谷子WAK基因家族全基因组鉴定及表达分析.pdf

山西农业科学 2023，51（10）：1153-1161Journal of Shanxi Agricultural Sciences谷子 WAK基因家族全基因组鉴定及表达分析王雪，孙玉荣，张诺，李忠祥，任志贤，张宝俊（山西农业大学 植物保护学院，山西 太谷 030801）摘要：细胞壁关联蛋白激酶（Wall-associated kinases，WAKs）是一类独特的类受体蛋白激酶（Receptor like kinases，RLKs），在寄主植物抗病反应中起着关键作用。为分析谷子 WAK 基因家族的特征及潜在功能，基于已研究发表的拟南芥、水稻 WAK 蛋白序列，通过同源序列比对的方法对 xiaomi全基因组进行 WAK 基因家族鉴定，借助 TBtools、MEGA 等软件对谷子 WAK 基因理化性质、基因定位、系统进化、保守结构域、顺式作用元件进行分析。结果表明，共鉴定到谷子 WAK 家族成员 41个，在谷子 19号染色体上均有分布，编码 5901 131个氨基酸；蛋白质分子质量为 65.62123.36 ku，等电点为 5.188.49；Si3g36660、Si7g23280、Si8g19780的蛋白表现为疏水性，其他蛋白均为亲水性；亚细胞定位预测结果显示，28个基因定位于质膜，6个基因定位于叶绿体，其他基因分别定位于高尔基体、液泡、内质网、细胞外基质。系统发育分析结果显示，谷子、拟南芥和水稻的 WAK 基因家族可分为 5类，其中，Si1g24650与 Os01g26174、Si1g12300与 Os02g02120的同源关系最近。谷子 WAK 基因家族的 8 个基序中，Motif 3、Motif 1、Motif 6、Motif 4、Motif 5 基序为保守基序。Si1g25040、Si3g10590、Si3g32650、Si4g01670、Si4g02770、Si4g02780、Si5g09950、Si7g06570、Si7g08090都含有防御和胁迫响应相关元件，推测这 9个谷子 WAK 基因在发挥寄主抗病性方面具有重要作用。基于禾生指梗霉早期侵染互作转录组数据分析表明，谷子 Si6g20040、Si7g08090、Si8g19780 等 3 个基因在禾生指梗霉早期侵染阶段，在抗病品种晋谷 20 号中的表达量均高于感病品种晋谷 21号，且于 48 h在晋谷 20号与晋谷 21号中的相对表达量差异显著，差异倍率分别为 4.99、10.46、2.04。表明所筛选的 3个基因可能在响应禾生指梗霉侵染过程中发挥重要作用。关键词：谷子；WAK基因家族；系统进化；生物信息学分析；表达分析中图分类号：S515 文献标识码：A 文章编号：10022481（2023）10115309Whole Genome Identification and Expression Analysis of WAK Gene Family in Foxtail MilletWANG Xue，SUN Yurong，ZHANG Nuo，LI Zhongxiang，REN Zhixian，ZHANG Baojun（College of Plant Protection，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）Abstract：Wall-associated kinases(WAKs)are a unique class of receptor like kinases(RLKs),they play a key role in disease resistance response of host plant.In order to analyze the characteristics and potential functions of WAK gene family in foxtail millet,in this study,WAK gene family was identified in the whole genome of xiaomi by homologous sequence alignment based on the published WAK protein sequences of arabidopsis and rice.The physicochemical properties,gene localization,phylogenetic evolution,conserved domain,and cis-acting elements of WAK genes in foxtail millet were analyzed by TBtools and MEGA.The results showed that a total of 41 WAK family members were identified,they were distributed on chromosomes 1-9 of foxtail