高效液相色谱法测定大鼠口服玉米黄素双棕榈酸酯后胃肠道含量变化.pdf

宁夏医科大学学报4缘卷枸杞作为一种药食两用的植物，广泛分布于我国宁夏、青海和新疆等地。传统医学认为，枸杞具有“滋肝明目，清肺补肾”的功效1，现代药理研究证实其具有调节免疫、保肝2-3、抗氧化损伤4、保护视力5等作用。类胡萝卜素是枸杞中的主要功效成分，97%以上的类胡萝卜素是以酯化形式存在的6-7。其中，仅玉米黄素双棕榈酸酯（zeaxan原thin dipalmitate，ZDP）的含量即达 80%8。ZDP 为玉米黄素（zeaxanthin，ZE）的脂肪酸形式，为游离态 ZE 的两侧羟基分别与棕榈酸结合而形成的天然类胡萝卜素酯。ZDP 是通过饮食获得的脂质性类胡萝卜素，人体无法合成9。研究10-11表明，ZDP 可以改善视网膜病变，并且可以治疗肝脏疾病。体外实验表明，当存在胰脂肪酶和羧基酯脂肪酶时，ZDP 的水解速率由 1.7%提高到 29.5%，在小肠中以游离 ZE 的形式被吸收7，12，而仅加入胰酶和体外消化模型中的胰脂肪酶似乎不足以模拟体内消化。口服药物吸收慢，影响因素多，但具有服用方便、安全、接受度高等优点，为目前最为常见的一种给药方式。研究影响生物利用度较低的口服药物吸收的因素，对于提高药物的吸收率，改善药物的临床效果有着重大意义。本研究旨在通过高效液相色谱法（HPLC）测定Z阅孕 在胃肠道内的含量变化，探讨口服 ZDP 在胃肠道消化吸收及发挥作用的机制，为进一步开发 ZDP 口服产品提供依据。1仪器与材料1.1仪器HPLC 仪（Agilent 1260 型）购自美国安捷伦科技公司；滤膜（0.22 滋m）购自上海青阳生物科技有限公司；精密天平（Sartorius BP 211D 型）购自德国赛多利斯公司；超纯水处理系统（Milli-Q型）购自美国 Millipore；离心机（TGL-18C 型）购自上海安亭科学仪器厂；涡旋混合器购自北京中西远大科技有限公司。1.2试药在阅孕 对照品（瑞士 CaroteNature 原装进口，纯度为 96.9%），ZE（瑞士 Carote晕ature 原装进口，纯度为 95%）、10 原载脂蛋白原茁-胡萝卜素（瑞士文章编号：1674-6309（2023）07-0726-05技术与方法收稿日期：2021-11-24基金项目：宁夏医科大学校级课题（XM2019011）；宁夏自然科学基金项目（2021AAC03140）；宁夏回族自治区重点研发项目（2019BFG02026；2020BBF02006）作者简介：雷艳丽（1992），实验师，硕士，从事中药活性物质基础及应用研究。E-mail：通信作者：冉林武（1979），副教授，博士，研究方向为营养与疾病。E-mail：高效液相色谱法测定大鼠口服玉米黄素双棕榈酸酯后胃肠道含量变化雷艳丽1，谢娜娜1，鲁晓丽2，米佳3，禄璐3，闫亚美3，曹有龙3，冉林武4，5（1.宁夏医科大学基础医学院，银川750004；2.宁夏医科大学检验学院，银川750004；3.宁夏农林科学院枸杞科学研究所，银川750002；4.宁夏医科大学公共卫生学院，银川750004；5.宁夏医科大学学报编辑部，银川750004）摘要：目的研究玉米黄素双棕榈酸酯经大鼠口服后在胃肠道内容物、粪便中的含量及存在形式，为功效评价提供依据。方法24 只 S阅 大鼠分为空白组和口服玉米黄素双棕榈酸酯组（低剂量组 0.1 mL/100 g、中剂量组 0.2 mL/100 g、高剂量组 0.4 mL/100 g），饲养 90 d 后分别收集大鼠粪便、胃内容物、空肠和回肠段内容物，采用高效液相色谱法（HPLC）测定玉米黄素和玉米黄素双棕榈酸酯。结果大鼠口服玉米黄素双棕榈酸酯后，胃内容物中含有玉米黄素双棕榈酸酯（100耀300 滋g g-1），与给药剂量呈正比；空肠中玉米黄素和玉米黄素双棕榈酸酯的含量是胃内容物中的 2 倍左右；回肠内容物中，高剂量组玉米黄素的含量是低、中剂量组的 100倍；粪便中玉米黄素双棕榈酸酯的含量为玉米黄素的 10 倍左右。结论玉米黄素双棕榈酸酯在胃内不易分解，受肠道内环境、肠道酶的影响在肠道内容物中部分转换为玉米黄素，剩余大量药物则以原形在粪便中被排出体外。关键词：枸杞；玉米黄素双棕榈酸酯；玉米黄素；吸收中图分类号：R285.1文献标识码：ADOI院10.16050/ki.issn1674-6309.2023.07.014第 45 卷7 期2023 年 7 月宁夏医科大学学报Journal of Ningxia Medical University726窑窑7期CaroteNature 原装进口，纯度为 95%），在阅孕 提取物（宁夏农林科学院枸杞学研究所，纯度为93.3%），二氯甲烷（DCM）、乙腈（ACN）与甲醇（MT）为色谱纯购自美国云isher公司；实验中用到的水为纯净水。1.3动物雄性 SD 大鼠，24 只，SPF 级，68 周龄，体质量 200耀220 g 宁夏医科大学实验动物中心，合格证号：SCXK（宁）2015-0001。