高糖诱导小鼠脑缺血后出血转化的研究.pdf

基础研究高糖诱导小鼠脑缺血后出血转化的研究李友维,张涵,王思昊,刘宇婧,吴园,桂玉然,周梅,柳威摘要:目的 探讨稳定的高糖诱导小鼠脑缺血后出血转化模型的实验条件。方法 采用线栓法制备小鼠大脑中动脉闭塞模型,将小鼠按照葡萄糖浓度(1 0%,2 0%,3 0%,4 0%,5 0%)与缺血时间(3 0m i n,1、2、3h)进行组合,每个浓度4个时间点,共分为2 0组合,每组6只。术前1 5m i n腹腔注射不同浓度葡萄糖,分别在脑缺血术后3 0m i n,1、2、3h拔出线栓恢复再灌注,诱导小鼠脑缺血后出血转化模型。以术后2 4h内死亡率以及术后7d内脑出血大体观察,脑皮质和白质出血量,出血发生率及死亡率为指标。结果 大体观察显示,随着缺血时间延长或葡萄糖浓度升高,脑组织出血发生率呈逐渐上升趋势。苏木精-伊红染色镜下观察显示,大部分模型组合小鼠随着缺血时间延长或葡萄糖浓度升高,大脑白质及皮质内出血量呈逐渐上升趋势。术后7d内,葡萄糖浓度升高或缺血时间延长均增加模型小鼠出血发生率,差异有统计学意义(F=1 5.2 8 2,F=6.6 3 2,P0.0 1)。术后2 4h和术后7d内,葡萄糖浓度升高或缺血时间延长均显著增加模型小鼠死亡率,差异有统计学意义(P0.0 5,P0.0 1)。结论 当葡萄糖浓度为3 0%,缺血时间为3 0m i n时,高糖诱导可制备死亡率低,出血转化发生率高的脑梗死后出血转化模型。关键词:脑缺血;模型,动物;脑出血;葡萄糖浓度H i g hg l u c o s e-i n d u c e dh e m o r r h a g i c t r a n s f o r m a t i o n i nm i c ea f t e r c e r e b r a l i s c h e m i aL iY o u w e i,Z h a n gH a n,W a n gS i h a o,L i uY u j i n g,WuY u a n,G u iY u r a n,Z h o uM e i,L i uW e i(S c h o o l o fM e d i c i n e,J i a n g h a nU n i v e r s i t y,W u h a n4 3 0 0 5 6,H u b e iP r o v i n c e,C h i n a)A b s t r a c t:O b j e c t i v e T oe x p l o r et h es t a b l ee x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n so fh i g hg l u c o s e-i n d u c e dh e m-o r r h a g e t r a n s f o r m a t i o nm o d e l i nm i c e a f t e r c e r e b r a l i s c h e m i a.M e t h o d s T h em o u s em o d e l o fm i d-d l ec e r e b r a l a r t e r yo c c l u s i o nw a se s t a b l i s h e db yt h r e a do c c l u s i o n.D i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fg l u-c o s e(1 0%,2 0%,3 0%,4 0%,5 0%)w e r e i n j e c t e d i n t r a p e r i t o n e a l l y1 5m i nb e f o r e c e r e b r a l i s c h e m i-a.I n3 0 m i na n d1,2a n d3ha f t e rc e r e b r a l i s c h e m i a,t h es u t u r ew a sr e m o v e dt or e s t o r eb l o o dr e p e r f u s i o nt o i n d u c et h em o d e lo fh e m o r r h a g et r a n s f o r m a t i o n.T h u s,t h em i c ew e r ed i v i d e di n t o2 0g r o u p sw i t h6m i c e e a c hg r o u p.D e a t hw i t h i n2 4ha f t e r o p e r a t i o n,g r o s s v i e wo f c e r e b r a l h e m o r-r h a