millet and encoded 590-1 131 amino acids.The molecular weight of the protein ranged from 65.62 ku to 123.36 ku,and the isoelectric point ranged from 5.18 to 8.49.The proteins of Si3g36660,Si7g23280,and Si8g19780 were hydrophobic,while the others were hydrophilic.Subcellular localization prediction showed that 28 genes were located in the plasma membrane,6 genes were located in chloroplasts,and the rest of the genes were located in Golgi apparatus,vacuoles,endoplasmic reticulum,and extracellular matrix,respectively.The phylogenetic analysis showed that WAK gene family in foxtail millet,arabidopsis,and rice could be divided into 5 categories,among which Si1g24650 and Os01g26174,Si1g12300 and Os02g02120 had the closest homologous relationship.Among the 8 motifs of foxtail millet WAK gene family,Motif 3,Motif 1,Motif 6,Motif 4,and Motif 5 were conserved.Si1g25040,Si3g10590,Si3g32650,Si4g01670,Si4g02770,Si4g02780,Si5g09950,Si7g06570 and Si7g08090 contained defense and stress response elements.It was suggested that these 9 WAK genes in foxtail millet played an important role in host disease resistance.Based on the analysis of transcriptome data of early infection interaction doidoi:10.3969/j.issn.1002-2481.2023.10.06收稿日期：2023-08-27基金项目：山西省重点研发计划项目（2022ZDYF117）；“特”“优”农业高质量发展科技支撑工程（TYGC-23）作者简介：王雪（2000-），女，山东济南人，在读硕士，研究方向：杂粮病害综合防治。通信作者：张宝俊（1979-），男，山西新绛人，副教授，博士，硕士生导师，主要从事杂粮病害综合防治研究工作。1153山西农业科学 2023 年第 51 卷第 10 期of Sclerospora graminicola,the expression levels of three genes,Si6g20040,Si7g08090 and Si8g19780,were higher in the resistant variety Jingu 20 than that in the susceptible variety Jingu 21 at the early infection stage of Sclerospora graminicola.At 48 h,the relative expression levels in Jingu 20 and Jingu 21 were significantly different,and the difference ratios were 4.99,10.46 and 2.04,respectively.The study above indicated that the three genes might play an important role in response to the infection of Sclerospora graminicola.Key words：foxtail millet;WAK gene family;phyletic evolution;bioinformatics analysis;expression analysis植物在自然界与各类病原生物长期的攻防和博弈的过程中1，形成了一套高效复杂防御系统以抵御多类病原菌的侵染与为害。