枸杞多糖对衰老小鼠MCE细胞高糖损伤后氧化应激的影响.pdf

13摇 Yao J,Zheng J,Cai J,et al.Extracellular vesicles derivedfrom human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate rathepatic ischemia鄄reperfusion injury by suppressing oxidativestress and neutrophil inflammatory response J.FASEB J,2019,33(2):1695鄄1710郾14摇 De Prabhu Y,Valsala Gopalakrishnan A郾 Can polyunsat鄄urated fatty acids regulate polycystic ovary syndrome via TGF鄄茁signallingJ.Life Sci,2021,276:119416郾15摇Shen H,Wang Y郾 Activation of TGF鄄茁1/Smad3 signa鄄ling pathway inhibits the development of ovarian follicle in poly鄄cystic ovary syndrome by promoting apoptosis of granulosa cellsJ.J Cell Physiol,2019,234(7):11976鄄11985郾16摇 Clark KL,George JW,Przygrodzka E,et al.Hippo signa鄄ling in the ovary:emerging roles in development,fertility,anddiseaseJ.Endocr Rev,2022,43(6):1074鄄1096郾收稿日期:2023鄄02鄄23摇 编校:孟玲玲枸杞多糖对衰老小鼠 MCE 细胞高糖损伤后氧化应激的影响贾丽敏1,王摇 伟1,柏摇 婷1,李强翔1,2摇(1郾 宁夏回族自治区人民医院内分泌科,宁夏摇银川摇 750002;2郾 湖南省老年医学研究所,湖南摇 长沙摇 410008)摘摇 要摇 目的:研究高糖环境下枸杞多糖(LBP)干预衰老小鼠角膜上皮(MCE)细胞后对氧化应激指标(ROS、SOD1)的影响。方法:根据培养基中葡萄糖浓度将 MCE 细胞分为五组培养 48 h:淤葡萄糖 5郾 5 mmol/L 组;于葡萄糖 25 mmol/L 组;盂葡萄糖200 mmol/L 组;榆葡萄糖200 mmol/L+LBP 200 滋g/ml 组;虞葡萄糖(200 mmol/L)+甘露醇(75 mmol/L)组,用免疫荧光染色各组细胞,使用 image J 定量分析 ROS 的具体数值,并用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组培养基上清中 SOD1 的含量,进行统计学分析。结果:淤与各组比较,葡萄糖浓度 200 mmol/L 组 ROS 水平最高(P0郾 01),葡萄糖 200 mmol/L+LBP200 滋g/ml组 ROS 水平低于葡萄糖浓度 200 mmol/L 组(P0郾 01)。于与各组比较,葡萄糖浓度 200 mmol/L 组 SOD1 水平最低(P0郾 01),葡萄糖 200 mmol/L+LBP 200 滋g/ml 组 SOD1 水平高于葡萄糖浓度 200 mmol/L 组(P0郾 01)。结论:LBP 通过降低氧化应激中 ROS 水平,升高 SOD1 水平,保护高糖损伤的 MCE 细胞。关键词摇 枸杞多糖;高糖损伤;小鼠角膜上皮细胞;氧化应激基金项目:宁夏回族自治区自然科学基金项目项目编号:2021AAC03312;中央引导地方科技发展专项项目项目编号:2020YDDF0043通讯作者:李强翔Effect of LBP on oxidative stress after high glucose injury in MCE cells摇 摇JIA Li鄄min1,WANG Wei1,BAI Ting1,et al(1.Department of Endocrinology,The People忆s Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region,Yinchuan 750002,China;2.Instituteof