隔药灸对慢性炎性内脏痛大鼠mTOR-4E-BP1_S6RP信号通路的调控作用.pdf

实用中医药杂志 2023年8月 第39卷8期（总第367期）JOURNAL OF PRACTICAL TRADITIONAL CHINESE MEDICINE 2023.Vol.39 No.81491 论著 基金项目1.深圳市龙岗区科技创新局（NO.LGKCYLWS2020078）；2.深圳市自然科学基金（NO.JCYJ20210324135600002）通讯作者周晓卿慢性炎性内脏痛（Chronic inflammatory visceral pain，CIVP）是指来自机体内部器官慢性炎症导致的疼痛，如炎症性肠病（Inflammatory bowel disease，IBD）、慢性胰腺炎等1。本病是临床上报道的慢性疼痛中较常见的疼痛形式之一，在带给患者疼痛的同时，也常伴有焦虑、抑郁等心理障碍，使患者遭受生理和心理双重创伤2。尽管患病率高，但其发病机制的认识存在较大差距，从而降低了确有疗效的治疗干预措施的可能性。目前临床上对内脏痛的治疗主要根据其疼痛轻重选择性用药：非阿片类药物如乙酰氨基酚多用于轻度至中度内脏痛；长效阿片类药物如吗啡、羟考酮等多用于重度及顽固性内脏痛3。然而这些药物也都存在不同程度的副反应，如乙酰氨基酚在高剂量下容易引起药物性肝损伤4。此外，5%25%的内脏痛患者只能采用慢性麻醉疗法，然而这种疗法会导致隔药灸 对慢性炎性内脏痛大鼠 mTOR-4E-BP1/S6RP信号通路的调控作用李志元，杨艳，冷文雕，石佶颖，陈思，张菶，周晓卿北京中医药大学深圳医院（龙岗），广东 深圳 518172中图分类号R245.825.9 文献标识码B 文章编号1004-2814（2023）08-1491-05摘要目的：从mTOR-4E-BP1/S6RP信号通路角度，探讨隔药灸治疗慢性炎性内脏痛的中枢机制。方法：将雄性SD（Sprague Dawley）大鼠随机分为正常组、模型组、隔药灸组、mTOR抑制剂组。采用TNBS合50%乙醇灌肠的方法制备CIVP大鼠模型。隔药灸组采用隔附子饼灸“天枢”（双侧）“气海”；mTOR抑制剂组在L5L6间鞘内注射雷帕霉素。采用腹壁撤回反射评分（Abdominal Withdrawal Reflex，AWR评分）观察各组大鼠痛行为变化；采用Western Blotting及RT-qPCR技术检测各组大鼠脊髓mTOR、4E-BP1、S6RP磷酸化蛋白及mRNA表达。结果：与正常组比较，模型组大鼠AWR评分在各个压力梯度下均明显升高（均P0.01）；脊髓mTOR、4EBP1、S6RP磷酸化蛋白及 mRNA表达均明显增高（P0.01或 P0.05）。与模型组比较，隔药灸组及mTOR抑制 剂组大鼠经干预治疗后，AWR评分均显著下降（P0.01，P0.05）；脊髓mTOR、4EBP1、S6RP磷酸化蛋白及mRNA表达均明显降低（P0.01，P0.05）。隔药灸组AWR评分、脊髓mTOR、4EBP1、S6RP磷酸化蛋白及mRNA表达与mTOR抑制剂组比较差异均无统计学意义（P0.05）。结论：隔药灸能显著下调慢性炎性内脏痛大鼠脊髓mTOR、4E-BP1、S6RP的磷酸化蛋白和 mRNA表达水平，抑制mTOR-4E-BP1/S6RP信号通路的过度激活，这可能是隔药灸发挥镇痛作用的重要中枢机制之一。关键词隔药灸；内脏痛；痛行为；mTOR信号通路AbstractObjective：To explore the central mechanism of herb-partitioned moxibustion in the treatment of chronic inflammatory visceral pain（CIVP）from the perspective of mTOR-4E-BP1/S6RP signaling pathway.Methods:Male SD(Sprague Dawley)rats were randomly divided into normal group,model group,herb-partitioned moxibustion group and mTOR inhibitor group.CIVP rat model was prepared by TNBS combined with 50%ethanol enema.The herb-partitioned moxibustion group were