g e7da f t e ro p e r a t i o n,a m o u n to fh e m o r r h a g e i nc e r e b r a l c o r t e xa n dw h i t em a t t e r,i n c i d e n c eo fh e m o r r h a g ea n dm o r t a l i t yw e r eu s e d t oe v a l u a t e.R e s u l t s G r o s so b s e r v a t i o ns h o w e d t h a t t h e i n c i-d e n c eo f c e r e b r a l h e m o r r h a g ew a s i n c r e a s e dg r a d u a l l yw i t h t h ed u r a t i o no f i s c h e m i a t i m eo r i n c r e-m e n to fg l u c o s ec o n c e n t r a t i o n.HEs t a i n i n gd i s p l a y e dt h a tt h eh e m o r r h a g ea m o u n t i nt h ew h i t em a t t e ra n dc o r t e xw a se l e v a t e dw i t ht h ep r o l o n g a t i o no f i s c h e m i at i m eo r t h e i n c r e a s eo fg l u c o s ec o n c e n t r a t i o n i nm o s tm o d e lm i c e.W i t h i n7da f t e ro p e r a t i o n,i n c r e a s eo fg l u c o s ec o n c e n t r a t i o no rp r o l o n g a t i o no f i s c h e m i a t i m e i n c r e a s e dt h e i n c i d e n c eo fh e m o r r h a g e i nm o d e lm i c e(F=1 5.2 8 2,F=6.6 3 2,P0.0 1).E l e v a t e dg l u c o s el e v e la n dp r o l o n g e di s c h e m i cd u r a t i o ns i g n i f i c a n t l yr a i s e dt h em o r t a l i t yr a t e s i n2 4ha n d7dp o s t-o p e r a t i v e l y(P0.0 5,P0.0 1).C o n c l u s i o n M o u s em o d-e lo fh e m o r r h a g et r a n s f o r m a t i o nc a nb ei n d u c e d w i t h3 0%g l u c o s ec o n c e n t r a t i o na n d3 0 m i ni s c h e m i cd u r a t i o n,f o rh i g h e r i n c i d e n c eo f t r a n s f o r m a t i o na n d l o w m o r t a l i t y.K e yw o r d s:b r a i n i s c h e m i a;m o d e l s,a n i m a l;c e r e b r a lh e m o r r h a g e;c o n c e n t r a t i o n so fg l u c o s eD O I:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 0 0 9-0 1 2 6.2 0 2 3.0 8.0 1 9基金项目:湖北省自然科学基金(2 0 2 2 C F C 0 5 7)作者单位:4 3 0 0 5 6武汉,江汉大学医学部(李友维,张涵,王思昊,刘宇婧,吴园);江汉大学脑血管病研究所(桂玉然,周梅,柳威)通信作者:柳威,E m a i l:l i u w e i j h u n.e d u.c n268中华老年心脑血管病杂志2 0 2 3年8月 第2 5卷 第8期 C h i nJG e r i a t rH e a r tB r a i nV e s s e lD i s,A u g2 0 2 3,V o l 2 5,N o.8 脑卒中是我国居民的第一位死因,其中缺血性脑卒中占8 0%,具有发病率、致残率、病死率、复发率高的特点1。