高效液相色谱法测定杜仲叶中4种成分含量.pdf

食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第5期 449能是炒制高温时，决明子中的泻下成分蒽醌苷受热分解，同时决明子中油脂也会部分破坏，造成泻下作用减弱。3 结论与讨论本文研究发现，以炒决明子制备的菊楂决明饮中大黄酚、橙黄决明素含量较生决明有明显增加，同时其泻下的作用也得到明显缓和，表明炒制有助于具有泻下作用的蒽醌苷类成分分解为游离蒽醌，有助于降血压、降血脂类有效成分的溶出。有鉴于此，临床应用菊楂决明饮时，应视患者辨证情况选用不同炮制规格的决明子组方。辨证论治是中医独有特色，中药药味不变时，可通过中药炮制来调整或者纠正药物的偏性、缓和药性8-9。决明子经过炒制后泻下作用缓和，用于菊楂决明饮中，使该方的泻下作用相应减弱。因此对于高血脂人群，脾虚便溏者，在服用菊楂决明饮时应选用炒决明，以避免出现腹泻等不良反应。参考文献1 毛水龙,杨明,乐武琴,等.菊楂决明饮对实验性高脂血症大鼠的影响J.浙江中西医结合杂志,2002,(11):11-12.2 董玉洁,蒋沅岐,刘毅,等.决明子的化学成分、药理作用及质量标志物预测分析J.中草药,2021,52(9):2719-2732.3 Hou J Y,Gu Y,Zhao S,et al.Anti-inflammatory effects of aurantio-obtusin from seed of Cassia obtusifolia L.through modulation of the NF-B pathway J.Molecules,2018,23(12):E3093.4 刘俊.决明子中主要肝毒性蒽醌类成分鉴别及其毒性作用机制研究D.广州:南方医科大学,2021.5 国家药典委员会.中华人民共和国药典M.2020年版一部.北京:中国医药科技出版社,2020:151.6 王旭,周旭晴,吴笛,等.决明二仁方对不同便秘模型小鼠排便及血清VIP、SP的影响J.湖南中医药大学学报,2022,42(5):732-737.7 寇真真.炮制对决明子主要成分及药效影响研究D.郑州:河南中医药大学,2016.8 徐义龙.决明子化学成分及炮制对其影响研究D.北京:中国中医科学院,2014.9 万敏.生、炒决明子多种成分的含量测定及其护肝作用的比较研究D.沈阳:辽宁中医药大学,2018.收稿日期：2022-06-17基金项目：湖南省市场监督管理局科技立项项目（编号：2021KJJH34）作者简介：黄继红，工程师，研究方向：食品安全检测，E-mail:高效液相色谱法测定杜仲叶中4种成分含量黄继红（湘西土家族苗族自治州食品药品检验所，湖南 吉首 416000）摘 要：目的 建立高效液相色谱法同时测定杜仲叶中绿原酸等4种活性成分含量的分析方法。方法 样品经过70%甲醇水溶液50 超声波提取30 min，采用高效液相色谱法，C18色谱柱梯度洗脱分离，外标法定量。结果 绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、异槲皮苷4种物质在各自的质量浓度范围内有良好的线性关系，回收率为95.03%99.96%。结论 通过重复性试验、待测液稳定性试验、加标回收试验和杜仲叶样品测定表明，该方法具有操作简单、重复性好、回收率高等优点。关键词：高效液相色谱法；杜仲叶；桃叶珊瑚苷；京尼平苷酸；绿原酸；异槲皮苷中图分类号：R284 文献标识码：A 文章编号：1672-979X（2023）05-0449-04DOI：10.3969/j.issn.1672-979X.2023.05.014Determination of Four Constituents in Eucommia Ulmoides Leaves by HPLCHUANG Ji-hong（Food and Drug Inspection Institute of Xiangxi Tujia and Miao Autonomous Prefecture,Jishou 416000,China）Abstract:Objective To establish an HPLC method for the simultaneous determination of four active constituents 450 食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第5期杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）为杜仲科植物，中华人民共和国药典2020年版一部记载，杜仲叶（杜仲科植物杜仲的干燥叶），具有补肝肾、强筋骨功能，并确定绿原酸为杜仲叶药材的主要药用有效成分，绿原酸含量不得少于0.08%1。研究表明，杜仲叶中含有木脂素类、环烯醚萜类、苯丙素类、黄酮类等多种化合物2-5，杜仲叶或其提取物具有抗氧化、抗炎杀菌、降血压、降血脂、降血糖、免疫调节、抗衰老等作用4-10。本文建立了高效液相色谱法（HPLC）同时测定杜仲叶中绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、异槲皮苷4种成分含量的分析方法，通过检测武陵山区3处种植基地杜仲叶中不同采收时间4种活性成分含量数据，为分析不同提取物的最佳采收期提供技术和数据参考。1 仪器与材料1.1 仪器与设备LC-20AT高效液相色谱仪（SPD-M20A光电二极管阵列紫外可见光检测器，日本岛津），KQ5200V型超声波清洗器（昆山市超声仪器公司），TG16-II医用离心机（湖南平凡科技），ML304T/02电子分析天平梅特勒-托利多仪器（上海）。