高血压脑出血患者脑组织microRNA表达谱及生物信息学分析.pdf

四川医学2 0 2 3年9 月第44卷（第9 期）SichuanMedical Journal,2023,Vol.44,No.9905doi:10.16252/ki.issn1004-0501-2023.09.002论著高血压脑出血患者脑组织microRNA表达谱及生物信息学分析青成朗，肖文峰”，刘峻伶，李强，陈礼刚，蒋正方1（1.西南医科大学附属医院神经外科，四川泸州6 46 0 0 0;2.四川绵阳四四医院神经外科，四川绵阳6 2 10 0 0）【摘要】目的构建高血压脑出血患者脑组织差异表达miRNA,并进行生物信息学分析。方法选取行高血压脑出血手术患者脑血肿腔壁脑组织标本16 例,同期选择重型颅脑损伤且具有高血压病史患者脑组织标本16 例作为对照组。通过Trizol法提取标本总RNA，筛选出差异表达的miRNA。利用生物信息学技术分析差异表达miRNA的特点，通过String数据库得到靶基因蛋白互作分析结果,Cytoscape软件进行miRNA-mRNA核心调控网络可视化。结果实验组与对照组相比较共筛选出差异表达miRNA43个（P0.05），其中上调miRNA共7 个，下调miRNA共36 个。对差异miRNA的靶基因进行KEGG/GO富集分析，得到与高血压脑出血相关的信号通路：cAMP信号通路、ErbB信号通路、Calcium信号通路、Wnt信号通路（P0.05）。构建miRNA-mRNA可视化网络图，发现关联度最高的miRNA为：hsa-miR-1303、h s a-miR-1972、h s a-mi R-36 2-3p、h s a-mi R-10 1-3p、h s a-mi R-37 8 d,PPI蛋白互作分析发现连接度最高的前三个基因为：MAPK1、GRB2和RAC1。结论差异miRNA可能在自发性高血压脑出血的发病机制中具有重要作用,可能为自发性高血压脑出血的治疗及预防提供潜在治疗靶点及方向。【关键词】miRNA;高血压脑出血;脑组织;调控网络【中图分类号】R743.34MicroRNA Expression Profile and Bioinformatics Analysis in Hypertensive Cerebral Hemorrhage Patients.Xu Chen-glang,Xiao Wenfeng,Lu Junling,et al.1.Department of Neurosurgery,the Afliated Hospital of Southwest Medical UniversityLuzhou,Sichuan 646000;2.Department of Neurosurgery,Sichuan Mianyang 404 Hospital,Mianyang,Sichuan 621000,China.Abstract】O b j e c t i v e T o c o n s t r u c t mi c r o RNA d i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e d i n h y p e r t e n s i v e i n t r a c e r e b r a l h e mo r r h a g e p a t i e n t sand analyze it bioinformatically.Methods 16 patients with hypertensive intracerebral hemorrhage were selected,and 16 patientswith severe craniocerebral injury and hypertensive history were selected as control group.Total RNA was extracted by Trizol method【文献标志码】A【文章编号】10 0 4-0 50 1(2 0 2 3)0 9-0 9 0 5-0 6【基金项目】四川省科技计划项目（编号：2 0 17 JY0035）通信作者,E-mail:14 Abdelhamid MH,Zayed AS,Ghoneima WE,et al.Randomized,double-blind,placebo-controlled trial to compare solifenacin versus trospiumchloride in the relief of double-J stent-related symptoms J.World JUrol,2017,35(8):1261-1268.15 Okane M,Robinson D,Cardozo 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daily mira-begron 50 mg in male patients with overactive bladder:a critical analy-sis of five phase III studiesJ.Ther Adv Urol,2017,9(6):137-154.