由病原体相关分子模式（Pathogen associated molecular pattern，PAMP）触 发 的 免 疫 反 应（Pathogen-associated molecular pattern-triggered immunity，PTI）和效应子触发的免疫反应（Effector-Triggered Immunity，ETI）在寄主植物发挥抗病性、阻碍病菌侵染方面起着重要的作用2。其中，PTI途径由许多类受体激酶（Receptor-like kinases，RLKs）和类受体蛋白调节作为诱导第一层防御反应的模式识别受体检测 PAMP，对非适生 性 病 原 菌 具 有 广 谱 抗 性3。细 胞 壁 相 关 激 酶（Wall-associated kinases，WAKs）基因家族是一类独特的 RLKs基因，在植物防御病原菌中发挥着重要作用4，它们编码的跨膜蛋白具有胞内丝氨酸/苏氨酸激酶（Ser/Thr kinase，STK）结构域和胞外类表皮生长因子（Epidermal growth factor-like，EGF-like）结构域5。伴随着 WAK 基因家族的鉴定及功能验证研究的深入，其在植物抗病方面的重要作用陆续被证明。研究发现，ZmWAK-RLK1（Htn1）通过减少玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）渗透到宿主组织中而导致感染过程的改变，赋予玉米数量抗性6；番茄细胞壁相关激酶 SlWAK1 依赖于Fls2/Fls3促进对假单胞菌（Pseudomonas syringae）的质外体免疫反应7；棉花中，GhWAK7A 通过调节几丁质信号传导防御棉花黄萎病菌（Verticillium dahliae）8；在水稻中，OsWAK91 是参与防御水稻纹 枯 病 菌（Rhizoctonia solani）的 候 选 基 因9。OsWAK1 在水稻中的过表达增强了对稻瘟病菌的抗性10；TaWAK7D 通过调控小麦多个病程相关基因的表达，正向参与小麦对纹枯病菌（Rhizoctonia cerealis）的防御反应11；ZmWAK 在抗性玉米品种的中胚轴中高度表达12。这些发现表明，WAK 基因家族对于植物防御病原菌是必不可少的。谷子一直被作为主要的杂粮作物在我国栽培13，具有悠久的种植历史，在中华文明的形成过程中发挥了重要作用，其营养均衡且对糖尿病、肠胃病、心脑血管疾病等多种疾病有食疗作用14。谷子是一种生长能力强、CO2利用率高、需水量少的C4 光合途径作物15，在保障全球粮食安全中具有潜在作用。由禾生指梗霉（Sclerospora graminicola）引起的谷子白发病是一种严重威胁谷子安全生产的主要病害，常年的发病率为 20%30%，一些优良易感品种的发病率甚至达 70%以上16。随着我国杂粮特色产业的发展，该病害发生面积及发病程度有逐渐增长的趋势，严重威胁着谷子产量和品质的提高，因此，挖掘谷子抗白发病基因及关键调控因子，加速抗白发病品种的选育，对于有效防控谷子白发病的发生发展具有十分重要的意义。WAK基因家族在拟南芥17、水稻18、棉花19、大麻20、马铃薯21、小麦22等植物中已被鉴定，但有关谷子 WAK基因家族的研究还未见报道。为挖掘谷子中 WAK 基因的相关功能，本研究利用生物信息学方法对谷子的 WAK 基因进行筛选及进一步鉴定，对确定下的谷子 WAK 基因家族进行基因定位、蛋白质理化性质分析、进化分析、保守基序分析、顺式作用元件分析，同时对谷子 WAK基因家族响应禾生指梗霉早期侵染的表达模式进行分析，旨在为探究 WAK 基因家族在谷子生长发育和抗白发病代谢途径中的功能提供理论依据，并为抗白发病分子育种提供一定的参考。1 材料和方法1.1谷子 WAK基因家族成员鉴定谷子基因组序列从Multi-omics Database for Setaria italica 数 据 库（http:/foxtail- 14条拟南芥 WAK蛋白序列，并通过国家水稻数据库中心（http:/ 9 条水稻 WAK 蛋白序列，利用TBtools 中的 BLAST GUI Wrapper 程序、以水稻与拟南芥的 WAK 蛋白序列作为探针序列对谷子的全基因蛋白序列进行搜索比对，比对标准为 E-value0.01，根据 NCBI数据库（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的 Batch-CD-Search 功能进行结构域确定。1154王雪等：谷子 WAK基因家族全基因组鉴定及表达分析1.2谷子 WAK 基因家族蛋白理化性质分析、亚细胞预测及定位利 用 在 线 工 具 ExPASY-ProtParam（https:/web.expasy.org/protparam/）分析谷子WAK基因家族蛋白的理化性质，主要有氨基酸数量、分子质量和等电点等。利用在线网站（https:/wolfpsort.hgc.jp/）对谷子 WAK 基因家族的亚细胞定位进行预测。基因定位根据谷子的基因组注释 gff3文件，利用 TBtools对定位结果进行可视化。