肝肠胞虫对凡纳滨对虾肠道和肝胰腺菌群的影响.pdf

doi:10.7541/2023.2023.0116肝肠胞虫对凡纳滨对虾肠道和肝胰腺菌群的影响李舢舢 赵晨曦 吴 波 郑侠飞 戴文芳 林志华 柳敏海(浙江万里学院宁海海洋生物种业研究院,浙江省水产种质资源高效利用技术研究重点实验室,宁波 315000)摘要:利用16S rRNA高通量测序对比研究了健康对虾和感染肝肠胞虫的发病对虾肠道及肝胰腺菌群的组成、多样性、微生物介导的功能和种间互作间的差异性。结果表明,健康对虾的肠道和肝胰腺细菌群落的多样性高于发病对虾。在属水平上,健康对虾和发病对虾的肠道及肝胰腺中的优势细菌组成及丰度存在明显不同,其中健康对虾肠道中的优势菌属主要为埃希杆菌-志贺菌属(Escherichia-Shigella)和海绵菌属(Spongiimonas),而发病对虾肠道中的优势菌属则为希瓦式菌属(Shewanella)、巨球型菌属(Megasphaera)和克雷伯氏菌属(Klebsiella);健康对虾肝胰腺中的优势菌属主要为假单胞菌属(Pseudomonas)和汉氏盐单胞菌(Halomonas),而发病对虾肝胰腺中的优势菌属则为贪铜菌属(Cupriavidus)。Tax4Fun2预测显示,健康对虾肠道和肝胰腺菌群的主要功能分别与发病对虾肠道和肝胰腺菌群的主要功能有明显差异。研究有助于了解肝肠胞虫对凡纳滨对虾肠道及肝胰腺细菌群落的影响,并为凡纳滨对虾的健康管理和养殖提供依据。关键词:肠道菌群;16S rRNA测序;功能预测;凡纳滨对虾中图分类号:S941.5 文献标识码:A 文章编号:1000-3207(2024)02-0315-09 水产养殖为不断增长的全球人口提供食物来源方面发挥着关键作用。据联合国粮食及农业组织(Food and Agriculture Organization of the UnitedNations,FAO)发布的2022年世界渔业和水产养殖状况报告1,水产品对粮食安全和营养贡献之大前所未有。全国水产品总产量6690.29万吨,养殖产量5394.41万吨,甲壳类动物位居养殖产量第二,其中约70%的甲壳类动物来自虾和蟹2。凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)是南美洲太平洋沿岸、秘鲁北部及亚洲等地区主要养殖物种之一,其养殖过程中也面临一些挑战3,如频繁暴发的疾病:白斑综合征(White Spot disease,WSD)4、肝胰腺微孢子虫病(Hepatopancreatic microsporidiosis,HPM)5、急性肝胰腺坏死病(Acute hepatopancreatic necrosisdisease,AHPND)6、Taura综合征(Taura syndrome,TS)7和黄头病(Yellow head disease,YHD)8,其中HPM已给凡纳滨对虾养殖造成了巨大的损失9。虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)是引起对虾HPM的主要病原10,已成为对虾养殖业最致命的威胁之一,肝胰腺是易受EHP感染的组织,在肠道和胃中也检测到EHP感染11,12。在EHP感染早期,对虾通常不会死亡,摄食正常且无明显疾病症状;感染后期,对虾生长缓慢或停滞生长,产量严重下降、经济损失严重。最近的研究表明由EHP感染引起的肝胰腺微孢子虫病已在不同地区报告,包括越南、印度、文莱、中国、印度尼西亚、马来西亚、委内瑞拉和澳大利亚等国家13,1418。自2013年以来,我国各地养殖的凡纳滨对虾先后出现EHP感染,且感染率居高不下19。肝胰腺作为虾的主要消化腺,分泌消化酶,EHP感染肝胰腺导致虾生长不良和免疫力受损。