（收稿时间：2 0 2 3-0 2-15）906and differential expression miRNAs were screened.Cytoscape sofware was used to visualize the miRNA-mRNA core regulatory net-work.The characteristics of differentially expressed mirnas were analyzed by bioinformatics technology.The results of target gene pro-tein interaction analysis were obtained by String database.Results Total of 43 differentially expressed miRNAs were detected be-tween experimental group and control group(P0.05),including 7 up-regulated miRNAs and 36 down-regulated miRNAs.KEGG/GO enrichment analysis was performed on the target genes of differential miRNA,and the signaling pathways associated with hyperten-sive intracerebral hemorrhage were obtained:cAMP signaling pathway,ErbB signaling pathway,Calcium signaling pathway,Wnt signa-ling pathway(P1,P0.05的已知miRNA并分析。1.3差异miRNA生物信息学分析及miRNA-mRNA调控网络构建：对筛选的差异 miRNA通过Tar-getscan0 miRBD7 两种在线分析工具进行基因预测，对预测到的相关靶基因进行KEGG和GO分析,研究其在生物学中的作用。为了解miRNA与mRNA 相互作用,导出miRDB数据库预测的14种已知miRNA的靶基因,筛选得分大于8 0 分的靶基因利用Cytoscape四川医学2 0 2 3年9 月第44卷（第9 期）SichuanMedical Journal,2023，Vo l.44,No.9软件绘制miRNA-mRNA可视化调控图，同时使用String数据库构建靶基因PPI蛋白蛋白互作分析图并筛选出核心模块。1.4乡统计学方法：采用SPSS20.0软件进行统计学分析。计量资料使用Shapiro-Wilk方法进行正态性检验，KEGG和GO分析采用超几何检验。以P1并调整P0.05,得到差异的miRNA共43个,其中有7 个差异的miRNA呈下调,36 个差异的miRNA呈上调，见表1。对检测到的43个差异miRNA进行分析,其中已知miR-NA14个，新发现miRNA29个,差异表达miRNA火山图见图1。14个已知的miRNA中8 个miRNA呈上调,6 个miRNA呈下调。新发现的miRNA的碱基序列见表2。表1HICH脑组织差异 miRNA表达谱差异miRNA差异倍数hsa-miR-101-3p1.632454971hsa-miR-121361.738826935hsa-miR-13032.258245173hsa-miR-148b-5-1.25585966hsa-miR-19725.216353635hsa-miR-19733.373171258hsa-miR-21-3p5.132390433hsa-miR-2681-5-2.810468206hsa-miR-362-3p2.997894492hsa-miR-378d-5.367470288hsa-miR-42541.264562658hsa-miR-43064.657946121hsa-miR-4485-34.799182564hsa-miR-584-3p2.832408048novelmiRNA-10353.87958522novelmiRNA-232.387262474novelmiRNA-2803.825617451novelmiRNA-3092.190719069novelmiRNA-3283.659153969novelmiRNA-343.651567423 