1.3谷子 WAK基因家族进化分析使 用 MEGA 7.0 软 件 对 水 稻、拟 南 芥、谷 子WAK 基因家族的蛋白序列进行多序列比对，采用Neighbor joining 法（bootstrap 值设定为 1 000）构建系统进化树。1.4谷子 WAK基因家族保守结构域分析谷子 WAK 基因家族的保守基序借助 MEME在 线 工 具（http:/meme-suite.org/tools/meme）进行分析，后通过 TBtools 对谷子 WAK 基因家族的保守基序进行可视化做图。1.5谷子 WAK基因家族顺式作用元件鉴定利 用 TBtools 软 件 的 Gtf/Gff3 Sequences Extract程序提取 WAK 基因上游 2 000 bp的起始密码子，使用 Plantcare数据库（http:/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）将 WAK 基 因家族的启动子序列提交至此数据库中，分析谷子WAK基因家族的顺式作用元件。1.6WAK基因家族响应禾生指梗霉侵染的转录表达分析试 验 材 料 为 晋 谷 21 号（JG21）及 晋 谷 20 号（JG20），由杂粮种质创新与分子育种山西省重点实验室提供。晋谷 21 号对谷子白发病具有高感性，晋谷 20号对谷子白发病具有高抗性。以 JG21 和 JG20 的 2 日龄胚芽鞘为材料，用4105个/mL 的禾生指梗霉病菌游动孢子悬浮液接种2日龄胚芽鞘。分别于接菌前0 h，接菌后12、24、48、96 h 不同时间段取受侵染的胚芽鞘，放于液氮速冻，-80 保存备用。3 次重复，共计 30 份样品，后委托百迈克生物科技有限公司进行 RNA测序。运用 RStudio 在线工具，对谷子 WAK 基因响应禾生指梗霉侵染的转录组数据绘制热图并进行分析。2 结果与分析2.1谷子 WAK 基因家族筛选、理化性质和基因定位分析谷子 WAK基因结构域如图 1所示。利用 BLASTP 在 xiaomi基因组中共鉴定得到41 个 WAK 候选基因，再通过 NCBI 数据库中的Batch-CD-Search功能进行结构域确定。其中，41个WAK 候 选 基 因 都 具 有 GUB_WAK_bind 结 构 域（图 1），最终筛选得到谷子 WAK 基因共 41 个。谷子 WAK 基因家族编码 5901 131 个氨基酸，平均为800个；其蛋白分子质量为65.62123.36 ku，等电点为 5.188.49；Si3g36660、Si7g23280、Si8g19780图 1谷子 WAK基因结构域Fig.1WAK gene domain in foxtail millet1155山西农业科学 2023 年第 51 卷第 10 期蛋白亲水性均值均为正值，表现为疏水性；除此之外，其他基因的蛋白亲水性均值均为负值，则其蛋白表现为亲水性。41 个基因中，28 个基因定位于质膜，6个基因定位于叶绿体，其他基因定位于高尔基体、液泡、内质网、细胞外基质（表 1）。在基因定位中，谷子 WAK 基因在 9 个染色体上均有分布。其中，Chr3 上所包含基因最多，为 7 个；Chr2 上的WAK基因最少，仅有 1个（图 2）。表 1 谷子 WAK基因理化性质分析Tab.1 Analysis of physicochemical properties of WAK genes in foxtail millet基因编号Gene IDSi1g12300Si1g24650Si1g25020Si1g25040Si1g25080Si1g36060Si2g02670Si3g10590Si3g15660Si3g32650Si3g32660Si3g36660Si3g38450Si3g38480Si4g01670Si4g02770Si4g02780Si4g03630Si4g06360Si5g08260Si5g09920Si5g09950Si5g19220Si5g28400Si6g18950Si6g20040Si7g06510Si7g06570Si7g08090Si7g23280Si7g27160Si8g06790Si8g06800Si8g06820Si8g17820Si8g19220Si8g19780Si9g02360Si9g15740Si9g35820Si9g47230染色体定位Chromosome locationChr1Chr1Chr1Chr1Chr1Chr1Chr2Chr3Chr3Chr3Chr3Chr3Chr3Chr3Chr4Chr4Chr4Chr4Chr4Chr5Chr5Chr5Chr5Chr5Chr6Chr6Chr7Chr7Chr7Chr7Chr7Chr8Chr8Chr8Chr8Chr8Chr8Chr9Chr9Chr9Chr9氨基酸个数Amino acid number736763915891921765836762664764692713754756807929977766735766590651767657752755933753923724750113111261121751737786746778937714分子质量/uMolecular