treated with aconite cake-separated moxibustion on acupoints Tianshu(bilateral)and Qihai.The mTOR inhibitor group were intrathecally injected with rapamycin between L5 and L6.Abdominal Withdrawal Reflex(AWR)score was used to observe the changes of pain behavior in each group.Western Blotting and RT-qPCR were used to detect the expression of phosphorylated protein and mRNA of mTOR,4E-BP1 and S6RP in spinal cord of rats in each group.Results:Compared with the normal group,the AWR scores of rats in the model group were significantly increased with each pressure gradient(all P0.01).The expression of phosphorylated protein and mRNA of mTOR,4EBP1 and S6RP in spinal cord was significantly increased(P0.01 or P0.05).Compared with the model group,the AWR scores of rats in the herb-partitioned moxibustion group and mTOR inhibitor group were significantly decreased after intervention(P0.01,P0.05).The expression of phosphorylated protein and mRNA of mTOR,4EBP1 and S6RP in spinal cord were significantly decreased(P0.01,P0.05).Conclusion:Herb-partitioned moxibustion could significantly down-regulate mTOR and 4E in spinal cord of rats with chronic inflammatory visceral painand inhibit the excessive activation of mTOR-4E-BP1/S6RP signaling pathway,which may be one of the important central mechanisms for the analgesic effect of herb-partitioned moxibustion.Keywords Herb-partitioned moxibustion；Visceral pain；Pain behavior；MTOR signaling pathway实用中医药杂志 2023年8月 第39卷8期（总第367期）JOURNAL OF PRACTICAL TRADITIONAL CHINESE MEDICINE 2023.Vol.39 No.81492死亡率增加5。因此，探寻一种安全有效、副反应少的镇痛方法或非药物治疗方案尤为迫切，临床意义重大6。临床研究证实，艾灸能有效缓解IBD所致的内脏痛，然而其镇痛机制尚不明确7。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）在各种生物细胞中广泛存在，在细胞的增殖、分化过程中起关键调节作用8。近年来研究发现，mTOR信号通路对疼痛的外周敏化和中枢敏化的产生和维持中起到重要作用，mTOR信号通路有望成为临床治疗疼痛的潜在新靶点和可能的新思路9。课题组前期研究结果表明10，艾灸对慢性炎性内脏痛具有良好镇痛作用，但有关艾灸缓解慢性炎性内脏痛的作用机制尚不明确。因此，本次实验拟在前期研究基础上，从mTOR信号通路角度进一步探讨艾灸镇痛的中枢机制。