1.2 材料与试剂桃叶珊瑚苷对照品（纯度98%，批号：MUST-21100811，成都曼思特）、京尼平苷酸对照品（纯度98%，批号：MUST-21062003，成都曼思特）、绿原酸（纯度99.7%，批号：21081161，坛墨质检-标准物质中心）、异槲皮苷对照品（纯度98%，批号：MUST-21041613，成都曼思特）；甲醇、乙腈、磷酸，色谱纯。1.3 试验样品武陵山区3处种植基地的新鲜杜仲叶，于2021年711月每月采集一批次，60 低温烘干，粉碎过筛后，阴凉干燥处保存。2 方法与结果2.1 方法2.1.1 对照品溶液的配制 称取适量桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸，异槲皮苷（精确至0.0001 g），加入70%甲醇水溶液超声溶解，定容，配制成桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、异槲皮苷浓度分别为1.02，1.06，1.05，1.07 mg/ml的混合对照品储备溶液。2.1.2 色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18色谱柱（4.6 mm250 mm，5 m）；柱温：30；检测器波长范围：190400 nm，检测波长：桃叶珊瑚苷200 nm、京尼平苷酸238 nm、绿原酸326 nm、异槲皮苷354 nm；流动相：0.1%磷酸水溶液（A）、乙腈（B），流速：1 ml/min；进样量：10 l。表1 不同时间段的流动相梯度时间/min流动相A/%流动相B/%0595552095855152035856815323540683240469552.1.3 检测波长的选择 对照品经HPLC分离和单个对照品以出峰时间定位后，对不同浓度的桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、异槲皮苷色谱峰在190400 nm区间吸收光谱图分析比较，并考虑样品的实际检测情况，对4种成分选取了各自适合的检测波长：桃叶珊瑚苷200 nm、京尼平苷酸238 nm、绿原酸326 nm、异槲皮苷354 nm，对照品4种检测波长比较见图1。including chlorogenic acid from Eucommia ulmoides leaves.Methods The samples were extracted by ultrasonic extraction with 70%methanol aqueous solution at 50 for 30 minutes,separated by gradient elution using a C18 chromatography column,and quantified by external standard method.Results Chlorogenic acid,aucubin,geniposidic acid and isoquercitrin showed good linear relationships within their own mass concentration ranges,and the recovery rates were 95.03%-99.96%.Conclusion The repeatability test,the stability test of solution to be tested,the recovery test of standard addition and the actual Eucommia ulmoides leaves sample determination show that the method has the advantages of simple operation,good repeatability and high recovery rate.Key Words：HPLC;Eucommia ulmoides leaves;aucubin;geniposidic acid;chlorogenic acid;isoquercitrin食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第5期 451t/minA：对照品354 nm色谱图；B：对照品326 nm色谱图；C：对照品238 nm色谱图；D：对照品200 nm色谱图；1：桃叶珊瑚苷；2：京尼平苷酸；3：绿原酸；4：异槲皮苷图1 对照品4种检测波长比较图2.1.4 样品前处理方法 称取制备好的样品约0.5 g置入50 ml离心管，加入25 ml 70%甲醇水溶液，混匀，50 超声波提取30 min，冷却至室温，5000 r/min离心5 min，取上清适当稀释后过0.45 m有机微孔滤膜，待测。2.2 标准曲线取2.1.1项混合对照品储备溶液适量，用70%甲醇水溶液稀释成桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸，异槲皮苷质量浓度分别为51，53，52.5，53.5 g/ml的中间液，再用70%甲醇水溶液稀释成质量浓度为中间液质量浓度的1.0，0.4，0.2，0.1，0.04，0.02倍的6个不同质量浓度的混合对照品溶液。按2.1.2项条件进样分析，以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线。结果表明，各成分在各自的质量浓度范围内均有良好的线性关系，且分离效果良好，线性关系结果见表2，混合对照品和杜仲叶样品色谱图（波长：200 nm）见图2。2.3 重复性试验称取同一批次的杜仲叶样品6份，按2.1.2项和2.1.4项下方法对样品进行前处理和进样分析，根据各成分标准曲线进行定量分析，检测含量结果以干基计，计算各成分含量相对标准偏差（RSD）。