Ha等20报道越南养殖的斑节对虾感染EHP后生长缓慢,且伴有白便症状;第 48 卷 第 2 期水 生 生 物 学 报Vol.48,No.2 2024 年 2 月ACTA HYDROBIOLOGICA SINICAF e b.,2 0 2 4 收稿日期:2023-04-18;修订日期:2023-07-05基金项目:浙江省农业新品种选育重大科技专项(2021C02069-5-4);浙江省“三农九方”科技协作计划“揭榜挂帅”项目(2023SNJF064);宁波市重点研发计划暨“揭榜挂帅”项目(2023Z113);浙江省公益技术应用研究计划(LGN21C190011);国家现代农业产业技术体系资助 Supported by the Zhejiang Major Program of Science and Technology(2021C02069-5-4);Ningbo Key R&D Plan and“Unveiling and Leading”Project(2023Z113);Zhejiang Agricultural Science and Technology Cooperation Program Project(2023SNJF064);Zhejiang Major Program of Science and Technology(LGN21C190011);China Agriculture Research System ofMOF and MARA作者简介:李舢舢(1998),女,硕士研究生;主要研究方向为水产健康养殖与病害防控研究。E-mail:通信作者:柳敏海(1979),男,高级工程师;主要研究方向为海水养殖动物繁育及养殖。E-mail:The Author(s)2024.This is an open access article under the CC-BY 4.0 License(https:/creativecommons.org/licenses/by/4.0/).Flegel等21发现了与 Ha 等20报道相同现象,认为泰国和越南养殖的斑节对虾及凡纳滨对虾的白便症状与EHP有一定的关系,EHP已成为制约凡纳滨对虾养殖业健康发展的最主要病害之一22。目前,有关EHP感染是否影响凡纳滨对虾肠道及肝胰腺中细菌群落的研究鲜有报道。因此,本研究比较了凡纳滨对虾健康样本和感染EHP的发病样本中其肠道和肝胰腺微生物的结构、多样性和组成差异,进一步探究了其肠道及肝胰腺菌群介导的功能。本研究旨在确定健康对虾、发病对虾之间的细菌组成差异,筛选肠道和肝胰腺中的优势菌属用于区分健康对虾和发病对虾。1 1 材料与方法 1.11.1 实验材料养殖池塘投放同一批次凡纳滨对虾苗种,养殖48d后,表现出明显的体长和体重差异,2022年5月31日从养殖池中随机采集生长差异的对虾,大虾(D)平均体重(8.110.36)g,平均体长(86.421.18)mm;小虾(X)平均体重(1.730.12)g,平均体长(50.041.21)mm;D和X的平均体重和体长均存在极显著差异(P0.05),而D.C中细菌群落与X.G细菌菌落存在差异(P0.05),S细菌群落与D.G中细菌菌群存在差异(P0.05)。从Chao1和ACE可知,D.C与X.C、S与X.C及S与X.G细菌群落之间丰度差异显著(P0.05)。Bate多样性分析结果非定向多样性是对某些环境或实验因素响应的群落结构变化的度量。使用OTU水平的细菌群落的PCoA来可视化D和X中肠道和肝胰腺细菌群落的差异(图 4),D.C和X.C微生物群落、D.G和X.G微生物群落的组成是均匀的且高度相似性,而S的细菌群落较虾肠道及虾肝胰腺的细菌群落相似性较低。ANOSIM检验结果进一步证实了水体、肝胰腺和肠道之间的微生物群落差异。由表 2可知,D.G中细菌群落与S中细菌群落存在极显著差异(P0.001),D.G中细菌群落与D.C细菌群落、X.C细菌群落与D.G细菌群落、X.G群落与S中的细菌群落均显著差异(P0.05)。2.32.3 细菌群落的组成基于门分类水平上的物种注释及分析基于门(Phylum)分类水平构建相对丰度累加图(图 5)。D.C主要是拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Pro-图 2 各样本间OTU的差异性Fig.2 Variability of OTU among samples010000200003000040000Sequences numberObserved species numberD.CD.GX.CX.GS100200300400500600700 图 3 测序结果的稀释曲线Fig.3 Rarefaction curve of sequencing results表 1 各样品-多样性指数差异表Tab.1 Differences in alpha-diversity indices among