大鼠饲养环境温度为 18耀22 益，湿度为 40%耀70%，保持自然昼夜节律光照（12 h/12 h），自由摄食饮水。2实验方法2.1动物实验SD 大鼠 24 只（200耀220 g），分为空白组和给药组，适应性饲养后，对照组灌胃 0.2 mL/100 g生理盐水，给药组灌胃 ZDP 提取物（低剂量组0.1 mL/100 g、中剂量组 0.2 mL/100 g、高剂量组0.4 mL/100 g）。给药组于 90 d 使用代谢笼分笼饲养，收集粪便。粪便收集结束后及时更换笼盒，收集的粪便置于离心管中于-80 益冰箱保存。实验大鼠，禁食不禁水 12 h，二氧化碳安乐死后立即打开腹腔，冰上操作，剖开胃、空肠、回肠等，收集其内容物置于离心管中于-80 益冰箱保存。2.2ZDP 的 HPLC 方法建立2.2.1色谱条件色谱柱：Waters YMC C30 col原umn（250mm伊4.6mm ID，5 滋m）；流速 1.0 mL min-1；流动相 A 为 MT颐ACN颐水（82颐14颐4）v；流动相 B 为DCM；检测波长 450 nm；进样体积 10 滋L，见表 1。表 1HPLC 法测定 ZDP 的梯度程序时间/minA/%B/%095589010107030183565201486253070308614359552.2.2标准品溶液的配制精密称取适量 ZDP、ZE、10 原载脂蛋白原茁-胡萝卜素置于 10 mL 棕色容量瓶中，加入适量 DCM 超声至完全溶解，DCM定容至刻度，配制成 0.1 mg mL-1的溶液，进样前经 0.22 滋m 滤膜过滤。2.2.3标准曲线的制备精密移取适量对照品溶液，用 DCM 稀释配成含 10 原载脂蛋白原茁-胡萝卜素（0.125、0.25、0.5、1、2、4 滋g mL-1）；在E（10、5、2.5、1.25、0.625、0.125 滋g mL-1）；在DP（10、5、2.5、1.25、0.625、0.125 滋g mL-1）的不同溶液，按 2.2.1的色谱条件进样，记录色谱图峰面积。以药物浓度（X）为自变量，峰面积为因变量进行工作曲线的最小二乘法拟合。2.2.4专属性选择杂质多、干扰大的粪便作为待测成分的色谱专属性进行分析，记录图谱。2.3样品提取2.3.1内容物的提取精密称重各大鼠胃内容物、空肠内容物、回肠内容物，记录其质量，加入200 滋L无水乙醇、200滋L 0.1%维生素 C 充分混合均匀。加入 600 滋L DCM 提取（涡旋混合 5 min，4 益离心，3 000 r min-1，10 min）。吸取下层液体，使用 0.22 滋m 有机滤膜过滤后进行 HPLC 分析（注：样品提取过程避光操作）。2.3.2粪便中药物提取全过程避光条件下操作。精密称重各组大鼠粪便质量，研钵研磨充分后，称取 0.5 g 粉末置于 15 mL 离心管中，加入 1 mL无水乙醇、1 mL 0.1%维生素 C 充分混合均匀。加入 2.5 mL DCM 提取（涡旋混合 5 min，4 益离心，3 000 r min-1，10 min）。吸取下层液体，使用0.22 滋m 有机滤膜过滤后进行 HPLC 分析。3实验结果3.1标准曲线10 原载脂蛋白原茁-胡萝卜素的回归方程：y=115.67x+2.396 8，r2=0.999 7；ZE 的回归方程：y=156.75x+23.568，r2=0.998 7；ZDP 的回归方程：y=74.971x+12.458，r2=0.999 2。结果表明，3 种物质在一定浓度范围内线性良好。3.2专属性由图 1 可知，所建立的 HPLC 方法能同时检测 10 原载脂蛋白原茁-胡萝卜素、ZE、ZDP 3 种物质，且不产生干扰，专属性良好。3.3ZDP 在大鼠胃肠道中的含量测定3.3.1大鼠胃内容物中的药物含量由图 2 可知，长期口服 ZDP 后，大鼠胃内容物中含有 ZDP（100耀300 滋g g-1），且根据给药剂量呈剂量依赖性；胃中所测到的 ZE 较少，表明 ZDP 在胃内容物中消化成 ZE 的量较少或者可能性低。3.3.2大鼠空肠内容物中的药物含量由图 3可知，长期口服 ZDP 后，大鼠空肠内容物中含有ZDP、ZE，且 ZDP 在空肠内容中的含量决定了 ZE的含量。空肠中 ZDP、ZE 的含量是胃内容物中的2 倍左右，是由于给药后 24 h 进行采样，多数药物已到达肠道位置。第 45 卷7 期2023 年 7 月宁夏医科大学学报Journal of Ningxia Medical University727窑窑宁夏医科大学学报4缘卷低剂量组中剂量组高剂量组空白组低剂量组中剂量组高剂量组空白组50040030020010003025201510503.3.3大鼠回肠内容物中的药物含量由图 4可知，长期口服 ZDP 后，大鼠回肠内容物中含有ZDP、ZE，低剂量组、中剂量组中 ZE 的含量约为ZDP 的 10%，高剂量组中 ZE 的含量约为 ZDP 的25%，且 ZE 的含量是低、中剂量组的 100 倍，ZDP 在大鼠回肠中的含量决定了 ZE 的含量。