1材料1.1实验动物SD雄性大鼠36只，体质量（15020）g，购自深圳拓普生物科技有限公司（合格证编号GR202044200224）。饲养条件为室温（252），自由取食和饮水，12h光照/12h黑暗。实验指标检测于北京中医药大学深圳医院中心实验室。实验方案及操作符合关于善待实验动物的指导性意见国科发财字（2006）398）并通过北京中医药大学深圳医院动物伦理委员会批准（批注编号SZLDH2020LSYA-035）号。大鼠适应性饲养1周后，饮食、饮水无异常者纳入实验。1.2主要试剂2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS，Sigma，MO，USA）；Phospho-mTOR单克隆抗体（CST，美国）、Phospho-4E-BP1单克隆抗体（CST，美国）、Phospho-S6RP单克隆抗体（CST，美国）、glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）单克隆抗体（CST，美国）；雷帕霉素（RAP）（Med Chem Express，美国），DMSO（Santa Cruz，美国），辣根过氧化酶标记山羊抗兔IgG（碧云天，中国上海），TRIzol RNA分离试剂及PCR试剂盒、逆转录试剂盒（Thermo Scientific，美国）。1.3主要仪器蛋白质印迹检测仪（Bio-Rad，美国）；实时荧光定量PCR检测仪（ABI-7300，美国），医用血压计（江苏鱼跃医疗设备股份有限公司），医用三通阀（上海贝特医疗器械有限公司），大鼠灌胃针（北京合力科创科技有限公司），自制艾灸模具（规格为底直径0.6cm，高0.6cm的锥状模具，平湖市华鑫机械五金厂）。2方法 分组及造模：将36只SD大鼠随机分为正常组、模型组、隔药灸组和mTOR抑制剂组，每组9只。正常组作为空白对照，不进行造模和干预；另外3组采用TNBS合50%乙醇溶液按照21混合灌肠制备慢性炎性内脏痛大鼠模型11，每周1次，共4次。造模结束后，各组随机抽取1只大鼠，进行结肠HE染色，光镜下观察大鼠结肠病理损伤；检测各组大鼠腹壁撤回反射（Abdominal withdrawal reflex，AWR）评分，以确认造模是否成功。在模型制备成功的基础上进行干预。实验干预：正常组、模型组不进行任何治疗，只做与隔药灸组相同的抓取和固定。隔药灸组选取“天枢”（双侧）“气海”进行隔药灸治疗，每次每穴各灸2壮（共10 min），每日1次，连灸7日。药饼主药为附子粉，灸前用黄酒调和，并用动物专用模具制成直径0.6cm，厚度0.3cm药饼。称取艾绒90 mg，用模具将艾绒压实制成直径0.4cm，高0.4cm的锥形艾炷，置于药饼上并点燃施灸（图 1）。mTOR抑制剂组从L5L6椎间隙鞘内注射mTOR抑制剂雷帕霉素（RAP），采用5%DMSO配制成0.1ug/10uL，每只注射剂量为10uL12，每日1次。连续注射7天。图1隔药灸治疗样本采集及处理：治疗结束后对各组大鼠进行痛行为学检测，检测结束后采用腹腔注射戊巴比妥钠麻醉处死。暴露脊髓，取L6-S2段脊髓置于-80冰箱中冻存备用。指标检测：AWR评分。AWR评分标准参照Al-Chaer13方法。分别给于20、40、60、80mmHg4个不同压力等级的结直肠扩张刺激。每只大鼠测量3次，每次刺激20s，间隔5 min后进行下次刺激，共3次，取3次平均值作为最终评分值。AWR评分标准：0分为CRD刺激无行为反应；1分为CRD开始时偶见短暂头部活动，刺激期间保持不动；2分为腹部肌肉微微收缩，腹部肌肉无抬起；3分为腹部肌肉收缩强烈，腹部肌肉抬起明显，无盆腔及阴囊抬起；4分为身体弓起，盆腔及阴囊抬起。蛋白质印迹检测脊髓p-mTOR、p-4E-BP1、p-S6RP蛋白表达。脊髓组织称重后加入裂解液进行离心，提取上清液即为总蛋白。采用联苯二钠酸（BCA）法测定蛋白浓度，每孔上样80ug总蛋白进行电泳，100v，2h。之后采用湿转法将蛋白质转移到NC膜（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）。各蛋白抗体浓度：兔抗鼠磷酸化mTOR单抗（11000）；兔抗鼠磷酸化4E-BP1单抗（11000）；兔抗鼠磷酸化S6RP单抗（11000），4孵育过夜。HRP标记二抗（11000）室温下孵育2h。Bio-Rad成像系统分析样品。兔抗大鼠GAPDH单抗（12000）内对照进行检测，读取目的蛋白和内参蛋白条带的灰度值，以目的蛋白条带和内参蛋白条带的灰度值之比即为目的相对表达水平。