虽然溶栓或介入治疗能有效减轻脑梗死患者缺血缺氧性损伤,但再灌注后血管破坏会进一步加重损伤。再灌注后出血转化严重影响溶栓、介入治疗的有效性评估2。目前,脑梗死后出血转化的研究较少,究其原因,主要与动物模型制作难度高、早期死亡率高、远期存活率低有关。有研究采用线栓法制备大鼠出血转化模型时,随着缺血时间延长,缺血组织出血量评分及血红蛋白含量呈逐渐上升趋势3。高血糖是诱发脑梗死后出血转化的重要因素4-5。除此之外,大面积脑梗死、高血压、低血脂、侧支循环不良等因素均可能增加出血转化发生率6。本研究前期发现,术前腹腔注射3 0%葡萄糖后,再灌注期间高血糖能有效诱发脑梗死后出血转化。本研究在线栓法小鼠脑梗死模型基础上,探讨缺血时间、血糖浓度、出血转化率和动物死亡率的关联,以期筛选出制作脑梗死后出血转化模型的最佳条件,为相关研究提供实验基础。1 材料与方法1.1 实验动物 选择雄性S P F级C 5 7 B L/6 J小鼠1 2 0只,5 66 2日龄,体质量2 22 6g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司S C X K(京)2 0 2 1-0 0 0 6,每笼不超过5只,室温2 0 2 6,湿度4 0%7 0%,光照以1 2h/1 2h昼夜明暗交替,自由摄入饲料及饮用水,适应性喂养7d。1.2 小鼠大脑中动脉闭塞模型制备 采用异氟烷(深圳瑞沃德有限公司)吸入麻醉后,术中1.5%异氟烷维持麻醉,小鼠仰卧位固定,沿颈部中线切开皮肤,暴露并游离左侧颈总动脉(C C A)、依次分离颈外动脉(E C A)、颈内动脉(I C A)。游离并离断E C A后,临时阻断C C A和I C A,从E C A距C C A分叉5mm处插入大脑中动脉闭塞单丝尼龙线(深圳瑞沃德有限公司),再经过C C A进入大脑中动脉,插入深度距C C A分叉(9.50.5)mm,感受到阻力后停止。插线前1 5m i n腹腔注射不同浓度葡萄糖溶液,不同缺血时间后,轻轻拔出尼龙线恢复血液灌注,并缝合手术切口。术中体温维持在(3 70.5)。实验过程中尽量规范手术操作,减轻动物痛苦。将小鼠按照葡萄糖浓度(1 0%,2 0%,3 0%,4 0%,5 0%)与缺血时间(3 0m i n,1、2、3h)进行组合,每个浓度4个时间点,共分为2 0组合,每组6只,满足研究要求共1 1 3只。1 0%和5 0%葡萄糖溶液按照比例配成不同浓度葡萄糖溶液,小鼠在大脑中动脉闭塞术前1 5m i n腹腔注射不同浓度的葡萄糖溶液。1.3 组织病理学检测 所有小鼠在濒死时或造模成功7d,采用异氟烷深度麻醉后处死,4%多聚甲醛灌流后取出脑组织,去除嗅球,往后37mm处冠状切片。肉眼观察脑组织表面和切片出血转化情况,经固定后采用梯度乙醇脱水,石蜡包埋切片,进行苏木精-伊红染色,镜下观察确认出血转化。小鼠全部取材完成后,统计造模成功小鼠数量,造模成功后小鼠死亡数量,通过脑组织横剖面观察并统计小鼠脑组织发生出血量以及严重程度。出血发生率(%)=每组小鼠脑组织发生出血量/每组小鼠造模成功数量1 0 0%;死亡率(%)=每组造模成功后小鼠死亡数量/造模成功后小鼠总数量1 0 0%。1.4 统计学方法 采用S P S S2 7.0软件,计量资料以xs表示,用独立样本t检验,计数资料以百分率表示,用2检验,P0.0 5为差异有统计学意义。2 结 果2.1 不同组合小鼠脑组织出血程度 小鼠处死取材后对脑组织出血情况进行大体观察,除1 0%葡萄糖+3 0m i n缺血时间外,其余模型组合均发生不同程度出血转化,且随着缺血时间延长或葡萄糖浓度升高,脑组织出血程度呈逐渐上升趋势(图1)。图1 不同组合小鼠脑组织大体观察出血程度2.2 不同模型组合小鼠脑组织病理学检测 苏木精-伊红染色镜下观察显示,除1 0%葡萄糖+3 0m i n缺血时间、1 0%葡萄糖+1h缺血时间、2 0%葡萄糖+3 0m i n缺血时间外,其余模型组合小鼠均有大脑皮质内出血,且随着缺血时间延长或葡萄糖浓度升高,脑皮质内出血量呈逐渐上升趋势(图2);除1 0%葡萄糖+3 0m i n缺血时间外,其余模型组合小鼠均有大脑白质内出血,且随着缺血时间延长或葡萄糖浓度升高,脑白质内出血量呈逐渐上升趋势(图3)。2.3 不同模型组合小鼠出血发生率比较 术后7d内,1 0%葡萄糖+3 0m i n缺血时间小鼠出血发生率为0,其余模型组合小鼠均有不同数量发生出血转化(表1)。