3.3.4大鼠粪便中的药物含量由图 5 可知，口服 ZDP 后，粪便中含有大量的 ZDP 和少量 ZE，排出的 ZDP 的含量是 ZE 的 10 倍左右，表明未被吸收的 ZDP 大量地以原形被排出体外。4讨论药物口服后通过胃肠道吸收是一个极为复杂的生理过程。吸收速率、吸收程度与药物的分子大小、亲水/亲脂性等因素紧密相关，适宜的亲水/亲脂性有助于药物跨过黏膜进而被吸收13。本研究在大鼠灌胃 ZDP 后，给予不同剂量的 ZDP后，测定胃肠道内容物，含量与给药剂量呈正比，提示 ZDP 在胃内不易受环境及蛋白酶的影响，很少被分解为 ZE。测定空肠、回肠内容物，结果表明，ZDP 在肠道内分解，产生了 ZE，但具体影A.空白粪便；B.混标；C.空白粪便+混标；D.给药样品；a.10-载脂蛋白-胡萝卜素；b.ZE；c.ZDP。图 1大鼠粪便样品 HPLC 分析图谱A.ZE；B.ZDP。图 2大鼠口服 ZDP 90 d 后胃内容物中的药物含量测定AB第 45 卷7 期2023 年 7 月宁夏医科大学学报Journal of Ningxia Medical UniversityABCD201510504003002001000mAUmAUmAUmAU1612840时间/min0 1 2 3 4 5 6 7 8 910111213141516171819202122232425262728293031323334353637bbbbaaccc时间/min0 1 2 3 4 5 6 7 8 910111213141516171819202122232425262728293031323334353637时间/min0 1 2 3 4 5 6 7 8 910111213141516171819202122232425262728293031323334353637时间/min0 1 2 3 4 5 6 7 8 9101112131415161718192021222324252627282930313233343536371612840728窑窑7期响其代谢行为的因素还不明确，可能是肠道内的环境及细菌共同作用的结果。粪便中，ZDP 原形排出的含量是 ZE 的 10 倍左右，表明 ZDP 吸收后以一定 ZE 的形式存在，不被吸收的 ZDP 及未转换成 ZE 的剩余 ZDP 将以大量的 ZDP 原形通过粪便排出。ZDP 作为亲脂性的类胡萝卜素，体外实验表明，脂肪酶和羧基酯脂肪酶在小肠中将ZDP 水解成游离的 ZE，即在小肠中被吸收2，7。并且肠上皮细胞中没有检测到 ZDP 的存在，仅有一定游离的 ZE 和 ZE 单酯14，同时证明了肠道中的 ZDP 确实会转化成 ZE。本研究发现，ZDP 口服后在肠道中转换成ZE 的过程与剂量相关，高剂量组在回肠中的 ZE含量最高。另一项研究显示，人体受试者摄入ZDP 和 ZE 后，在收集的血液样本中未检测到ZDP；然而，与非酯化 ZE 的摄入相比，ZDP 组血液中的 ZE 含量更高，该研究假设 ZDP 的非极性性质，在脂肪酶活性激活之前形成有效的胶束而发挥作用15。相应地，健康的老年受试者以牛奶为基础的枸杞子配方补充 90 d 后使血浆中的ZE 增加了 26%，抗氧化活性增加了 57%16。因此，脂肪酶的存在促进了人体对 ZE 的吸收。研究17-18显示，ZDP 的摄取增加了 ZE 在血液、黄斑、脾脏、肝脏和脂肪组织中的含量。ZDP 虽然未能在血液中被检测到，但是其摄入后提升了 ZE 在组织器官中的含量，有助于枸杞发挥其传统功效，而有关 ZDP 代谢和生物利用的具体途径及相关机制还需要进行深入研究。本研究考察了大鼠长期口服 ZDP 后胃肠道及粪便中的药物含量，明确了 ZDP 在胃肠道、粪便中的含量与存在形式，进而探讨了 ZDP 吸收的可能机制，为深入研究枸杞并阐明枸杞中 ZDP 的吸收机制奠定了基础。参考文献：1 Wang Yanping.Chinese pharmacopoeia:securing themedication safety and efficiencyJ.China Standard原ization，2015，（4）：60-63.2 Xiao J，Wang JT，Xing FY，et al.Zeaxanthin dipalmi原tate therapeutically improves hepatic functions in analcoholic fatty liver disease model through modulating低剂量组中剂量组高剂量组空白组低剂量组中剂量组高剂量组空白组504030201001 0008006004002000低剂量组中剂量组高剂量组空白组低剂量组中剂量组高剂量组空白组1 0008006004002000100806040200低剂量组中剂量组高剂量组空白组低剂量组 中剂量组高剂量组空白组50040030020010010501 6001 4001 2001 000800150100500图 3口服 ZDP 90 d 后大鼠空肠内容物中的药物含量测定图 