Geriatrics,Hunan Province,Changsha 410008,China)Abstract:Objective To study the effects of LBP on oxidative stress indicators ROS,SOD1 after intervention withmouse cornealepithelial(MCE)cells in a high glucose environment.Method MCE cells were divided into five groups according to the concentrationof glucose in the culture medium for 48 h:淤 glucose 5.5 mmol/L(group);于 glucose 25 mmol/L(group);盂 glucose200 mmol/L(group);榆 glucose 200 mmol/L+LBP 200 滋g/ml(group);虞 glucose(200 mmol/L)+mannitol(75 mmom/L)(group),cells in each group were stained with immunofluorescence,and specific values of ROS were quantified using image J.The content ofSOD1 in the supernatant of the culture medium via each group was detected by enzyme鄄linked immunosorbent assay(ELISA)and sta鄄tistically analyzed.Results 淤Compared with each group,the highest ROS level was found in the glucose concentration 200 mmol/Lgroup(P0.01),and the ROS level was lower in the glucose concentration 200 mmol/L+LBP 200 滋g/ml(group)than in the glu鄄cose concentration 200 mmol/L group(P0.01).于Compared with each group,the lowest SOD1 level was found in the glucose con鄄centration 200 mmol/L group(P0.01),and SOD1 levels were higher in the glucose 200mmol/L+LBP 200 滋g/ml(group)than inthe glucose concentration 200 mmol/L group(P99郾 8%);杜氏改良 Eagle 培养基(DMEM)(Hy鄄clone);FBS(Hyclone);青 链 双 抗(上 海 生 工);DMSO(sigma);SOD1 酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(江莱生物 JL34887);酶标检测仪(ThermoMK3 型);细胞培养箱(Thermo Scientific 8000);低速离心机(上海卢湘仪 TDZ4B鄄WS)。荧光倒置显微镜(OLYMPUS,IX71),超净工作台(苏州安泰科技有限公司),离心机(Eppendorf)。本研究经过本院医学伦理委员会同意。1郾 2摇 实验方法1郾 2郾 1摇 细胞培养与分组:取 13 个月龄小鼠 MCE 细胞,原代培养参照参考文献6的方法,进行免疫荧光鉴定后将细胞培养传代。胞悬浮液(1 ml)吸入15 ml 离心管内,加入 1 ml DMEM 完全培养基;混匀后 1 000 r/min 离心 5 min,弃去上清,加入 5 ml 含10%FBS、1%双抗、5郾 5 mmol/L 葡萄糖的 DMEM 完全培养基;置 37益、5%CO2培养箱中培养。显微镜下观察细胞生长状态,当细胞生长状态良好并铺满100 mm 细胞培养皿 90%时开始进行细胞传代,进行后续试验。试验根据培养基中葡萄糖浓度将MCE 细胞分为五组培养 48 h:淤葡萄糖5郾 5 mmol/L组;于 葡 萄 糖25mmol/L组;盂 葡 萄 糖200 mmol/L 组;榆 葡 萄 糖 200mmol/L+LBP200 滋g/ml 组;虞 葡 萄 糖(200 mmol/L)+甘 露醇(75 mmol/L)组。