368中华老年心脑血管病杂志2 0 2 3年8月 第2 5卷 第8期 C h i nJG e r i a t rH e a r tB r a i nV e s s e lD i s,A u g2 0 2 3,V o l 2 5,N o.8 图2 不同模型组合小鼠大脑皮质内出血情况(深红色为出血部位,细胞核为蓝色深染,细胞质为粉红色淡染)苏木精-伊红染色 4 0 图3 不同模型组合小鼠大脑白质内出血情况(深红色为出血部位,细胞核为蓝色深染,细胞质为粉红色淡染)苏木精-伊红染色 4 0表1 不同组合小鼠出血和死亡 例数(%)葡萄糖浓度 只数出血转化2 4h死亡7d死亡1 0%葡萄糖 3 0m i n6000 1h51(2 0)1(2 0)4(8 0)2h64(6 7)1(1 7)5(8 3)3h65(8 3)1(1 7)4(6 7)2 0%葡萄糖 3 0m i n63(5 0)01(1 7)1h53(6 0)3(6 0)3(6 0)2h65(8 3)05(8 3)3h66(1 0 0)3(5 0)5(8 3)3 0%葡萄糖 3 0m i n65(8 3)01(1 7)1h54(8 0)3(6 0)3(6 0)2h66(1 0 0)3(5 0)5(8 3)3h55(1 0 0)4(8 0)5(1 0 0)4 0%葡萄糖 3 0m i n55(1 0 0)3(6 0)5(1 0 0)1h66(1 0 0)3(5 0)4(6 7)2h55(1 0 0)5(1 0 0)5(1 0 0)3h66(1 0 0)2(3 3)6(1 0 0)5 0%葡萄糖 3 0m i n66(1 0 0)4(6 7)6(1 0 0)1h55(1 0 0)5(1 0 0)5(1 0 0)2h66(1 0 0)5(8 3)6(1 0 0)3h66(1 0 0)6(1 0 0)6(1 0 0)葡萄糖浓度升高或缺血时间延长均增加模型小鼠出血发生率,差异有统计学意义(P0.0 1);葡萄糖浓度 与 缺 血 时 间 的 交 互 效 应 显 著(P0.0 5,表2)。表2 出血发生率的双因素方差分析项目 均方F值P值葡萄糖浓度1.3 3 71 5.2 8 20.0 0 1缺血时间0.5 8 06.6 3 20.0 0 1葡萄糖浓度与缺血时间0.1 6 41.8 7 00.0 4 82.4 不同模型组合小鼠死亡率比较 术后2 4h内,葡萄糖浓度升高或缺血时间延长均增加模型小鼠死亡率,差异有统计学意义(P0.0 5,P0.0 1,表3)。术后7d内,葡萄糖浓度升高或缺血时间延长均增加模型小鼠死亡率,差异有统计学意义(P0.0 1);缺血再灌注2 4h或7d内,葡萄糖浓度与缺血时间的交互效应显著(P0.0 5,表4)。表3 2 4h内死亡率的双因素方差分析项目 均方F值P值葡萄糖浓度1.9 0 71 1.9 2 70.0 0 1缺血时间0.6 4 24.0 1 80.0 1 0葡萄糖浓度与缺血时间0.3 0 31.8 9 50.0 4 5表4 7d内死亡率的双因素方差分析项目 均方F值P值葡萄糖浓度0.8 5 37.2 9 90.0 0 1缺血时间1.2 0 71 0.3 3 00.0 0 1葡萄糖浓度与缺血时间0.2 7 92.3 9 10.0 1 03 讨 论出血转化是脑梗死后常见并发症,出血转化显著增加脑梗死患者不良预后率和死亡率,严重影响468中华老年心脑血管病杂志2 0 2 3年8月 第2 5卷 第8期 C h i nJG e r i a t rH e a r tB r a i nV e s s e lD i s,A u g2 0 2 3,V o l 2 5,N o.8溶栓、介入治疗的有效性。然而,目前有关脑梗死后出血转化的研究较少,主要与动物模型稳定性差、活体评估难度大、早期死亡率高等因素有关,明确脑梗死后出血转化动物模型的构建方法,有利于推动脑梗死后出血转化研究的开展。大面积脑梗死、长时间缺血、高血糖、低密度脂蛋白胆固醇、侧支循环不良等因素是脑梗死后出血转化的常见原因7-8。研究证实,当大鼠脑缺血时间由1.5h增加到2.5h或3.5h时,出血转化率由2 5%增加到5 0%或7 5%。L u等研究证实,在大脑中动脉闭塞的S D大鼠中,缺血时间为5h,梗死面积为(2 5 8.74 1.7)mm3,出血转化率为8 1.8%,2 4h内死亡率为5 4.5%。采用以上方式构建脑梗死后出血转化模型,存在死亡率高、构建周期长、出血转化率不稳定等不足,脑梗死后出血转化的理想动物模型还有待进一步探索。研究表明,高血糖可显著加重大鼠大脑中动脉闭塞模型的出血转化9-1 0。线栓法是构建脑梗死动物模型的经典方法,能有效模拟脑梗死再灌注的治疗过程,结合使用一过性高血糖制作脑梗死后出血转化的发生过程,较好模拟了临床场景。通过模拟血栓自溶等过程造成缺血再灌注损伤诱导出血转化。本实验通过大体观察模型小鼠脑组织出血转化情况,并采用组织病理学方法进一步验证发现,缺血前1 5m i n注射1 0%5 0%葡萄糖后,血糖浓度越高,再灌注后出血转化率越高,动物死亡率也越高。研究证实,脑梗死后出血转化会显著增加动物死亡率,不利于进一步研究出血转化后的中远期效应。本研究在明确出血转化发生率基础上,探讨降低死亡率的实验条件。有研究发现,当葡萄糖浓度4 0%或缺血时间1h时,模型小鼠死亡率均明显升高。