i n b r a i n t i s s u e o f BM S C s g r o u p w a s s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d c o m-p a r e d w i t h S AH g r o u p,t h e i r o n c o n t e n t a n d MD A c o n t e n t i n b r a i n t i s s u e w e r e s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d,a n d t h e G S H c o n t e n t a n d G P X 4 a c t i v i t y w e r e s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d(P0.0 5).C o m p a r e d w i t h S AH g r o u p,t h e e x p r e s s i o n l e v e l s o f N r f 2 a n d G P X 4 i n b r a i n t i s s u e o f BM S C s g r o u p w e r e s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d(P0.0 5).C o m p a r e d w i t h BM S C s g r o u p,t h e e x p r e s s i o n l e v e l s o f N r f 2 a n d G P X 4 i n b r a i n t i s s u e o f ML 3 8 5 g r o u p w e r e s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d(P0.0 5).C o n c l u s i o n BM S C s m a y r e d u c e f e r r o p t o s i s i n d a m a g e d b r a i n t i s s u e a f t e r S AH t h r o u g h N r f 2/G P X 4 s i g n a l i n g p a t h w a y,s o a s t o r e p a i r t h e d a m a g e d n e r v e f u n c t i o n.K e y w o r d s:s u b a r a c h n o i d h e m o r r h a g e;b o n e m e s e n c h y m a l s t e m c e l l s(B M S C s);f e r r o p t o s i s;N r f 2/G P X 4 p a t h w a y;r a t 蛛网膜下腔出血(S u b a r a c h n o i d h e m o r r h a g e,S AH)是脑卒中的一种重症亚型,病死率和致残率极高,预后不佳1。相关研究证明2,S AH后的早期脑损伤与患者预后差密切相关,在S AH早期脑损伤中,铁死亡机制发挥重要作用,因此抗铁死亡治疗可作为S AH治疗的新靶点。铁死亡是一种铁依赖性非凋亡性的新型细胞损伤方式,主要特征表现在铁、脂质过氧化物含量的升高,谷胱甘肽(G l u t a-t h i o n e,G S H)含量的降低3。此外,核转录E 2相关因子2(N u c l e a r f a c t o r E 2-r e l a t e d 2,N r f 2)/谷胱甘肽过氧化物酶4(G l u t a t h i o n e p e r o x i d a s e 4,G P X 4)信号通路是铁 死亡激活的 关键途径。N r f 2是推 动G P X 4基因转录4-5的重要因子,G P X 4在调控铁死亡的过程中起着关键作用6,N r f 2、G P X 4在神经细胞发生铁死亡的过程中的表达水平及活性均降低,使细胞内脂质过氧化物的清除减少、聚集增多,从而加重 了 神 经 细 胞 的 铁 死 亡。骨 髓 间 充 质 干 细 胞(B o n e m e s e n c h y m a l s t e m c e l l s,BM S C s)移植能起到良好的神经保护和促进损伤修复作用。目前关于BM S C s移植治疗S AH后铁死亡机制的报道较少,故本实验基于N r f 2/G P X 4通路观察BM S C s对大鼠S AH后铁死亡的治疗作用,以期为S AH的治疗提供理论依据。