1郾 2郾 2摇免疫荧光法检测各组细胞中 ROS 荧光强度:各组细胞每孔加入 5 滋mol/L 的 ROS 探针,37益孵育 30 min,随后在室温孵 hochest 10 min,PBS 清洗后换成正常培养基。采用激光共聚焦显微镜观察并拍照,Image J 软件扫描统计分析结果,重复 3 次。1郾 2郾 3摇 ELISA 检测各组细胞中 SOD1 含量:取上述五组各组细胞上清进行 ELISA 实验,具体步骤参照ELISA 说明书。1郾 3摇 统计学方法:所有数据采用 SPSS22郾 0 统计学软件进行 t 检验,多样本均数间比较应用单因素方差分析,以 P0郾 05 为差异有统计学意义。2摇 结果2郾 1摇 各组细胞 ROS 比较:与葡萄糖 5郾 5 mmol/L 及葡萄糖 25 mmol/L 组比较,200 mmol/L 葡萄糖浓度MCE 细胞 ROS 升高(P0郾 01),葡萄糖 200 mmol/L+LBP 200 滋g/ml 组 ROS 升高(P0郾 01),葡萄糖200 mmol/L+甘露醇 75 mmol/L 组 ROS 升高。与葡萄糖浓度 200 mmol/L 比较,其余四组 MCE 细胞ROS 均降低(P0郾 01)。见图 1、表 1。2郾 2摇各组细胞 SOD1 比较:与 5郾 5 mmol/L 葡萄糖浓度组比较,200 mmol/L 葡萄糖浓度组 MCE 细胞SOD1 降低(P0郾 01)。与 25 mmol/L 葡萄糖浓度组比较,200 mmol/L 葡萄糖浓度 MCE 细胞 SOD1 降低(P0郾 01),与葡萄糖浓度 200 mmol/L 比较,葡萄糖浓度 5郾 5 mmol/L 组 SOD1 水平低(P0郾 05),葡萄糖 25 mmol/L 组 SOD1 水平低(P0郾 05),葡萄糖200 mmol/L+LBP 200 滋g/ml 组 SOD1 水平升高(P0郾 01),葡萄糖200 mmol/L+甘露醇75 mmol/L 组(P0郾 01)细胞 SOD1 升高。见表 1。图 1摇 各组细胞 ROS 荧光强度比较(伊200)1932吉林医学 2023 年 9 月第 44 卷第 9 期表 1摇 各组细胞 ROS 荧光强度、SOD1 浓度比较(x依s,n=3)组别ROS 荧光强度 SOD1 浓度(pg/ml)葡萄糖 5.5 mmol/L0.038依0.003愚11.5.15依11.60虞葡萄糖 25 mmol/L0.038依0.002愚103.40依5.10虞葡萄糖 200 mmol/L0.078依0.001于榆64.82依2.60于榆葡萄糖200 mmol/L+LBP200 滋g/ml 0.066依0.001于榆愚84.87依2.18淤盂愚葡萄糖 200 mmol/l+甘露醇0.063依0.001于榆愚89.50依4.10愚F 值172.08121.215P 值0.010.01摇 注:与葡萄糖 5郾 5 mmol/L 组比较,淤P0郾 05,于P0郾 01;与葡萄糖25 mmol/L 组比较,盂P0郾 05,榆P0郾 01;与葡萄糖浓度 200 mmol/L组比较,虞P0郾 05,愚P0郾 013摇 讨论摇 摇 糖尿病可引起多种眼部并发症。Schultz7于1981 年首次提出 DK,严重的 DK 会造成不可逆性的视力障碍。DK 的发病机制仍未完全清楚,国内外主流观点有三类:淤糖尿病糖基化终末产物形成及沉积;于角膜上皮细胞损伤后修复的信号通路异常;盂高糖环境下氧化应激。DK 的发病是复杂的过程,这三类机制并不是独立存在,而是共同作用导致角膜的损伤,但氧化应激贯穿整个发病过程。本试验通过检测氧化应激主要指标 ROS 及 SOD1,关注高糖损伤后 LBP 对 MCE 细胞的影响。LBP 是从枸杞子中分离并提炼得到的具有一定生物活性成分的多种糖蛋白复合物8,具有益精养血、滋肝补肾、明目消翳等功效。近年来,关于 LBP在糖尿病及其并发症治疗的研究越来越多,尤其在抗氧化、抑制细胞免疫方面9鄄10。ROS 反映细胞内氧化应激的水平,过量的 ROS 会损伤组织细胞,并引起机体代谢途径异常,导致一系列疾病的发生。研究表明,ROS 异常增高,可引起生物膜脂质过氧化,DAN 损伤,导致角膜细胞凋亡、坏死,引起DK11。在前期试验中,高糖浓度达到 200 mmol/L时,对 MCE 细胞损伤最大。