当葡萄糖浓度为3 0%,缺血时间为3 0m i n时,模型小鼠出血发生率较为稳定,死亡率较低。C o u r e t等1 1研究发现,注射3 0%葡萄糖的模型小鼠,血糖浓度维持在2 5 03 9 0m g/d l至少1h,与3 0m i n缺血时间组比较,1.5h和3h组的不良预后及死亡率明显加重,与本研究结果一致,在其基础上进一步明确出血转化模型的更优构建方法,为探讨出血转化机制和干预药物筛选提供理论依据。本研究发现,当葡萄糖浓度为3 0%,缺血时间为3 0m i n时,高糖诱导可制备死亡率低,出血转化发生率高的脑梗死后出血转化模型,为进一步研究出血转化发生机制提供良好的模型。利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突参考文献1 G B D2 0 1 9S t r o k eC o l l a b o r a t o r s.G l o b a l,r e g i o n a l,a n dn a t i o n a lb u r d e no f s t r o k e a n d i t s r i s k f a c t o r s,1 9 9 02 0 1 9:as y s t e m a t-i ca n a l y s i s f o r t h eG l o b a lB u r d e no fD i s e a s eS t u d y2 0 1 9J.L a n c e tN e u r o l,2 0 2 1,2 0(1 0):7 9 5-8 2 0.D O I:1 0.1 0 1 6/S 1 4 7 4-4 4 2 2(2 1)0 0 2 5 2-0.2 L i uN,L i uC,Y a n gY,e ta l.X i a o-X u-M i n gd e c o c t i o np r e v e n-t e dh e m o r r h a g i c t r a n s f o r m a t i o n i n d u c e db ya c u t eh y p e r g l y c e-m i a t h r o u g h i n h i b i t i n gA G E-R A G E-m e d i a t e dn e u r o i n f l a mm a-t i o nJ.P h a r m a c o lR e s,2 0 2 1,1 6 9:1 0 5 6 5 0.D O I:1 0.1 0 1 6/j.p h r s.2 0 2 1.1 0 5 6 5 0.3 宁珑,孙航,周艳凯,等.线栓法复制大鼠脑缺血后出血转化模型的研究J.神经损伤与功能重建,2 0 2 2,1 7(8):4 3 5-4 3 8.D O I:1 0.1 6 7 8 0/j.c n k i.s j s s g n c j.2 0 2 1 0 4 2 2.4 Y u a nC,C h e nS,R u a nY,e t a l.T h e s t r e s sh y p e r g l y c e m i a r a t i oi sa s s o c i a t e d w i t h h e m o r r h a g i ct r a n s f o r m a t i o ni n p a t i e n t sw i t ha c u t ei s c h e m i cs t r o k eJ.C l i nI n t e r vA g i n g,2 0 2 1,1 6:4 3 1-4 4 2.D O I:1 0.2 1 4 7/C I A.S 2 8 0 8 0 8.e C o l l e c t i o n2 0 2 1.5 Z h a n gJ,W a n gK,Q i J,e ta l.T h eH s p 9 0i n h i b i t o r1 7-DMA Ga t t e n u a t e sh y p e r g l y c e m i a-e n h a n c e dh e m o r r h a g i ct r a n s f o r m a-t i o n i ne x p e r i m e n t a ls t r o k eJ.B i o m e dR e sI n t,2 0 2 1,2 0 2 1:6 6 6 8 4 4 2.D O I:1 0.1 1 5 5/2 0 2 1/6 6 6 8 4 4 2.6 Y a n gQ,Y a n gY,L iX.R e l a t e d f a c t o r so f c e r e b r a l h e m o r r h a g ea f t e rc e r e b r a l i n f a r c t i o na n dt h ee f f e