DB14∕T 1153-2015 苦参种子ITS2 序列鉴定方法.PDF

ICS65.020.20B 05DB14山西省地方标准DB 14/T 11532015苦参种子 ITS2 序列鉴定方法2015 12 - 20 发布2016 01 - 20 实施山西省质量技术监督局发 布DB14/T 11532015I目次前言. II1范围. 12规范性引用文件.13术语和定义.14原理. 15试剂与材料.16苦参种子 ITS2 序列特征.37种子扦样.38种子处理.39种子 DNA 提取方法.310扩增与测序.411序列拼接.412结果判断.5参考文献. 6DB14/T 11532015II前言本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由山西农业大学提出并归口。本标准起草单位：山西农业大学生命科学学院。本标准主要起草人：乔永刚、冯前进、刘根喜、关扎根、吴尚英、王玉龙。DB14/T 115320151苦参种子 ITS2 序列鉴定方法1范围本标准规定了苦参种子ITS2序列鉴定的术语和定义、原理、试剂与材料、苦参种子ITS2序列特征、种子扦样、种子处理、种子DNA提取方法、扩增与测序、序列拼接与结果判断。本标准适用于苦参种子ITS2序列鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 3543.2农作物种子检验规程扦样3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1ITS2 序列在 rDNA 基因中，5.8SrDNA 和 28SrDNA 基因间隔序列称为内部转录间隔区 2(ITS2)。4原理由于不同植物物种的ITS2核苷酸序列有差异， 而同一物种不同植株间ITS2核苷酸序列保守， 因此可以采用PCR扩增与测序技术对苦参与非苦参种子进行判断。5试剂与材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水。5.1琼脂糖5.2抗坏血酸钠5.3-巯基乙醇5.4聚乙烯吡咯烷酮 （PVP）5.510 g/L 溴化乙锭（EB）溶液称取1.0 g溴化乙锭（EB），溶解于100 mL水中。DB14/T 115320152注：EB有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。5.610 mol/L 氢氧化钠溶液称取 400.0 g 氢氧化钠（NaOH），加 800 mL 水溶解后，再加水定容到 1000 mL。5.71 mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（pH 8.0）称取 121.1g 三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶解于 800 mL 水中，用盐酸（HCl）调 pH 至 8.0，用水定容至 1000 mL。在 103.4 kPa（121 ）条件下灭菌 20 min。5.8500 mmol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液（pH 8.0）称取 186.1 g， 乙二铵四乙酸二钠 （EDTA-Na2） ， 加入 700 mL 水中， 加入适量氢氧化钠溶液 （5.6） ，加热溶解后，冷却至室温，再用氢氧化钠溶液（5.6）调 pH 至 8.0，用水定容到 1 000 mL。在 103.4 kPa（121 ）条件下灭菌 20 min。5.95 mol/L 氯化钠溶液称取 292.2 g 氯化钠 （NaCl） ， 加 800 mL 水溶解后， 再加水定容到 1 000 mL。 在 103.4 kPa （121 ）条件下灭菌 20 min。5.102%CTAB 提取液量取 1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（5.7）100 mL，5 mol/L 氯化钠溶液（5.9）280 mL，500mmol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液 （5.8） 40 mL 和 20 g CTAB， 溶解后， 加水定容至 1000 mL。 在 103.4 kPa（121 ）条件下灭菌 20 min。5.11TE 缓冲液（pH 8.0）分别量取 10 mL 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（5.7）和 2 mL 乙二铵四乙酸二钠溶液（5.8），加水定容至 1 000 mL。在 103.4 kPa（121 ）条件下灭菌 20 min。