907:差异miRNA差异倍数novelmiRNA-704.645395843novelmiRNA-3825.057114701novelmiRNA-4145.164572136novelmiRNA-4481.457612158novelmiRNA-4593.737017976novelmiRNA-4702.457948161novelmiRNA-5202.092658515novelmiRNA-5382.707426119novelmiRNA-6242.454976431novelmiRNA-6384.086716059novelmiRNA-6471.907740181novelmiRNA-6742.977006324novelmiRNA-7053.451976461novelmiRNA-7513.785788986novelmiRNA-7633.723462114novelmiRNA-7904.112859634novelmiRNA-8013.604795442novelmiRNA-8233.967404848P调节类型0.020764639下调0.031131275上调0.042787871上调0.037123601下调0.005720316上调0.031073988上调0.028407719下调0.022568235下调0.049627569下调0.021663下调0.04937814上调0.002610279上调4.35E-08上调0.033271854上调0.014271226上调0.043019337上调上调0.0258737970.0363762460.0368313610.046551694P0.0063066140.0001447250.0222254260.0222391610.0312421320.0446969480.0158222170.0148915160.0489063120.0003845340.0368600890.0109617220.0119619840.0180980980.0174136210.0006499310.0447634090.032700095novelmiRNA-8403.94688996novelmiRNA-9513.485432809novelmiRNA-9572.745450796novelmiRNA-953.476543773novelmiRNA-9894.783630922注：novel表示新发现的miRNAHcb-vs-Hb:P1FilteredUp6Down4-2-0-6-4-2FOlog,Fold Change注：图中每个点代表一个miRNA，横坐标为log2Fold Change值，纵坐标为显著性取对数后的P值。横坐标左侧标记表示上调的miRNA，上调右侧标记表示下调的miRNA。图中Hcb表示高血压脑出血组,Hb表示上调高血压颅脑创伤组上调图1火山图显示miRNA的显著性差异表达调节类型上调上调上调上调上调上调上调上调上调上调上调上调下调上调上调上调上调上调0.024598099上调0.002565804上调0.002565804上调0.039831441上调0.004876952上调24 908miRNA_idnovelmiRNA-1035novelmiRNA-23novelmiRNA-280novelmiRNA-309novelmiRNA-328novelmiRNA-34novelmiRNA-70novelmiRNA-382novelmiRNA-414novelmiRNA448novelmiRNA-459novelmiRNA-470novelmiRNA-520novelmiRNA-538novelmiRNA-624novelmiRNA-638novelmiRNA-647novelmiRNA-674novelmiRNA-705novelmiRNA-751novelmiRNA-763novelmiRNA-790novelmiRNA-801novelmiRNA-823novelmiRNA-840novelmiRNA-951novelmiRNA-957novelmiRNA-959novelmiRNA-9892.2革靶基因预测结果：选择上述43个有统计学意义的差异表达miRNA进行研究,采用 Targetscan、m i RD B两种生物学信息在线数据库同时对高通量测序筛选出的差异表达miRNA进行分析，寻找差异表达miRNA可能相关联的基因,对43个差异miRNA预测结果显示，得到8 447 个相关联的下游靶基因。2.3差异miRNA靶基因的GO功能和KECG结果分析：通过KECG和GO数据库功能分析方法对这些差异表达miRNA的功能进行分析，得到差异表达的43个miRNA靶基因全部功能结果，见图2 和图3。图中四川医学2 0 2 3年9 月第44卷（第9 期）SichuanMedical Journal,2023,Vol.44,No.9表2 新发现的miRNA碱基序列按富集程度列出最靠前的30 个分类项，多数差异性表碱基序列(5-3)达miRNA 的交集靶基因的GO功能分析显示：其作用GAGGGCGGCGGCGGCGGT的功能在生物过程中主要作用于细胞过程、生物过程TGGGCTTACGTTGGGAGAACC的调节、细胞的发育、生物进化管理。对于细胞组成来TTGGAAGAGGATGCTGAGA说主要富集于细胞部分和细胞。对于分子功能来说主CTCTCTCTCTCCCCCGCTCCCCA要富集在催化活性和结合。通过KECG富集分析结果CTCTCTCTCTCCCCCGCTCCCCA显示,这些差异表达的miRNA主要在器官和系统中参GTGGGAGCGGGCGGGCGGC与了肿瘤疾病、免疫系统和内分泌系统的信号传导通CAGCCTACACCCTAGACC路,筛选出差异miRNA 作用的信号通路得到可能与CAGGCTACACCCTAGACCHICH相关信号通路为：cAMP信号通路、ErbB信号通GAGGTCTGTGGAAGAGAG路、Calcium信号通路、Wnt信号通路（P0.05）。