c to fa t o r v a s t a t i nc o m-b i n e dw i t hi n t e n s i v en u r s i n gc a r eJ.C o m p u tM a t h M e t h o d sM e d,2 0 2 2,2 0 2 2:9 5 4 6 0 0 6.D O I:1 0.1 1 5 5/2 0 2 2/9 5 4 6 0 0 6.7 S a l m a nM,I s m a e lS,L iL,e ta l.A c u t eh y p e r g l y c e m i ae x a c e r-b a t e sh e m o r r h a g i ct r a n s f o r m a t i o na f t e re m b o l i cs t r o k ea n dr e p e r f u s i o nw i t ht P A:ap o s s i b l er o l eo fT X N I P-N L R P 3i n-f l a mm a s o m eJ.JS t r o k e C e r e b r o v a s c D i s,2 0 2 2,3 1(2):1 0 6 2 2 6.D O I:1 0.1 0 1 6/j.j s t r o k e c e r e b r o v a s d i s.2 0 2 1.1 0 6 2 2 6.8 L vG,W a n gGQ,X i aZ X,e ta l.I n f l u e n c e so fb l o o dl i p i d so nt h eo c c u r r e n c ea n dp r o g n o s i so fh e m o r r h a g i ct r a n s f o r m a t i o na f t e ra c u t ec e r e b r a l i n f a r c t i o n:ac a s e-c o n t r o l s t u d yo f 7 3 2p a-t i e n t sJ.M i l M e d R e s,2 0 1 9,6(1):2.D O I:1 0.1 1 8 6/s 4 0 7 7 9-0 1 9-0 1 9 1-z.9 D e s i l l e sJ P,S y v a n n a r a t hV,O l l i v i e rV,e ta l.E x a c e r b a t i o no ft h r o m b o i n f l a mm a t i o nb yh y p e r g l y c e m i ap r e c i p i t a t e sc e r e b r a li n f a r c tg r o w t ha n dh e m o r r h a g i ct r a n s f o r m a t i o nJ.S t r o k e,2 0 1 7,4 8(7):1 9 3 2-1 9 4 0.D O I:1 0.1 1 6 1/S T R OK E AHA.1 1 7.0 1 7 0 8 0.1 0 H u a n gQ,D iL,Y uF,e t a l.A l t e r a t i o n s i nt h eg u tm i c r o b i o m ew i t hh e m o r r h a g i c t r a n s f o r m a t i o ni ne x p e r i m e n t a ls t r o k eJ.C N SN e u r o s c iT h e r,2 0 2 2,2 8(1):7 7-9 1.D O I:1 0.1 1 1 1/c n s.1 3 7 3 6.1 1 C o u r e tD,B o u r a n eS,C a t a nA,e ta l.Ah e m o r r h a g i ct r a n s f o r-m a t i o nm o d e l o fm e c h a n i c a l s t r o k e t h e r a p yw i t ha c u t eh y p e r-g l y c e m i a i n m i c eJ.JC o m p N e u r o l,2 0 1 8,5 2 6(6):1 0 0 6-1 0 1 6.D O I:1 0.1 0 0 2/c n e.2 4 3 8 6.(收稿日期:2 0 2 3-0 1-1 6)(本文编辑:纪艳明)568中华老年心脑血管病杂志2 0 2 3年8月 第2 5卷 第8期 C h i nJG e r i a t rH e a r tB r a i nV e s s e lD i s,A u g2 0 2 3,V o l 2 5,N o.8