1 材料与方法1.1 实验动物 选用S p r a g u e-D a w l e y(S D)胚胎期3 5周龄雄性大鼠5只以及体重2 0 03 5 0 g的成年雌性大鼠1 0 0只,均购自北京维通利华实验动物科技有限公司,许可证编号为S C X K(京)2 0 2 0-0 0 0 4。饲养于华北理工大学动物实验中心,自由进食水,适应性喂养7 d。实验方案获得华北理工大学实验动物伦理委员会批准。1.2 主要试剂与仪器 N r f 2特异性抑制剂M L 3 8 5(美国M e d C h e m E x p r e s s公司,H Y-1 0 0 5 8 9);兔抗N r f 2多克隆抗体、兔抗G P X 4多克隆抗体、普鲁士蓝染色试剂盒、组织铁含量检测试剂盒、丙二醛(M a l o n d i-a l d e h y d e,MD A)含量检测试剂盒、G S H含量检测试剂盒、G P X 4活性检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司,货号:C L P 0 6 9 4、K 0 0 3 0 8 3 P、G 1 4 2 8、B C 4 3 5 9、B C 0 0 2 1、B C 1 1 7 5、B C 1 1 9 4);鼠抗-a c t i n单克隆抗体(美国S ANT A C RU Z公司,货号:s c-1 3 0 3 4 5);I g G羊抗兔、I g G羊抗鼠单克隆抗体(美国K P L公司,货号:7 1-0 0-1 6、7 1-0 0-1 5);E C L显色试剂盒(北京博奥森生物技 术有限公司,货号:C 0 5-0 7 0 0 4);O l y m p u s B X 5 3型光学显微镜(O l y m p u s公司);L e i c a E G 1 1 5 0 H型全自动石蜡包埋机、L e i c a RM 2 2 3 5型切片机(L E I C A公司)。1.3 大鼠骨髓间充质干细胞原代分离与培养 采用颈椎脱臼法处死35周龄S D雄性大鼠,分离大鼠的后肢胫骨和股骨,用1 m L注射器吸取添加了体积分数1 0%胎牛血清,1%青链霉素混合液的6821 新 疆 医 科 大 学 学 报第4 6卷 DMEM细胞培养基反复冲洗骨髓腔,1 0 0 0 r/m i n离心5 m i n后重悬于2 5 c m2培养瓶中,原代培养3 d后更换培养液,培养67 d后,细胞融合 至8 0%9 0%时用胰蛋白酶消化,按13比例进行传代培养。传至第三代后,用流式细胞术鉴定细胞表型。1.4 大鼠骨髓间充质干细胞的表型鉴定 选择生长良好的第三代BM S C s,P B S轻轻冲洗3次后用0.2 5%胰蛋白酶对其进行消化,当细胞与瓶壁脱离时即终止消化;4离心(1 0 0 0 r/m i n)1 0 m i n,弃去上清;细胞用P B S洗涤3次,4离心(1 0 0 0 r/m i n)1 0 m i n;分别滴加荧光标记抗体P E-C D 3 1,F I T C-C D 3 4,P E-C D 4 4,P E-C D 1 0 5,在 室 温 下 避 光 孵 育3 0 m i n后,洗去多余抗体,加入2 0 0 L P B S,用流式细胞仪进行检测分析。1.5 动物模型的制备及干预 参照B e d e r s o n等7的文献,通过血管穿刺法复制S AH大鼠模型。S D大鼠用1%戊巴比妥钠(5 0 m g/k g)通过腹腔注射进行麻醉,仰卧放置,在颈中央做切口,暴露出左侧颈内、外动脉及颈总动脉,并在颈外动脉的近心端做一切口。将一根锐化4-0手术缝合线的头端沿着颈外动脉的切口向颈内动脉方向轻轻逆行插入,在距离颈总动脉分叉1 81 9 mm处时有阻力感,需穿透动脉壁再送入5 mm深度,造成蛛网膜下腔出血。1 0 0只雌性S D大鼠中随机取出2 5只作为假手术组(S h a m组)(不刺破大脑前动脉与大脑中动脉分支,仅在感到穿刺线受阻时退出)。剩余7 5只大鼠进行造模,造模成功判定标准:剥离脑部时肉眼可以见到极其显眼的血性液体散在分布在脑底基底池部位。7 5只大鼠均造模成功,随机分为蛛网膜下腔出血组(S AH组)、蛛网膜下腔出血+BM S C s移植组(BM-S C s组)和蛛网膜下腔出血+BM S C s移植+N r f 2特异性抑制剂ML 3 8 5干预组(ML 3 8 5组),每组2 5只。造模成功后3 h,ML 3 8 5组大鼠经尾静脉给予干细胞悬液2 m L,腹腔注射N r f 2特异性抑制剂ML 3 8 5(3 0 m g/k g)8;BM S C s组大鼠给予尾静脉注射干细胞悬液2 m L;S h a m组和S AH组大鼠尾静脉注射对应等量生理盐水。1.6 早期脑损伤指标的检测1.6.1 神经功能学评分 参照G a r c i a等9的方法,对各组大鼠自主运动、四肢运动的对称性、前肢的伸展运动能力、攀爬能力、触须反应及四肢和躯体的本体感觉进行评价,得分越低,表明其神经系统功能损害越严重;得分越高,表明其神经系统功能损害程度越轻微。