samples(meanSD,n=3)样本SampleShannon指数Shannon indexSimpson指数Simpson indexChao 1指数Chao 1 indexACE指数ACE indexD.C4.0370.937b0.8220.066ab688.161164.789a692.708157.222aD.G2.1901.322bc0.5120.305bc403.370174.842b428.822172.807bS6.0550.389a0.9490.023a718.78415.894a721.47413.715aX.C3.1560.326ba0.7800.056ab372.47554.369b396.21695.314bX.G1.2900.774c0.3490.224c215.211102.275b229.10223.534b注:表中数据为3个重复的平均值;同一行右上角含有相同英文上标字母或无上标表示无显著差异(P0.05)Note:Data are means of triplicates.Means in each bar sharing the same superscript letter or absence of superscripts are not significantlydifferent determined by Tukeys test(P0.05)2 期李舢舢等:肝肠胞虫对凡纳滨对虾肠道和肝胰腺菌群的影响317teobacteria)及厚壁菌门(Firmicutes),以上三门微生物占菌群总量的94.42%;变形菌门是D.G、X.C、X.G及S优势菌群,占比分别为86.19%、38.18%、87.74%、40.68%。在D.G及X.G中未检测到其他共有的优势菌门,而在X.C及S中还检测到拟杆菌门为共有优势菌门。D.C与X.C共有拟杆菌门、变形菌门及厚壁菌门3个优势菌门。D.C与S有拟杆菌门、变形菌门2个优势菌门。五组样品的细菌种群在门水平上的组成和分布说明在同一养殖池塘中D.C、X.C、S、D.G、X.G中细菌菌群组成有密切的关联。基于属分类水平上样本菌群组成分析在属(Genus)水平上,D和X的肠道及肝胰腺内优势细菌的组成及丰度存在明显不同(图 6)。D.C优势菌属为埃希杆菌-志贺菌属(Escherichia-Shigella)、海绵菌属(Spongiimonas),而X.C优势菌属为希瓦式菌属(Shewanella)、巨球型菌属(Megasphaera)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)。D.G优势菌属是假单胞菌属(Pseudomonas)、汉氏盐单胞菌属(Halomonas),而X.G优势菌属为贪铜菌属(Cupriavidus)。由于S中的菌群的多样性较高,因此具有优势丰度的菌群数量居多。2.42.4 菌群与预测功能特征的相关性利用Tax4Fun2预测菌群中的潜在功能并绘制功能丰度聚类图(图 7)。结果显示:D.C与X.C、D.G与X.G存在明显差异,其中D.C菌群的主要功能为氨基酸代谢、X.C菌群的主要功能为转运RNA;D.G菌群的主要功能为二分组系统,而X.G菌群的主要功能为肽酶。3 3 讨论 3.13.1 肠道及肝胰腺菌群生物多样性分析凡纳滨对虾作为产量最高的经济虾之一,受到了养殖户的广泛关注和选择23。与其他虾相比,微生物菌群与健康、疾病、生长速度有关24,与其他种类虾相比,凡纳滨对虾的生长速度和繁殖速度非常迅速,其所需的高蛋白饲料可以实现大规模的养殖。肠道菌群为宿主提供有益的功能,如营养素的吸收、消化酶的产生、通过激活对病原体的保护机制产生宿主代谢必需元素和免疫反应,以及与致病菌产生竞争关系25。