AAAGGCGACCACCTCGTGAACGACGCGCGCGCCGCTCGCCCTCTCTCCGTCTCCATCCCCAGCGGGGGTGTGGCTCAGTGGCCGTGGACTGTGTGAGGCAGCGGCGGCCGCCGCGGGGTTCTGGAAAGGCGGCCGCCGTGGATATGATGACTGACTACTGACGAGGTGGCAGAGTGGCGTAGGTGGCCTGACTGGCGTGGAGGACTGAGAAGGTGAGGCCGCCGCCCCTCCTCCTCCCGTCTCTGTGGCGCAATCGGGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGGCTTAGCCTAGCCACACCAGAGGGCGTGAAACCGTTAAGAGGTGCTGCAGTGCTCTGAGCCCCTGTTCTTGGGTGGGTGTGGGTGTGGTTCATGCTGAAGGCGATGCAGATCTTGGTGGTAGC生物过程注：纵坐标为miRNA靶基因所富集于相关功能的数目（及百分比），横坐标为各项功能名称图2 miRNA靶基因的CO分类图Hcb-vs-Hb(Total):KEGGEnrichmenttop20hsa05202:-Transcriptional misregulation in cancehsa05031:AmphetamineaddicshsaD4934:Cushing syndromhsaD4925;Aldosterone synthesls and secretohasao4921:Oxytocin sinalig pathwnayhsa04916:Melanogeneshsa0412-GnRH sigaling pathwahsa04911:Insulin socrehsa04728;Dopaminergiesynapshsa04725:Cholinergicsynapshsa04720:Long-termpolentahhana4719:Circadian entrimerhsa04360:Axon.guidanchsa04340:Hedgehog signaling pathwhsa04310:Wntsigaling pathhsa04261:Adrenenergic signaing in cardiomyoeytehsa04024:cAMP signaling patmaytsad4020:Calcumsignaling pathnahsa04012:EroBsignalig pathwayhsa03015:mRNA survelance pathwa:注：横坐标表示富集分数，纵坐标表示信号通路条目名称，圆圈大小表示某信号通路中富集的差异基因数目，颜色表示富集显著性P值图3miRNA靶基因的KEGG富集分析气泡图2.4靶基因miRNA-mRNA网络图及PPI蛋白互作分析：通过筛选共得到9 57 个潜在的靶基因，利用cyto-scape软件构建miRNA-mRNA可视化网络图，见图4。其中关联最高的miRNA为：hsa-miR-1303、h s a-m i R-1972、h s a-mi R-36 2-3p、h s a-mi R-10 1-3p、h s a-mi R-37 8 d。细胞组分分子功能1.41.5EnrichmentScoreNumber20030000500600700pValue6.0400290194.530022e-193.0200140-191.5100070197.991629e-17和RAC1。他们可能在脑实质中调控自发性HICH的四川医学2 0 2 3年9 月第44卷（第9 期）SichuanMedical Journal,2023，V o l.44,No.9表明这些miRNA在HICH 患者的脑组织中的表达及靶基因调控中处于关键位置。再利用STRING（h t t p s:/string-db)数据库构建蛋白蛋白互作网络,通过 cyto-scape软件进行可视化，绘制关键节点，按照连接度进行分级,每个点代表一个靶基因,圆形越大,说明该基因在网络图中连接度越高，因此我们发现连接度最高的前三个基因包括：MAPK1、G RB2 和RAC1,这些靶基因与上游差异miRNA结合可能影响自发性HICH的发生发展。图4利用cytoscape寻找到的关键miRNA-mRNA调控网络EZH2DNMT3ARXRAARID1AACTL6ASMARCA4FOS图5miRNA靶基因编码蛋白质互作网络分析图3讨 论miRNA是一类18 2 5个核苷酸的内源性非编码RNA,具有转录后调节功能。研究表明,它们参与细胞发育、细胞调亡、脂肪代谢等生理和病理过程,并与肿瘤发生发展和病毒感染有关。据报道,miRNA与其靶909.基因的3 UTR区结合,从而降低了靶mRNA的稳定性或下调了相关蛋白的表达来发挥生物学功能 8-9 。异常的miRNA可能会影响大脑血管及脑组织的基因表达,从而增加脑出血的风险,并影响脑损伤的过程。