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测大鼠脊髓mTOR、4E-BP1、S6RPmRNA表达。脊髓组织总RNA提取：依次加入TRizol、氯仿、异丙醇、75%乙醇、无水乙醇和DEPC水。合成cDNA第一链并进行PCR扩增，程序如下：95，10min（95，15s；60，45s）40。ABI Prism7300软件分析目的基因的mRNA表达水平。目的基因的相对mRNA表达量=2CT100%；CT=目的基因CT值-内参的CT值。以GAPDH为内参，各基因的引物系列见表1。实用中医药杂志 2023年8月 第39卷8期（总第367期）JOURNAL OF PRACTICAL TRADITIONAL CHINESE MEDICINE 2023.Vol.39 No.81493表1RT-qPCR引物Symbolprimer Fprimer RmTORCCACTCAGCCGGGTACTACCATCCAGAGGCAGCTTGAACAACA4E-BP1 TGAAGAGGAAGAGAAACGGAGAA CGCTTGGAGCGTATCTGTCAS6RPAGAGCGTGCAGACCTCAAGCTAGCCGCAGGGTTCTGCATAGAPDHGTATCCTGGAAACCAAGGAGGTGTCTGGTCCTCGACAACA用SPSS19.0统计软件进行统计学处理。计量资料符合正态分布时用（xs）表示，计量资料为偏态分布时采用Median（P25，P75）表示。若资料服从正态分布，组间差异用单因素方差分析（One-way ANOVA），方差齐时采用最小显著差法（Least significant difference，LSD）比较组间差异性，方差不齐时用Games-Howell比较组间差异性。若资料为偏态分布，采用秩和检验。P0.05为差异有统计学意义。3结果各组大鼠AWR评分比较见表2。表2各组大鼠AWR评分比较（xs）组别鼠数20mmHg40mmHg60mmHg80mmHg正常组80.360.161.060.221.610.332.330.43模型组81.330.35*1.790.26*2.740.48*3.390.51*隔药灸组80.580.211.210.311.880.372.490.34mTOR抑制剂组80.510.191.170.281.820.522.410.31注：与正常组比较，*P0.05；与模型组比较，P0.05。各组大鼠脊髓组织p-mTOR、p-4E-BP1、p-S6RP蛋白表达见表3。表3各组大鼠脊髓组织p-mTOR、p-4E-BP1、p-S6RP蛋白表达（xs）组别鼠数p-mTORp-4E-BP1p-S6RP正常组80.330.070.360.120.220.06模型组80.540.12*0.790.21*0.410.07*隔药灸组80.310.050.320.060.270.04mTOR抑制剂组80.280.040.430.140.240.05注：与正常组比较，*P0.05；与模型组比较，P0.05。图2各组大鼠脊髓pmTOR、p4E-BP1、pS6RP蛋白表达比较各组大鼠脊髓组织mTOR、4E-BP1、S6RPmRNA表达见表4。表4各组大鼠脊髓mTOR、4E-BP1、S6RP mRNA表达比较（xs）组别鼠数 mTORmRNA 4E-BP1mRNA S6RPmRNA正常组80.180.030.260.090.120.02模型组80.330.06*0.490.13*0.350.07*隔药灸组80.200.040.310.060.190.05mTOR抑制剂组80.230.070.330.120.250.04注：与正常组比较，*P0.05；与模型组比较，P0.05。4讨论内脏痛作为一种复杂的异质性疾病，是多种与内脏有关疾病的共同特征，其范围可从轻度的消化不良到肾绞痛14。炎症性肠病（IBD）导致的内脏痛（慢性炎性内脏痛）是临床上较常见的一种内脏痛，严重影响患者的工作和生活，并耗费大量资源15。目前关于IBD导致的慢性炎性内脏痛发病机制尚不明确，研究认为与炎症、肠梗阻、心理社会、神经生物和遗传因素有关16。既往主要治疗方案是基于疼痛等级进行相应药物治疗3。然而由于本病复杂的发病机制，尽管多种药物联合使用，仍无法取得满意的疗效。艾灸作为中医一种古老的治疗手段，艾灸镇痛是其主要作用之一，临床上用于治疗多种痛症相关性疾病17，对慢性炎性内脏痛显示了良好的治疗效果18。