1.6.2 脑组织含水量的测定 参照H e等1 0的方法,麻醉后取出鼠脑,除去表面的血块和脑膜,将其分别放在一个锡箔上(已知该锡箔重量是a),测得质量是b,b-a代表湿质量,随后快速放置于烘箱2 4 h,直到衡重,称得质量为c,c-a代表干质量。以脑组织含水量的计算公式为依据:脑组织含水量=(湿质量-干质量)/湿质量1 0 0%,可计算得出S AH后受损脑组织含水量。1.7 标本处理 颈椎脱臼法处死大鼠,取标本,腹腔注射1 0%水合氯醛麻醉,使用一次性采血针穿刺左心室尖部,使用眼科剪将右心室剪开,打开静脉窦,将3 0 0 m L冰生理盐水快速灌注入心脏,至肝脏颜色发白,表明灌注良好,随后立即去头,取脑,多聚甲醛固定,用蔗糖脱水,O C T包埋,冰冻切片机冷冻切片,收集切片备用。1.8 细胞铁死亡指标的检测 铁沉积情况用普鲁士蓝染色试剂进行检测,分光光度计法检测细胞铁死亡相关指标:(1)铁含量用组织铁试剂盒进行检测;(2)脂质过氧化物MD A的含量用脂质过氧化物试剂盒进行测定;(3)G S H的含量用G S H试剂盒检测;(4)G P X 4活性用G P X 4试剂盒检测,具体步骤参照厂家说明书。1.9 W e s t e r n b l o t法检测N r f 2和G P X 4蛋白表达水平 配胶,上样,电压6 0 V电泳,待上层胶与下层胶交界处分离,溴酚蓝出现在其间时,将电压调至1 2 0 V恒压到底;切出合适面积的P V D F膜,切胶,将膜贴于胶上;转膜后在室温下用T B S T配制的5%脱脂奶粉封闭2 h;孵育一抗、二抗;E C L显影。1.1 0 统计学分析 应用S P S S 2 6.0软件对数据进行分析,计量资料使用(x-s)表示,多组间数据比较采 用 单 因 素 方 差 分 析,组 间 两 两 比 较 采 用D u n n e t t-t检验,P0.0 5表示差异有统计学意义。2 结果2.1 大鼠骨髓间充质干细胞形态 在原代培养3 d后可以看见BM S C s呈现放射状分布,细胞形状各不相同,培养67 d,在细胞融合度为8 0%9 0%时消化传代,到了第三代可以看见细胞呈旋涡式生7821 第1 0期 田子玉,等:骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠蛛网膜下腔出血后铁死亡的机制研究长,且细胞形态呈长梭形,见图1。图1 第三代大鼠BM S C s的形态特征2.2 大鼠骨髓间充质干细胞表型鉴定结果 流式细胞术检测第三代大鼠骨髓间充质干细胞表面抗原C D 3 1、C D 3 4阳性率分别为0.7%和0.3%,呈阴性表达;C D 4 4、C D 1 0 5阳 性 率 分 别 为1 0 0.0%和9 7.7%,呈阳性表达,见图2。图2 大鼠BM S C s表面抗原流式细胞术检测结果2.3 四组大鼠神经功能学评分比较 造模3 d后,四组大鼠神经功能学评分差异具有统计学意义(P0.0 0 1)。S AH组(1 2.2 21.4 0)分 大鼠神经功能学评分较S h a m组(1 7.4 10.5 9)分 显著降低(P0.0 5);BM S C s组(1 5.5 71.5 9)分 大鼠神经功能学评分较S AH组显著增高(P0.0 5);ML 3 8 5组(1 3.1 81.4 9)分 大鼠神经功能学评分较BM S C s组降低(P0.0 5)。2.4 四组大鼠脑组织含水量比较 造模3 d后,四组大鼠脑组织含水量差异具有统计学意义(P0.0 0 1)。S AH组(8 1.40.6)%大鼠脑组织含水量明显高于S h a m组(7 8.70.1)%大鼠(P0.0 5);BM S C s组(7 9.20.1)%大鼠脑组织含水量明显低于S AH组大鼠(P0.0 5);ML 3 8 5组(8 0.70.2)%大鼠脑组织含水量明显高于BM-S C s组大鼠(P0.0 5)。2.5 B M S C s移植对S A H后铁死亡的影响 造模3 d后,四组大鼠铁死亡相关指标差异具有统计学意义(P0.0 0 1)。S A H组(0.2 5 1 0.0 0 5)%大鼠脑组织内铁沉积情况较S h a m组(0.0 1 40.0 0 8)%大鼠明显加重,铁含量、M D A含量显著增多,G S H含量和G P X 4活性 显 著 降 低(P 0.0 5);B M S C s组 (0.1 8 10.0 0 3)%大鼠脑组织内铁沉积情况较S AH组明显减 轻,铁 含 量、MD A含 量 明 显 减 少,G S H含 量 和G P X 4活性显著升高(P0.0 5);与B M S C s组相比,M L 3 8 5组(0.2 3 1 0.0 0 6)%大鼠脑组织内铁沉积情况加重,铁含量、MD A含量显著增多,G S H含量和G P X 4活性显著降低(P0.0 5),见图3、表1。注:A,S h a m组;B,S AH组;C,BM S C s组;D,ML 3 8 5组。