5.12酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）溶液按体积比为 25:24:1 配制酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）5.1350TAE 缓冲液称取 242.2 g 三羟甲基氨基甲烷，加入 300 mL 水加热搅拌溶解后，加入 100 mL 乙二铵四乙酸二钠溶液（5.8），用冰乙酸调 pH 至 8.0，然后加水定容到 1 000 mL。使用时用水稀释成 1TAE。5.14加样缓冲液称取 250.0 mg 溴酚蓝， 加入 10 mL 水， 在室温下溶解 12 h； 称取 250.0 mg 二甲基苯腈蓝， 加 10 mL水溶解；称取 50.0 g 蔗糖，加 30 mL 水溶解，混合三种溶液，加水定容至 100 mL，在 4 下保存备用。5.15DNA 分子量标准清楚的区分 50 bp1 000 bp 的 DNA 片段。5.16dNTPs 混合溶液将浓度为 10 mmol/L 的 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 四种脱氧核糖核苷酸等体积混合。DB14/T 1153201535.17Taq DNA 聚合酶（5U/L）及 PCR 反应缓冲液。5.18ITS2 基因引物ITS2 -F：5- ATGCGATACTTGGTGTGAAT -3ITS2-R：5GACGCTTCTCCAGACTACAAT -35.19引物溶液用TE缓冲液（5.11）分别将上述引物稀释到10 mol/L。5.20PCR 产物回收试剂盒6苦参种子 ITS2 序列特征苦参ITS2序列长267bp，未发现变异位点。主导单倍型序列特征如下：CACATCGTTGCCCCAATGCCTCAGCCCTGTTGCTAGGCATAGTAAAGGGGTGAATGTTGGCTTCCCGTGAGCGATGCCTCGCGGTTGGCTGAAAATTGAGTCCGTGGTGGAGTGCGCCGCGATGGATGGTGGTTGAGTAAGAGCTCGAGACCGATCGTGTGTGTCACCCCTACCGGATTTGTGACTCTTTGACCCATGAGCGGCCGTTGGCTGCCCACGACG7种子扦样按照GB/T 3543.2农作物种子检验规程扦样的要求进行。8种子处理苦参种子表面经无水乙醇处理后，用中药材粉碎机或研磨仪粉碎，粉碎后颗粒直径小于1 mm，取100 mg 粉末置于2 mL离心管中备用。9种子 DNA 提取方法a.在有100mg粉末的离心管中加入1 000 L65 预热的2% CTAB提取液（5.10），加入1 L-巯基乙醇，另加入少许PVP干粉，金属浴65保温30 min，其间颠倒混匀3次。14 000 r/min离心10min。b.取上清液转入另一个1.5 ml的离心管，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇（25：241），缓慢翻转混匀，在14000 r/min离心10min。c.重复上述步骤一次。d.取上清液，加入2/3体积的20预冷的异丙醇，置于20 30 min。在4条件下14 000 r/min离心10min。e.弃上清，加入300 mL75%乙醇轻振荡，在4条件下12 000 r/min离心10 min。弃上清，室温下静置自然风干10 min。f.将此沉淀加入100 mL的无菌双蒸水或TE缓冲液，4保存备用或放入20 保存。DB14/T 11532015410扩增与测序10.1PCR 扩增10.1.1PCR 反应体系PCR反应体系见表1。表1PCR反应体系试剂终浓度单样品体积无菌水19 L10PCR 缓冲液12.5 LdNTPS0.6 mmol/L1.5 L10 mol/L 上游引物0.2 mol/L0.5 L10 mol/L 上游引物0.2 mol/L0.5 L5 U/L Taq 酶（热启动）0.025 U/L0.12525 g/L DNA 模板1 g/L1 L注：10PCR 缓冲液含氯化镁，以上反应试剂按顺序添加。10.1.2PCR 反应程序ITS2序列扩增程序：94 ，变性5 min；94变性30 s，56 退火30 s，72 延伸45 s，40个循环；72 延伸10 min。不同型号的PCR仪，可将PCR反应的退火和延伸时间适当调整。10.1.3对照 PCR 反应以苦参种子DNA样品为阳性对照，以无菌水作为空白对照反应体系的模板。10.2PCR 产物电泳利用20 g/L琼脂糖凝胶进行电泳，EB染色。10.2.1凝胶成像分析与测序利用凝胶成像仪分析，目的产物条带单一，可直接送PCR产物测序；有多条带或出现拖尾现象，需切胶回收再测序。测序由有资质的测序服务公司进行DNA测序。11序列拼接11.1序列方向序列方向应与PCR扩增正向引物方向一致。11.2序列拼接应用序列拼接软件进行序列拼接及校对，去除序列两端5.8S和28S基因区，获得完整的ITS2基因间隔区序列。DB14/T 11532015512结果判断测试种子ITS2序列拼接结果符合第6章苦参种子ITS2序列，则该种子为苦参种子。ADB14/T 115320156参考文献陈士林.中国药典中药材DNA条形码标准序列.北京:科学出版社，2015_