4口服 ZDP 90 d 后大鼠回肠内容物中含量测定图 5大鼠口服 ZDP 90 d 后粪便中含量测定第 45 卷7 期2023 年 7 月宁夏医科大学学报Journal of Ningxia Medical University729窑窑宁夏医科大学学报4缘卷MAPK pathway J.PLoS One，2014，9（4）：e95214.3 Kim HP，Lee EJ，Kim YC，et al.Zeaxanthin dipalmi原tate from Lycium chinense fruit reduces experimental原ly induced hepatic fibrosis in rats J.Biol Pharm Bull，2002，25（3）：390-392.4 Johnson EJ.Role of lutein and Zeaxanthin in visualand cognitive function throughout the lifespan J .NutrRev，2014，72（9）：605-612.5 Milani A，Basirnejad M，Shahbazi S，et al.Carotenoids：biochemistry，pharmacology and treatment J.Br JPharmacol，2017，174（11）：1290-1324.6 Wong JC，Kaplan HS，Hammond BR.Lutein and Zeax原anthin status and auditory thresholds in a sample ofyoung healthy adults J.Nutr Neurosci，2017，20（1）：1-7.7Wen X，Hempel J，Schweiggert RM，et al.Screeningof critical factors influencing the efficient hydrolysis ofZeaxanthin dipalmitate in an adapted in vitro-diges原tion model J.Food Chem，2018，257：36-43.8 肖佳，高昊，周正群，等.枸杞属中枸杞红素类成分研究进展 J.科学通报，2017，62（16）：1691-1698.9 Tapiero H，Townsend DM，Tew KD.The role ofcarotenoids in the prevention of human pathologies J.Biomedecine Pharmacother，2004，58（2）：100-110.10Liu F，Liu XB，Zhou YM，et al.Wolfberry-derivedZeaxanthin dipalmitate delays retinal degeneration ina mouse model of retinitis pigmentosa through mod原ulating STAT3，CCL2 and MAPK pathways J.J Neu原rochem，2021，158（5）：1131-1150.11Bahaji Azami NL，Sun MY.Zeaxanthin dipalmitatein the treatment of liver disease J.Evid Based Com原plement Alternat Med，2019，1475163.12Chitchumroonchokchai C，Failla ML.Hydrolysis ofZeaxanthin esters by carboxyl ester lipase during di原gestion facilitates micellarization and uptake of thexanthophyll by Caco-2 human intestinal cells J.J Nu原tr，2006，136（3）：588-594.13 许智颖，黄芳，方悦.影响口服药物吸收的因素探讨 J.海峡药学，2016，28（6）：248-249.14 Breithaupt DE，Weller P，Wolters M，et al.Compari原son of plasma responses in human subjects after theingestion of 3R，3R-Zeaxanthin dipalmitate fromwolfberry（Lycium barbarum）and non-esterified 3R，3R-Zeaxanthin using chiral high-performance liq原uid chromatography J.Br J Nutr，2004，91（5）：707-713.15 Bucheli P，Vidal K，Shen LS，et al.Goji berry effectson macular characteristics and plasma antioxidantlevels J.Optom Vis Sci，2011，88（2）：257-262.16 Cheng CY，Chung WY，Szeto YT，et al.Fasting plas原ma Zeaxanthin response to Fructus barbarum L.