图3 大鼠脑组织内铁沉积情况(普鲁士蓝染色,标尺=2 0 m)表1 各组大鼠脑组织内铁死亡相关指标的检测(x-s,n=2 5)组别铁含量/(g/g)MD A含量/(n m o l/m g)G S H含量/(m g/g)G P X 4活性/(U/g)S h a m组4 1.5 9 21.0 4 95.8 30.0 84 7.8 5 70.4 2 02 8.3 6 40.2 3 1S AH组1 1 2.9 6 41.4 6 9a1 0.1 50.0 2a2 5.1 1 00.8 9 7a1 6.7 3 70.5 2 2aBM S C s组5 9.8 5 40.4 4 7b7.5 90.1 1b3 5.4 9 20.8 4 8b2 6.0 9 70.2 2 8bML 3 8 5组8 3.9 8 00.1 3 5c8.4 60.1 8c2 9.1 4 40.3 9 2c1 9.8 0 10.0 9 2c 注:与S h a m组相比,aP0.0 5;与S AH组相比,bP0.0 5;与BM S C s组相比,cP0.0 5。2.6 BM S C s移 植 对N r f 2/G P X 4信 号 通 路 的 影响 造模3 d后,W e s t e r n b l o t结果显示,各组大鼠脑组织中N r f 2和G P X 4蛋白表达水平差异具有统计学意义(P0.0 0 1)。与S h a m组(0.7 4 70.0 1 5),8821 新 疆 医 科 大 学 学 报第4 6卷 (0.9 4 50.1 7)相比,S AH组(0.3 8 90.0 1 4),(0.3 2 80.0 2 3)大鼠脑组织中N r f 2、G P X 4表达水平显著减少(P0.0 5);与S AH组相比,BM S C s组(0.6 2 90.1 0),(0.8 2 60.0 1 7)大鼠脑组织中N r f 2、G P X 4表达水平显著增多(P0.0 5);与B M S C s组相比,M L 3 8 5组(0.4 1 90.0 1 7),(0.5 2 00.0 2 3)大鼠脑组织中N r f 2、G P X 4表达水平显著减少(P0.0 5),见图4、5。注:A,S h a m组;B,S AH组;C,BM S C s组;D,ML 3 8 5组。注:与S h a m组相比,aP0.0 5;与S AH组相比,bP0.0 5;与BM S C s组相比,cP0.0 5。图4 各组大鼠受损脑组织中N r f 2和G P X 4蛋白表达情况图5 各组大鼠受损脑组织中N r f 2、G P X 4蛋白相对表达量比较3 讨论铁死亡是一种铁依赖性非凋亡性的细胞损伤方式,研究发现,S AH脑组织中存在铁死亡,且与铁代谢障碍1 1、线粒体功能障碍1 2和活性氧蓄积1 3等密切相关。因此,深入探索铁死亡与S AH后早期脑损伤的潜在联系,对S AH的诊疗具有十分重要的意义。近年来随着细胞免疫治疗的发展,干细胞移植为有效治疗脑血管疾病提供了新的方向和方法1 4。BM S C s不仅可以通过分化成神经元来修复卒中后的脑组织,还可以通过分泌多种神经营养因子,使神经细胞凋亡减少,诱导血管生成和神经发生等,进而减少梗死面积和减轻血脑屏障破坏1 5。本研究结果发现BM S C s移植治疗后,神经功能学评分增高、脑组织含水量降低、铁含量降低,说明BM S C s移植能显著改善S AH大鼠脑组织的铁死亡,提示BM-S C s移植在S AH治疗上是可行的。S AH后铁死亡的大鼠脑组织内谷胱甘肽的合成受到影响进而造成G P X 4的活性受到抑制,后者的活性降低同样造成了细胞抗氧化能力下降,细胞内脂质活性氧生成和分解平衡紊乱,致使细胞膜脂质发生过氧化反应,最终导致细胞死亡1 6-1 7。本研究结果显示,大鼠发生S AH后,脑组织内的MD A含量升高、G S H含量降低,BM S C s移 植 可 提 高S AH后 大 鼠 脑 组 织 内G S H、G P X 4的表达水平,提升细胞抗氧化能力,减少细胞内活性氧的积累,减少细胞膜中的过氧化,进而发挥对铁死亡的抑制作用。N r f 2/G P X 4信号通路在铁死亡过程中发挥重要作用,其是细胞抗氧化系统的重要组成部分1 4。G P X 4是内源性抗氧化系统中的谷胱甘肽系统调节的核心酶,G P X 4还是铁死亡的重要调控蛋白6,当细胞内发生铁死亡时,G P X 4的表达和活性都会降低,进而造成脂质过氧化物的清除降低,加重铁死亡1 8。N r f 2作为一种细胞内的转录因子,在多种疾病中对氧化应激损伤具有一定的保护作用1 9,可增加G P X 4的表达。本研究结果显示,S AH大鼠在BM S C s移植后,受损脑组织中的N r f 2和G P X 4表达水平增加,铁含量明显减少,提示BM S C s对S AH后铁死亡的抑制作用与N r f 2/G P X 4信号通路密切相关。本研究使用N r f 2/G P X 4通路抑制剂后,大鼠脑组织中N r f 2、G P X 4表达水平显著减少,铁含量显著增多,说明N r f 2/G P X 4信号通路参与S AH后受损脑组织的铁死亡过程,BM S C s可通过调节此途径对S AH后受损脑组织起保护作用。