本试验中高糖损伤的MCE 细胞 ROS 水平最高,在高糖损伤的 MCE 细胞中加入枸杞多糖 200 滋g/ml 后 48 h,ROS 水平略有降低,提示枸杞多糖可以降低高糖损伤后的 MCE 细胞 ROS 水平,但仍高于葡萄糖 5郾 5 mmol/L 及葡萄糖 25 mmol/L 组。可能机制为高血糖状态通过增加线粒体氧耗量损伤线粒体,导致线粒体功能障碍,从而上调 ROS 水平11。SOD 是抗氧化剂,是体内氧自由基清除剂,对机体起保护作用。SOD 水平反映细胞清除 ROS 的能力。在李立等12研究中显示,氧化反应中 SOD反应敏感,适宜作为抗氧化性的评价指标。既往研究表明枸杞多糖可调节老年糖尿病患者机体免疫并提高 SOD 水平,提升抗氧化能力13。枸杞多糖减轻糖尿病小鼠视网膜氧化应激反应及炎性反应,对糖尿病视网膜病变疗效明确14。SOD1 是 SOD 的主要亚型,占所有 SODs 的 80%,存在于细胞质中。本研究结果显示:高糖损伤后 MCE 细胞 SOD1 水平较低,经枸杞多糖干预后 SOD1 水平明显升高,表明枸杞多糖干预后清除高糖状态下 ROS 水平增高,抑制 MCE 细胞的氧化应激反应,提高细胞对高糖损伤的修复能力。综上所述,本实验发现枸杞多糖通过增加 SOD1的水平,下调 ROS 水平修复高糖环境对 MCE 细胞的损伤,提示枸杞多糖通过抑制过度氧化应激保护MCE 细胞。4摇 参考文献1摇 Lemieux I郾 Reversing type 2 diabetes:the time for lifestylemedicine has comeJ.Nutrients,2020,12(7):1974郾2摇Berrocal MH,Acaba LA,Acaba A郾 Surgery for diabeticeye complicationsJ.Curr Diabet Report,2016,16(10):99郾3摇 Quadrado MJ,Popper M,Morgado AM,et al郾 Diabetes andcorneal cell densities in humans by in vivo confocal microscopyJ.Cornea,2006,25(7):761鄄768郾4摇 朱晓丹,李光华,周摇旭,等 郾 枸杞多糖对高脂血症小鼠血脂及肝脏氧化应激的影响J.宁夏医科大学学报,2016,38(4):357鄄360郾5摇 杨新生,姜忠丽 郾 枸杞多糖的超声波辅助提取法及其抗氧化研究J.食品研究与开发,2016,37(10):73鄄77郾6摇 张摇 旭,李效岩,周摇洋,等 郾 小鼠角膜上皮细胞的原代培养C.哈尔滨:第九届全国中西医结合眼科学术交流会暨第八次东北亚国际眼科学术会,2010郾7摇 Schultz RO,Van Horn DL,Peters MA,et al郾 Diabetic ker鄄atopathyJ.Trans Am Ophthalmol Soc,1981,79:180鄄199郾8摇 张摇 玲,胡紫艳,金摇鑫 郾 枸杞多糖特性和单糖组成及木糖醇含量的分析J.中国食品卫生杂志,2022,34(4):657鄄662郾9摇 Wang Y,Hu X,Han J,et al郾 Integrated method of thermo鄄sensitive triblock copolymer鄄salt aqueous two phase extractionand dialysis membrane separation for purification of lycium bar鄄barum polysaccharideJ.Food Chem,2016,194:257鄄264郾10摇 张立鹏,彭摇凯,张博闻,等 郾 枸杞多糖对周围神经损伤修复的研究进展J.宁夏医学杂志,2020,42(10):959鄄960郾11摇 Roman鄄Pintos LM,Villegas鄄Rivera G,Rodriguez鄄Carriza鄄lez AD,et al郾 Diabetic polyneuropathy in type 2 diabetes melli鄄tus:inflammation,oxidative stress,and mitochondrial functionJ.J Diabetes Res,2016,2016:3425617郾2932吉林医学 2023 年 9 月第 44 卷第 9 期12摇李摇立,白雪涛,张宏伟,等 郾 长波紫外线照射对HaCaT 细胞氧化损伤作用的研究J.