脑出血后,会引发血管壁通透性的变化,从而增加血管源性和细胞源性脑水肿及脑出血后继发脑损伤的风险，因此,寻找有效的临床指标来反映 HICH 患者病情的严重程度及治疗和预后具有重要意义 10 本研究从miRNA的变化可能导致HICH的发生与发展的角度出发,利用HICH手术患者脑血肿腔壁旁少量脑组织,对照组选择重型颅脑损伤且具有高血压病史患者脑组织标本,来进行二代测序,发现了异常表达的miRNA。筛选出两组数据中差异度较大的miR-NA共43个,其中14个miRNA是已知的,2 9 个miRNA是新发现的，为使得此筛选方法可行性和可信度较高，通过联合Targetscan、m i RD B两个数据库对miRNA靶基因进行预测,对预测的相关靶基因做出了初步的生物信息学分析。通过分析miRNA作用的信号通路得到可能与HICH相关信号通路为：cAMP信号通路、ErbB信号通路、Calcium信号通路、Wnt信号通路（P0.05）。联合不同算法及标准，确定了miRNA对应的靶基因之间的核心调控网络关系,其中6 个miRNA处PSEN1于调控网络中的关键部位，通过绘制PPI蛋白互作分析图得到接度最高的前三个基因包括：MAPK1、C RB2CDK1DAG1GSK3BGRB2MAXSMARCD1NR3C1RUNX2FOXO3PMLEIF4EEIF4G1RAC1MAPK1FRS2GAB1YWHAZNTRK2NRASRAPIBMTORTGFBR1TAB2相关生物学功能中具有重要作用，值得进一步深入研究。RALAmiRNA在脑组织损伤中参与了多种生理过程。有研究报道miRNA与脑出血的信号通路机制相关,Xiao等 在大鼠模型当中发现miR-145-5p可以通过抑制MMP2介导的Wnt/-catenin信号通路来保护HICH后脑损伤,从而减轻脑水肿,减少细胞调亡。Qu等 12 的研究进一步分析表明,miR-146a过表达抑制了大鼠脑组织的TRAF6/NF-kB信号通路并减少神经元的凋亡、减少促炎症细胞因子的产生。有研究报道,miR-126 的下调在HICH组织和细胞中促进了 HBMECs的调亡,并表现出抗凋亡的作用 13。miRNA 在组织中存在特异性，目前国内外对动物脑组织损伤与miRNA关系研究较多，但在人脑组织中的研究文献报道较少,本研究分析了HICH患者脑损伤组织中差异表达的miRNA，910寻找到了miRNA-mRNA核心调控网络中处于关键调节点的6 种miRNA。在类似实验中，Andrew等 14 研究表明,急性脑卒中的过程中 miRNA也有重要作用。miRNA NGS分析检测到34个miRNA在急性脑卒中组织中的表达与对照组明显异常，通过分析和生物信息学方法表明,所确定的miRNAs与卒中相关的生物过程有很强的联系，与脑卒中相关的生物过程和信号通路有密切关系。刘峻伶等 15 研究发现，miRNA在HICH患者脑血管组织细胞中具有重要作用,并且KEGG富集分析结果显示差异miRNA在MAPK信号通路作用中具有很强的相关性。本研究我们初步分析同时得到了HICH人脑组织中作用相关性较大的差异靶基因：MAPK1、G RB2 和RAC1。M A PK 1蛋白作为MAPK信号通路中作用的重要因子,其在细胞增值、发育过程发挥重要作用，李旭等 16 研究发现miRNA-466c-3p通过靶向MAPK1在大鼠脊髓损伤功能恢复过程中具有重要作用。多项研究证实 GRB2相关蛋白是一种衔接蛋白，在细胞增殖、分化、调亡及迁移等生理过程中发挥重要作用，但其在脑组织损伤的作用机制鲜有报道，值得我们进一步研究。综上所述，本研究通过二代高通量测序方法分析了 HICH脑组织中 miRNA 差异表达,对差异表达 miR-NA进行了生物信息学分析,并构建出核心调控网络，可能为HICH脑损伤提供新的治疗途径和潜在治疗靶点,并为更好地理解该疾病的理论基础提供了理论依据。本研究局限在于所取样本量较少，可能导致筛选出的差异miRNA存在偏差,生物信息学分析结果及构建的调控网络需要大量同类数据进行补充验证及后续进一步实验研究。我们将在后续的实验中继续挖掘，更全面的揭示miRNA在高血压脑出血中的作用机制。参考文献：1 Li CX,Li L,Zhang JF,et al.Tripartite intensive intervention for pre-vention ofrebleeding in elderly patients with hypertensive cerebral hem-orrhageJ.World J Clin Cases,2021,9(33):10106-10115.2中华医学会神经病学分会，中华医学会神经病学分会脑血管病学组.中国脑出血诊治指南（2 0 19）J.中华神经科杂志,2 0 19,52(12):994-1005.四川医学2 0 2 3年9 月第44卷（第9 期）SichuanMedical Journal,2023,Vol.44,No.93 Jose LRS,Erwin C,Gustavo PR,et al.Hypertensive thalamic hemor-rhage:analysis of short-term outcome J.Int 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