（wolfberry；Kei Tze）in a food-based human supple原mentation trial J.Br J Nutr，2005，93（1）：123-130.17Leung I，Tso M，Li W，et al.Absorption and tissuedistribution of Zeaxanthin and lutein in rhesus mon原keys after taking Fructus lycii（Gou Qi Zi）extract J.Invest Ophthalmol Vis Sci，2001，42（2）：466-471.18Toyoda Y，Thomson LR，Langner A，et al.Effect ofdietary Zeaxanthin on tissue distribution of Zeaxan原thin and lutein in quailJ.Invest Ophthalmol Vis Sci，2002，43（4）：1210-1221.（责任编辑：常晓玉）Determination of Zeaxanthin Dipalmitate in the Gastrointestinal Tract ofRats via Oral Administration by High Performance LiquidChromatographyLEI Yanli1，XIE Na na1，LU Xiaoli2，MI Jia3，LU Lu3，YAN Yamei3，CAO Youlong3，RAN Linwu4，5（1.School of Basic Medical Science，Ningxia Medical University，Yinchuan750004，China；2.School ofInspection，Ningxia Medical University，Yinchuan750004，China；3.Institute of Wolfberry EngineeringTechnology，Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Yinchuan750002，China；4.School ofPublic Health，Ningxia Medical University，Yinchuan750004，China；5.Editorial Department of Journal ofNingxia Medical University，Yinchuan 75000，China）Abstract：ObjectiveTo investigate the content and form of zeaxanthin dipalmitate in the gastrointestinal tractand feces of SD rats after oral administration，and to provide a basis for the efficaoy evalua-（下转第 751 页）第 45 卷7 期2023 年 7 月宁夏医科大学学报Journal of Ningxia Medical University730窑窑7期tion.MethodsA total of 24 rats were bred for 90 days and divided into blank group and oral zeaxanthin di-palmitate group（low-dose group 0.1 mL/100 g，medium-dose group 0.2 mL/100 g，high-dose group 0.4 mL/100g）.Feces，stomach contents，jejunum and ileum contents were determined by HPLC method for zeaxanthin andzeaxanthin dipalmitate.ResultsAfter oral administration of zeaxanthin dipalmitate by rats，the gastric contentspecies containing zeaxanthin dipalmitate（100-300 滋g g-1）was proportional to the dose；the content of zeaxan-thin