结果，桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、异槲皮苷平均含量分别为17.09，8.28，38.17，3.49 mg/g，RSD分别为2.08%，3.60%，0.48%和0.68%，表明方法重复性较好。t/minA：混合对照品；B：样品；1：桃叶珊瑚苷；2：京尼平苷酸；3：绿原酸；4：异槲皮苷图2 混合对照品和杜仲叶样品液相色谱图（波长：200nm）表2 杜仲叶中4种成分标准曲线线性关系成分线性范围/gml-1线性回归方程r桃叶珊瑚苷1.0251Y=11 593.9X-1579.980.9999京尼平苷酸1.0653Y=15 208.4X-597.1820.9999绿原酸1.0552.5Y=32 972.1X-6184.680.9999异槲皮苷1.0753.5Y=22 229.8X-900.4590.99992.4 待测溶液稳定性试验取杜仲叶样品，按2.1.2项和2.1.4项下方法对样品进行前处理和进样分析，每6 h进一次样，持续24 h，记录各成分的峰面积，并计算各成分峰面积RSD，桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、异槲皮苷峰面积RSD分别为0.82%，0.13%，0.10%，0.42%，表明样品待测液在24 h内有良好的稳定性。2.5 加标回收试验 称取已测桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、异槲皮苷4种成分含量分别为3.04，0.93，2.77，0.46 mg/g的同一批次的杜仲叶样品6份，每份约0.5 g，分别加入混合对照品溶液（按2.1.1 项下方法配制的桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸，异槲皮苷质量浓度分别为1.49，0.93，1.30，0.70 mg/ml的混合对照品溶液）0.5 ml和70%甲醇水溶液24.5 ml，按2.1.2项和2.1.4项下方法对样品进行前处理和进样分析，计算各成分的加标回收率。结果表明，桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、异槲皮苷的加标回452 食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第5期收率分别为99.96%，99.40%，95.03%，95.46%，RSD分别为3.33%，2.13%，2.82%，1.31%。2.6 样品检测称取1.3项下杜仲叶样品约0.5 g，按2.1.2项和2.1.4项下方法对样品进行前处理和进样分析，含量结果以干基计，结果见表3。由表3可见，杜仲叶样品中4种成分总体上含量高低依次为绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸和异槲皮苷，绿原酸含量相对稳定，含量为19.3252.55 mg/g。桃叶珊瑚苷和京尼平苷酸采集时间不同含量差别较大，含量分别为2.8740.79和1.1724.98 mg/g。异槲皮苷的含量相对较少，含量为2.559.83 mg/g。在不同的采收时期，绿原酸和异槲皮苷含量相对稳定，桃叶珊瑚苷和京尼平苷酸含量差别较大。绿原酸和异槲皮苷在11月份含量最高，桃叶珊瑚苷和京尼平苷酸在9月份含量最高。表3 杜仲叶样品检测结果表（n=3）样品采收时间样品采集地含量/mgg-1桃叶珊瑚苷京尼平苷酸 绿原酸 异槲皮苷7月1号21.1118.5233.374.702号10.564.3827.213.823号16.808.237.753.448月1号6.485.8835.169.832号20.1911.9128.803.263号4.413.5727.383.529月1号35.2014.4232.283.332号40.7924.9833.752.943号23.5717.2143.42.8410月1号10.772.7123.644.392号2.871.8919.324.113号31.389.6732.242.5511月1号7.111.1743.527.862号8.271.7441.426.363号13.964.4952.555.193 结论本文建立了一种同时测定杜仲叶样品中桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、异槲皮苷4种成分的试验方法，4种成分在各自的质量浓度范围内均有良好的线性关系；此法重复性好、回收率高、样品前处理操作简单，适合多批次样品连续进样。对武陵山区种植杜仲基地采收样品检测结果表明，杜仲叶样品中4种成分总体上含量高低依次为绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸和异槲皮苷，桃叶珊瑚苷和京尼平苷酸在9月份含量最高，绿原酸和异槲皮苷在11月份含量最高。参考文献1 国家药典委员会.中华人民共和国药典S.2020年版一部.北京:中国医药科技出版社,2020:173.2 曾桥,韦承伯,吕生华.杜仲叶主要活性成分研究进展J.安徽农业科学,2017,45(34):133-135.3 吴红艳,彭呈军,邓后勤.杜仲叶化学成分研究进展J.食品工业科技,2019,40(17):360-364.4 龚频,韩业雯,翟鹏涛,等.杜仲叶的活性成分、药理作用及其在食品加工中的应用J.食品工业科技,2022,43(10):395-4045 项丽玲,温亚娟,苗明三.杜仲叶的化学、药理及临床应用分析J.中医学报,2017,32(1):99-102.6 曾桥,韦承伯.杜仲叶药理作用及临床应用研究进展J.药学研究,2018,37(8):482-486,489.7 袁天翊,方莲花,吕扬,等.杜仲叶的药理作用研究进展J.中国中药杂志,2013,38(6):781-785.8 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