课题组前期采用TNBS灌肠制备慢性炎性内脏痛大鼠模型，从实验动物角度观察了艾灸的镇痛效应。研究结果表明，艾灸能有效缓解慢性炎性内脏痛大鼠的内脏痛敏、机械痛敏及热痛感，显示出良好的镇痛功效19。本次研究在前期基础上进一步深入探讨艾灸镇痛机制。炎症性肠病导致的慢性炎性内脏痛的一个重要特点是肠道和躯体同时出现痛觉过敏，其中内脏高敏感更是目前的研究热点，包括外周敏化和中枢敏化，而中枢敏化则是导致内脏痛慢性化并持续发展维持的关键20。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）为磷脂酰肌醇激酶相关激酶（phosphati-dylinositol kinase-related kinase，PIKK）蛋白质家族成员，其序列包含多个相对保守的功能结构域8。研究发现，mTOR及其磷酸化mTOR在脊髓背角浅层投射神经元中密集分布，并参与多种疼痛反应的诱发和维持21，是近年来疼痛领域中的研究热点。脊髓背角兴奋性神经递质的释放以及下行易化系统均能激活mTOR信号通路，激活的mTOR信号通路通过对疼痛相关基因的调控参与到慢性疼痛的发生和发展中22。mTOR信号通路通过激活脊髓背角mTOR磷酸化蛋白表达，进而激活其下游信号通路，使4E-BP1和S6PR发生磷酸化，从而参与疼痛信号转导23。如薛梦等研究表明24，神经病理性疼痛大鼠脊髓mTOR的mRNA表达水平明显升高，给予2Hz电针治疗后能明显下调脊髓mTOR的mRNA表达水平，推测其镇痛机制与下调mTOR的表达进而缓解中枢敏化相关。本研究显示，慢性炎性内脏痛模型大鼠AWR评分显著升高，呈现内脏痛敏，脊髓mTOR磷酸化蛋白表达和mRNA上调，予鞘内注射mTOR抑制剂RAP后能明显缓解内脏痛敏，下调脊髓mTOR磷酸化蛋白和mRNA表达，提示脊髓mTOR与慢性炎性内脏痛密切相关；给予隔药灸治疗后，其对慢性炎性内脏痛大鼠内脏痛缓解作用及对脊髓mTOR磷酸化蛋白和mRNA表达调控作用与鞘内注射RAP结果相似，提示隔药灸的镇痛作用可能与抑制脊髓mTOR活性相关。mTOR作为mTOR信号通路的核心和中间枢纽，在受到疼痛等各种因数刺激后被激活，进一步将信号传递至下游两个主要效应器：S6核糖体蛋白激酶1（S6K1）和真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1实用中医药杂志 2023年8月 第39卷8期（总第367期）JOURNAL OF PRACTICAL TRADITIONAL CHINESE MEDICINE 2023.Vol.39 No.81494（4E-BP1），进而调节mRNA转译25。本研究观察发现，慢性炎性内脏痛模型大鼠脊髓mTOR信号通路被激活后，4E-BP1、S6RP磷酸化蛋白和mRNA水平明显提高，4E-BP1、S6RP被激活，采用隔药灸和鞘内注射mTOR抑制剂RAP后，能有效降低4E-BP1、S6RP磷酸化蛋白和mRNA表达水平，提示隔药灸治疗慢性炎性内脏痛可能与抑制mTOR信号通路及其下游关键因子4E-BP1、S6RP活性相关。本次研究通过观察慢性炎性内脏痛大鼠脊髓mTOR信号通路及下游4E-BP1、S6RP磷酸化蛋白和mRNA表达水平及隔药灸干预后变化情况，推测隔药灸镇痛机制与抑制mTOR信号通路及下游关键蛋白的活性相关，且隔药灸镇痛作用具有多靶点的调节特点。实验在既往研究基础之上，以mTOR作为通路的核心，通过检测mTOR及下游4E-BP1、S6RP的磷酸化蛋白和mRNA表达水平，探讨隔药灸对慢性炎性内脏痛镇痛的中枢机制。研究结果表明，慢性炎性内脏痛大鼠脊髓mTOR、4E-BP1、S6RP的磷酸化蛋白和mRNA表达明显升高，mTOR信号通路被激活；经隔药灸干预后大鼠脊髓mTOR、4E-BP1、S6RP的磷酸化蛋白和mRNA表达受到抑制，活性降低，疼痛缓解，推测隔药灸发挥镇痛作用可能与抑制过度活化的mTOR信号通路密切相关。采用鞘内注射mTOR抑制剂RAP作为隔药灸疗效的阳性对照，可在一定程度上阐述隔药灸可能通过调控mTOR-4E-BP1/S6RP信号通路发挥镇痛作用。然而mTOR信号通路激活过程较为复杂。在本研究中，仅观察了mTOR及其下游4E-BP1、S6RP效应分子的表达变化，对于mTOR信号通路的上游激活情况未进一步深入研究；同时，在研究中仅采用鞘内注射mTOR抑制剂作为阳性对照，未采用siRNA或基因敲除等技术阻断mTOR，从而进一步明确mTOR信号通路在慢性炎性内脏痛中的作用及隔药灸的镇痛机制，有待于今后进一步的实验研究和验证。