weight81 798.4884 347.94100 660.3197 858.14101 288.7984 883.1993 254.8083 606.0271 970.6483 644.5276 137.4574 649.6283 522.5883 584.7389 676.67101 965.92107 819.8083 848.8580 806.3484 898.4265 624.4572 115.1882 473.4272 245.1383 183.7382 864.42104 183.2783 575.24102 170.5179 421.1682 545.01123 356.12122 270.83123 264.3481 992.2081 169.7286 207.7881 708.7884 393.82103 383.3376 889.06等电点Isoelectric point（pI）6.755.575.235.205.425.845.325.587.227.138.327.246.375.685.835.445.586.466.025.816.356.306.345.766.297.445.186.625.396.186.435.658.166.306.175.985.335.695.718.497.71亲水性均值Grand average of hydropathicity（GRAVY）-0.225-0.178-0.091-0.104-0.134-0.299-0.169-0.107-0.114-0.138-0.1660.015-0.171-0.116-0.252-0.086-0.112-0.162-0.127-0.231-0.248-0.158-0.037-0.206-0.263-0.148-0.238-0.187-0.1730.038-0.112-0.145-0.163-0.245-0.131-0.1130.014-0.198-0.184-0.101-0.151亚细胞定位Subcellular localization高尔基体质膜质膜质膜质膜高尔基体质膜叶绿体叶绿体叶绿体叶绿体叶绿体质膜质膜细胞外基质质膜质膜质膜质膜质膜质膜质膜质膜液泡液泡质膜质膜质膜质膜质膜质膜质膜质膜内质网叶绿体质膜质膜液泡质膜质膜质膜1156王雪等：谷子 WAK基因家族全基因组鉴定及表达分析2.2谷子 WAK家族成员系统进化分析系统发育分析表明，谷子、拟南芥和水稻的WAK 基因家族可分为五大类（图 3）。其中，I、IV、V 类中仅含有水稻与谷子这 2个物种的 WAK 同源基因，I、IV、V类分别包括6个谷子WAK基因及2个水 稻 WAK 基因、9 个谷子 WAK 基因及 3 个水稻WAK 基因、10 个谷子 WAK 基因及 2 个水稻 WAK基因；在 II 类中仅包含拟南芥的 WAK 同源基因；第 III 类中同时包含谷子、拟南芥、水稻的 WAK 同源基因，其中，Si1g24650与 Os01g26174、Si1g12300与 Os02g02120的同源关系最近。2.3谷子 WAK基因家族保守结构域分析对 41 个 谷 子 的 WAK 基 因 进 行 保 守 基 序 分析，经分析鉴定其具有 8 个基序，命名为 Motif 1Motif 8。其中，Motif 3、Motif 1、Motif 6、Motif 4、Motif 5在 41个谷子的 WAK蛋白序列中均存在，因此，这 5 个基序均较为保守，且这 5 个基序都以图 2谷子 WAK基因定位Fig.2WAK gene location in foxtail millet图 3谷子 WAK基因家族系统进化分析Fig.3Phylogenetic evolution analysis of WAK gene family in foxtail millet1157山西农业科学 2023 年第 51 卷第 10 期Motif 3、Motif 1、Motif 6、Motif 4、Motif 5 的先后位置排布（图4-A）。保守基序的序列分析表明，Motif1中的保守序列为ZIDZFINEVAILSQINHRNVVKLLGCCLETEVPLLVYEFISNGTLYELLH，Motif3中的保守序列为 KTKIFSLEELEKATNNFDKTRVLGRGGHGTVYKGIL（图 4-B）。2.4谷子 WAK基因家族顺式作用元件分析谷子 WAK 基因家族顺式作用元件分析结果如图 5所示。A.