虽然已有研究揭示对虾肠道内的细菌组成26,最近研究发现27,正常水生生物和患病水生生物具有不同功能的消化系统,它们pcoa1(30.85%)pcoa2(12.67%)PCOA0.500.2500.250.500.7521012D.CD.GX.CX.GS 图 4 不同样本之间细菌群落的多样性Fig.4 Beta diversity of bacterial communities among differentsamplesD.CD.GX.CX.GS0255075100相对丰度Relative abundance(%)ProteobacteriaFirmicutesBacteroidotaunidentified_BacteriaVerrucomicrobiotaKapabacteriaDesulfobacterotaActinobacteriaCyanobacteriaPlanctomycetotaOthers样本名称Sample name 图 5 各组样本中的优势细菌门的平均相对丰度分布情况Fig.5 Mean relative abundance distribution of the dominantbacterial phylum in each group of samples表 2 不同样本组之间方差的置换多变性分析Tab.2 Displacement multivariance analysis of variance betweendifferent sample groups组别GroupR2PD.GD.C0.5490.007SD.C0.3320.284X.CD.C0.2470.998X.GD.C0.2930.074SD.G0.0860.000X.CD.G0.0750.005X.GD.G0.3780.603X.CS0.3890.397X.GS0.3040.003X.GX.C0.1320.049318水 生 生 物 学 报48 卷产生的微生物群落也具有多样性。肝胰腺是甲壳类动物消化、吸收和储存营养物质的重要器官,在调节宿主先天免疫方面也发挥着关键作用。自2009年泰国研究者Peng和Pu12首次发现一种未知的微孢子虫,经过后续的研究命名为EHP。EHP主要在凡纳滨对虾的肠道表皮表层、肝脏、胰脏及附着在肝胰腺小管上皮的细胞上,被感染的对虾其病变位置出现肿大现象,并且有大量的嗜碱性包涵体存在于肝胰脏小管上皮细胞的细胞质内。研究表明凡纳滨对虾生长缓慢跟EHP的感染有直接关系28。本研究表明:健康虾的肠道和肝胰腺菌群的丰度及多样性比发病虾的肠道和肝胰腺的丰度及多样性更高,表明受EHP侵染对凡纳滨虾肠道及肝胰腺菌群多样性造成了一定的影响,这一结果与吴金凤等29、段健诚等30研究的结果相似。3.23.2 肠道及肝胰腺菌群结构分析肠道是水生动物共生微生物定殖和增殖的适宜环境31。肠道也是消化吸收营养物质的主要器官,是机体最大的“免疫器官”。肠道菌群是构建抵御病原体的第一道屏障,促进肠道健康并确保肠道持续正常的生理功能。在门水平,变形菌门、拟杆菌门、放线菌门和厚壁菌门在不同发育阶段的虾肠道中均占优势。Tzeng等32比较了不同栖息环境日本沼虾(Macrobrachium nipponense)肠道细菌组成,发现主要为变形菌门,其次是厚壁菌门和放线菌门。Rungrassamee等33研究发现不同发育阶段的斑节对虾肠道优势菌都是变形菌门。郁维娜等34发现健康和患病的凡纳滨对虾肠道主要菌群均为变形菌门(51.2%)和放线菌门(27.2%)。Mente等35研究处于蜕壳不同阶段罗氏沼虾(MacrobrachiumSX.GX.CD.GD.CPhylumPseudomonasHalomonasVibrioCupriavidusRalstoniaRuegeriaSCGC_AAA164E04PhaeodactylibacterMarivitaMarinovumRubritaleaErythrobacterPhaeocystidibacterCyclobacteriumWinogradskyellaVicingusCandidatus_AquilunaNS3a_marine_groupAlgoriphagusMaribacterunidentified_ChloroplastThiothrixMotilimonasMarinicellaTamlanaShewanellaMegasphaeraKlebsiellaPhotobacteriumFlavobacteriumZOR0006EscherichiaShigellaSpongiimonasParacoccusCandidatus_BacilloplasmaPhylumActinobacteriaBacteroidotaCyanobacteriaFirmicutesProteobacteriaVerrucomicrobiota1.51.00.500.51.01.5图 6 菌群在属水平丰度聚类热图Fig.6 Abundance clustering heat map of the bacteriophage at the genus level2 期李舢舢等:肝肠胞虫对凡纳滨对虾肠道和肝胰腺菌群的影响319rosenbergii)的肠道优势菌主要为变形菌门,其次为厚壁菌门。