综上所述,本实验结果表明BM S C s可以有效改善S AH后神经功能损伤,并且可以显著减轻脑部水肿,减少铁沉积,其机制可能与BM S C s调节N r f 2/G P X 4信号通路进而抑制铁死亡有关。本研究重点关注了BM S C s对N r f 2/G P X 4信号通路的调节来抑制S AH后铁死亡,进而起神经保护作用,由于S AH后 铁死亡发生 的 病 理 机 制 十 分 复 杂,BM S C s是否还可以通过其他机制发挥作用,这值得后续研究进一步探讨。9821 第1 0期 田子玉,等:骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠蛛网膜下腔出血后铁死亡的机制研究参考文献:1 中华医学会神经病学分会,中华医学会神经病学分会脑血管病学组,中华医学会神经病学分会神经血管介入协作组.中国蛛网膜下腔出血诊治指南2 0 1 9J.中华神经科杂志,2 0 1 9,5 2(1 2):1 0 0 6-1 0 2 1.2 谢冠锋,梁余槟,唐艳艳,等.蛛网膜下腔出血早期脑损伤与铁死亡相关性的研究进展J.医学研究生学报,2 0 2 2,3 5(7):7 6 3-7 6 7.3 L I N F,L I R,TU W J,e t a l.A n u p d a t e o n a n t i o x i d a t i v e s t r e s s t h e r a p y r e s e a r c h f o r e a r l y b r a i n i n j u r y a f t e r s u b a r a c h-n o i d h e m o r r h a g eJ.F r o n t A g i n g N e u r o s c i,2 0 2 1,1 3:7 7 2 0 3 6.4 安凯,郭沛然,孙玉凤.三七白及粉通过N r f 2/G p x 4介导的铁死亡改善脑出血型应激性溃疡大鼠的胃黏膜损伤J.河北医学,2 0 2 3,2 9(8):1 2 6 7-1 2 7 4.5 D O D S ON M,C A S T RO-P O R TUGU E Z R,Z HAN G D D.N R F 2 p l a y s a c r i t i c a l r o l e i n m i t i g a t i n g l i p i d p e r o x i d a t i o n a n d f e r r o p t o s i sJ.R e d o x B i o l,2 0 1 9,2 3:1 0 1 1 0 7.6 YAN G W S,S R I R AMA R AT NAM R,WE L S CH M E,e t a l.R e g u l a t i o n o f f e r r o p t o t i c c a n c e r c e l l d e a t h b y G P X 4J.C e l l,2 0 1 4,1 5 6(1-2):3 1 7-3 3 1.7 B E D E R S ON J B,G E RMANO I M,GUA R I NO L.C o r t i c a l b l o o d f l o w a n d c e r e b r a l p e r f u s i o n p r e s s u r e i n a n e w n o n-c r a n i o t o m y m o d e l o f s u b a r a c h n o i d h e m o r r h a g e i n t h e r a tJ.S t r o k e,1 9 9 5,2 6(6):1 0 8 6-1 0 9 2.8 梅胜兰,夏中元,吴晓静,等.N r f 2-G p x 4信号通路在参麦注射液减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用:与铁死亡的关系J.中华麻醉学杂志,2 0 1 9,3 9(1 1):1 3 9 5-1 3 9 8.9 GA R C I A J H,WA GN E R S,L I U K F,e t a l.N e u r o l o g i c a l d e f i c i t a n d e x t e n t o f n e u r o n a l n e c r o s i s a t t r i b u t a b l e t o m i d d l e c e r e b r a l a r t e r y o c c l u s i o n i n r a t s.S t a t i s t i c a l v a l i d a t i o nJ.S t r o k e,1 9 9 5,2 6(4):6 2 7-6 3 4.1 0 HE Z,O S T R OWS K I R P,S UN X,e t a l.C HO P s i l e n