谷子 WAK基因家族保守基序；B.Motif 1、Motif 3的氨基酸序列A.The conserved motif of WAK gene family in foxtail millet;B.The amino acid sequence of Motif 1 and Motif 3图 4谷子 WAK基因家族保守基序分析Fig.4Conservative motif analysis of WAK gene family in foxtail millet图 5谷子 WAK基因家族顺式作用元件分析Fig.5Analysis of cis-acting elements of WAK gene family in foxtail millet1158王雪等：谷子 WAK基因家族全基因组鉴定及表达分析顺式作用元件预测表明（图 5），WAK 基因家族顺式作用元件中，与光响应有关的元件较多，说明 WAK 基因家族可能参与光合作用并发挥重要作用；同时，赤霉素、茉莉酸甲酯、水杨酸、脱落酸的响应元件也分布较多，表明 WAK 基因家族在谷子中可能与激素信号紧密相关；在多个谷子 WAK 基因家族中都有防御和胁迫响应元件的分布，这说明谷子 WAK 基因家族在发挥寄主抗病性、抵御病菌侵染等方面具有重要作用。2.5WAK基因家族响应禾生指梗霉侵染的转录表达分析谷子 WAK 基因家族响应禾生指梗霉侵染的转录表达分析显示（图 6），共有 2 类表达模式，在class 中基因 Si4g02780、Si7g23280、Si8g19220在JG21 中受到禾生指梗霉侵染 48、96 h 表达量显著高于 JG20中的表达量，并在 96 h差异表达最显著，差异倍率分别为 4.36、5.64、3.42（图 7）。图 6WAK基因家族表达量热图Fig.6Gene expression heatmap of WAK gene family不同小写字母表示品种之间差异显著(P0.05)Different lowercase letters represented significant difference between varieties(P0.05)图 7基因表达量分析Fig.7Gene expression analysis1159山西农业科学 2023 年第 51 卷第 10 期class 在感病品种 JG21中的表达量整体低于在抗病品种 JG20 中的表达量，Si6g20040 在 JG20中受到禾生指梗霉侵染 48、96 h 表达量高，分别为10.39、10.73；Si7g08090 和 Si8g19780 在 JG21 和JG20 的表达量均随侵染时间的增加而增加，且在JG20 的各个时间点的表达量均高于 JG21 中的表达量，并在 48 h 差异表达最显著，差异倍率分别为10.46、2.04（图 7）。3 结论与讨论细胞壁关联蛋白激酶（Wall-associated kinases，WAKs）是一类特殊的类受体蛋白激酶，在调节细胞生长和防御胁迫反应等方面发挥着重要作用。WAKs/WAKL在植物对真菌病害的防御反应中起着至关重要的作用23。低聚半乳糖苷（OGs）作为胞壁多糖的降解产物，被 AtWAK1所识别24。在拟南芥中过表达 AtWAK1 可以增强对灰霉病的抗性25。位 于 黑 穗 病 数 量 抗 性 基 因（qHSP1）上 的ZmWAK 基因的高表达有效地抑制了丝黑穗病菌在中胚轴中的生长12。水稻 OsWAK14、OsWAK91和 OsWAK92 正向调控稻瘟病菌的防御反应，而OsWAK112d则负调控防御反应26。本研究共鉴定到 41 个谷子 WAK 基因家族成员，与其他植物中WAK/WAKL 基因启动子顺式作用元件分析结果相类似27，本研究谷子 WAK 基因启动子区域检测到大量与光响应、植物激素和应激反应相关的基序。Si1g25040、Si3g10590、Si3g32650、Si4g01670、Si4g02770、Si4g02780、Si5g09950、Si7g06570、Si7g08090都含有防御和胁迫响应元件，表明这 9个谷子 WAK 基因在发挥寄主抗病性、抵御病菌侵染等方面具有调控作用。与未侵染0 h相比，Si6g20040、Si7g08090、Si8g19780 基因在抗病品种晋谷 20 号的 4 个不同侵染时间中基因上调表达；同时，3 个基因在晋谷 21号不同时间点的表达量均低于晋谷20 号中的表达量，且在 48 h 时表达量差异均最显著，推测 Si6g20040、Si7g08090、Si8g19780 在阻碍禾生指梗霉侵染方面发挥作用。由于 Si6g20040、Si7g08090、Si8g19780基因在晋谷21号与晋谷20号中表达量差异均在 48 h 最显著，因此，推测 48 h的侵染时间点可能是一个关键侵染时间点。在接下来的研究中，需要进一步研究和挖掘 Si6g20040、Si7g08090、Si8g19780基因在谷子抗感品种的差异表达的原因。本研究结果可为进一步研究谷子的抗病机制及生长发育等提供一定的参考依据。参考文献：1 刘旭，张诺，徐林，等.谷子 NPR1基因特征及响应禾生指梗霉侵染的表达分析J.山西农业科学，2022，50（9）：1233-1239.LIU X，ZHANG N，XU L，et al.Characteristics of NPR1 gene in foxtail millet and expression analysis in response to Sclerospora graminicola 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