环境与健康杂志,2010,27(3):230鄄232郾13摇 曾丽容 郾 枸杞多糖对老年 2 型糖尿病免疫功能及抗氧化功能的影响J.中国民间疗法,2022,30(3):72鄄74郾14摇 张慧西,薛摇凯,高摇伟,等 郾 枸杞多糖对糖尿病小鼠视网膜内血管新生及氧化应激反应、炎症反应的抑制作用J.海南医学院学报,2016,22(20):2365鄄2368郾收稿日期:2023鄄02鄄23摇 编校:孟玲玲尿苷鄄胞苷激酶 2 对肺癌顺铂耐药性的影响及机制宋摇 淦,林摇 峰,蔡摇 恒,王红涛,汪曲兴,赵和平,夏小兵摇(麻城市人民医院,湖北摇 黄冈摇 438400)摘摇 要摇 目的:通过免疫组化方式分析尿苷鄄胞苷激酶(UCK)2 与肺癌顺铂耐药性相关性。方法:行手术切除的 80 例非小细胞肺癌(NSCLC)患者的病理标本,所有患者术前均未经放疗或化疗,术后根据 NCCN 治疗指南给予铂类方案化疗,静脉注射顺铂 30 mg/m2,d1鄄3,每 3 周重复,连续 4 个周期。并以患者接受肺癌根治手术的时间作为术后生存起始时间展开随访,根据随访结果分为铂类耐药组和铂类敏感组。比较两组患者肺癌组织 UCK2 阳性表达率,同时比较 UCK2 阳性与阴性组肺癌组织 STAT3、促进多药耐药(MDR鄄1)、多药耐药蛋白(MRP鄄1)阳性表达率及 3 年生存率。结果:铂类耐药组肺组织 UCK2阳性率明显高于铂类敏感组,差异有统计学意义(P0郾 01)。UCK2 阳性组肺组织 p鄄STAT3、MDR鄄1 及 MRP鄄1 阳性率均明显高于 UCK2 阴性组,差异有统计学意义(P0郾 01)。UCK2 阳性组患者的 3 年生存率明显低于 UCK2 阴性组,差异有统计学意义(P0郾 05)。结论:UCK2 阳性表达增加肺癌顺铂耐药风险,并可能通过活化 STAT3 途径促进肺癌顺铂耐药性,可望为降低肺癌化疗耐药提供新方向。关键词摇 免疫组化方式;尿苷鄄胞苷激酶 2;肺癌顺铂耐药性;相关性通讯作者:林摇 峰摇 摇 肺癌是全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,且近 30 年肺癌发病率增加约 5 倍,全球每年因肺癌死亡患者达 140 万,而我国肺癌死亡率达到30郾 83/10 万1。化疗是肺癌临床最主要的治疗手段,其中铂类联合其他药物是经典的化疗方案,但化疗过程中肿瘤细胞耐药也常有发生,导致肺癌综合化疗有效率仅为 30郾 0%40郾 0%,严重制约肺癌患者治疗及预后质量,已成为肺癌临床治疗所面临的重要挑战2。寻找预防和逆转肺癌顺铂耐药的方法是提高肺癌治疗效果的有效途径之一。基于此,从分子水平上研究肺癌顺铂耐药机制具有重要的临床意义。随着肺癌分子机制研究不断深入,多种肺癌潜在诊断和预后标志物逐渐被发现,其中尿苷鄄胞苷激酶(UCK)是核苷酸补救合成途径中的一种酶,具有催化尿苷和胞苷磷酸化为尿苷一磷酸和胞苷一磷酸的作用,其中作为 DNA 和 RNA 合成嘧啶核苷三磷酸的必经过程,因此 UCK 催化的磷酸化被认为是核苷酸补救合成途径的限速步骤3。UCK 包括UCK1、UCKL1 和 UCK2 三种亚型,其中 UCK2 结合底物的亲和力较高,催化尿苷和胞苷磷酸化的效率更快,其在正常情况下仅在人胎盘和睾丸中被检测发现,目前也有少量报道发现 UCK2 在乳腺癌和肝癌中表达与肿瘤分期和预后有关4,本研究的前期研究发现 UCK2 在肺癌组织中高表达,UCK2 的上调与肿瘤的侵袭、TNM 分期相关,而下调 UCK2 的表达可抑制肺癌细胞的增殖和迁移。本研究认为 UCK2可以作为肿瘤不良预后的生物标志物,因此采用免疫组化方式分析 UCK2 与肺癌顺铂耐药性相关性。1摇 资料与方法1郾 1摇 一般资料:研究对象选取麻城市人民医院2017年 6 月 2018 年 10 月行手术切除的 80 例非小细胞肺癌(NSCLC)患者的病理标本。纳入标准5:淤均符合第 9 版内科学中关于 NSCLC 相关诊断标准,且经病理活检证实;于收取标本前未接受放化疗等抗肿瘤治疗;盂无合并严重的心脑血管、肝肾等重要脏器组织疾病;榆均符合本研究所选化疗方案指征;虞均自愿参与本次研究且签署知情同意书。排除标准:淤小细胞肺癌或肺转移癌等其他肺部疾病;于伴有免疫系统、血液系统或神经系统等严重疾病者;盂未完成完整化疗方案者;榆随访配合度差或临床资料不全者。根据随访结果分为铂类耐药组和铂类敏感组,分别为 31 例和 49 例。铂类耐药组患者男 19例,女12 例,年龄45 80 岁,平均(61郾 47依8郾 30)岁,3932吉林医学 2023 年 9 月第 44 卷第 9 期