dipalmitate and zeaxanthin in the jejunum was twice that of the gastric content.In the contents of the ileum，the content of zeaxanthin in the high-dose group was 100 times that of the low-dose and middle-dose groups；the content of zeaxanthin dipalmitate in feces was about 10 times that of zeaxanthin.ConclusionZeaxanthindipalmitate is not easily decomposed in the stomach，and may be affected by the intestinal environment and in-testinal enzymes.Zeaxanthin dipalmitate is converted into a certain amount of zeaxanthin in the intestinal con-tents，and a large amount of zeaxanthin dipalmitate is excreted from the feces in its original form.Key words：Lycium barbarum L.；zeaxanthin dipalmitate；zeaxanthin；absorptionDiscussion on the Prevention and Treatment of Ulcerative Colitis withChinese and Western Medicine Based on the Concept of Prevention andTreatmentGENG Mingsheng1，CHENG Xiaoping2，LI Cuijuan1，3，4，LI Ya na1，WANG Bo1（1.Shanxi University of Chinese Medicine，Xianyang712046，China；2.Shanxi Chinese MedicineHospital，Xi an710003，China；3.Shanxi Key Laboratory of TCM Constitution and Disease Prevention andControl，Xianyang712046，China；4.Key Research Office of TCM Zang Xiang Theory of ShanxiAdministration of Traditional Chinese Medicine，Xianyang712046，China）Abstract：Ulcerative colitis is a kind of intestinal inflammation with unknown etiology.The condition is repeatedand lingering.It has a certain tendency of canceration and is difficult to be completely cured.Early preventionand treatment of the disease is particularly important.This article is based on the idea of“treating diseases be-fore they occur”，discussing the joint prevention and treatment of ulcerative colitis by Chinese and Westernmedicine from three aspects：prevention before diseases，prevention and treatment of existing diseases，and pre-vention and treatment after diseases，in order to provide a theoretical basis for clinical treatment of ulcerativecolitis.Key words：ulcerative colitis；treating diseases before they occur；prevention and cure；health preservation；condition monitoring（上接第 730 页）第 45 卷7 期2023 年 7 月宁夏医科大学学报Journal of Ningxia Medical University751窑窑