参考文献1 HAUSER W，BARANOWSKI A，MESSELINK B，et al.Taxonomies for chronic visceral painJ.PAIN，2020，161（6）：1129-1135.2 GRUNDY L，ERICKSON A，BRIERLEY S M.Visceral PainJ.Annual 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文章编号1004-2814（2023）08-1495-03摘要目的：观察中医三联疗法治疗盆腔炎性疾病湿热瘀结型的疗效。方法：80例按照随机数字表法分为两组各40例，对照组口服康妇炎胶囊，治疗组用中药保留灌肠、中药熏蒸、中药外敷三联疗法。结果：综合疗效总有效率治疗组95.0%，对照组77.5%，两组比较差异有统计学意义（P0.05）。治疗组中医证候疗效总有效率92.5%，对照组72.5%，两组比较差异有统计学意义（P0.05）。治疗组局部体征疗效率高于对照组（P0.05）。治疗后治疗组下腹疼痛、腰骶胀痛、带下量多及色黄质稠等积分均低于对照组（P0.05）。结论：中医三联疗法治疗盆腔炎性疾病湿热瘀结型疗效较好。关键词盆腔炎性疾病；中医三联疗法；对照治疗观察AbstractObjective：To observe the curative effect of triple therapy of traditional Chinese medicine in the treatment of pelvic inflammatory disease of damp heat and blood stasis type.Methods:Eighty cases were divided into two groups according to the random number table method,with 40 cases in each group.The control group were treated with Kangfuyan Capsule,while the treatment group were treated with triple therapy of traditional Chinese medicine retention enema,fumigation and external application of traditional Chinese medicine.Results:The total effective rate of comprehensive therapeutic effect was 95.0%in the treatment group while that was 77.5%in the control group.The difference between the two groups was statistically significant(P0.05).The total effective rate of TCM syndromes in the treatment group was 92.5%while that in the control group was 72.5%.The difference between the two groups was statistically significant(P0.05).The effective rate of local signs in the treatment group was higher than that in the control group(P0.05).After treatment,the scores of lower abdominal pain,lumbosacral distending pain,excessive leucorrhea and yellow consistency in the treatment group were lower than those in the control group(P0.05).Conclusion:The triple therapy of traditional Chinese medicine is effect