段健诚等30研究肝肠胞虫病虾及健康虾肠道菌群,优势菌群也为变形菌门和厚壁菌门。本实验研究得到健康对虾与发病对虾中肠道及肝胰腺中的优势菌组成类似,其中健康虾与发病对虾肠道中的优势细菌均属于变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门,而其肝胰腺中的优势菌门均为变形菌门。这一结果与其他虾肠道优势菌亦类似,表明健康对虾与发病对虾中肠道与肝胰腺细菌群落具有高度的相似性。而在属水平上,健康对虾和发病对虾的肠道及肝胰腺内优势细菌的组成及丰度存在明显不同,健康对虾肠道中的丰度最大的优势菌属为埃希杆菌-志贺菌属、海绵菌属;而发病对虾肠道中的则为希瓦式菌属、巨球型菌属和克雷伯氏菌属。健康对虾肝胰腺中最具优势丰度的是假单胞菌属、汉氏盐单胞菌,而发病对虾肝胰腺中的则为贪铜菌属。蒋葛等36研究凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死综合症病虾与健康虾肠道优势菌群,发现不同生长阶段病虾肠道中的优势菌属均为弧菌属(vibrio),而健康虾幼虾肠道优势菌属为假单胞菌属,养殖中期的优势菌属为发光杆菌属(Photobacterium),养殖后期的优势菌属为弧菌属;而Jess AntonioLpez-Carvallo等37研究发现虾感染EHP后期,肝胰腺丰度最高的菌属为假单孢菌属。同时研究表明38,肝肠胞虫病会引起对虾饮食及个体大小不同,这些差异可能会影响虾肠道微生物的变化。李彦芹等39曾进行了一项初步研究,比较了摄食不同饵料对日本沼虾肠道菌群的影响,研究结果表明:摄食人工饲料及小黄鱼的日本沼虾的肠道的优势菌群均为邻单胞菌属(Plesiomonas)和假单胞菌属,且研究还发现摄食饲料后的肠道细菌数量与摄食饲料前相比呈先增后减的趋势;另外,杨慧赞等40研究发现大虾和小虾在菌属水平存在显著差异,大虾的主要优势菌属为乳杆菌属(Lactobacillus)和片球菌属(Pediococcus)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、军团杆菌属(Legio-nella),而小虾的主要优势菌属为红小梨形菌属(Rho-dopirellula)、布拉格菌属(Pragia)和不动杆菌属X.G D.GX.C D.C SSecretion_systemTwo_component_systemABC_transportersTransportersQuorum_sensingPeptidasesDNA_repair_and_recombination_proteinsTransfer_RNA_biogenesisAmino_acid_related_enzymesPurine_metabolism1.510.500.511.5图 7 Tax4Fun2功能丰度聚类图Fig.7 Tax4Fun2 functional abundance clustering map320水 生 生 物 学 报48 卷(Acinetobacter)。3.33.3 肠道及肝胰腺菌群功能预测分析虾肠道内富含许多微生物,其中包括一些能够代谢蛋白质的细菌和酵母菌,将蛋白质分解成小分子的氨基酸,提供给对虾进行吸收利用。本研究中Tax4Fun2预测结果显示,健康对虾肠道菌群的基因功能与新陈代谢功能有关,主要为氨基酸代谢。研究表明健康虾肠道菌群代谢氨基酸可能通过合成蛋白质、酶和激素等功能来维持健康状态并提供能量41,同时Li等42也做了相关研究,证实了这一观点。而发病对虾的肠道菌群和肝胰腺菌群的基因功能主要与遗传信息处理功能有关,王金星等43研究发现相关基因和遗传信息可以影响肝胰腺肠道菌群的组成和数量,从而影响虾类的免疫系统和代谢。健康对虾肠道及肝胰腺菌群的基因功能和发病对虾肠道及肝胰腺菌群之间的基因功能不同,导致它们对病原体的不同反应,这为研究虾类疾病的病理机制提供启示,并帮助开发更有效的防治策略。综上所述,健康对虾与发病对虾间的肠道和肝胰腺中的优势菌门具有高度相似性,但优势菌属组成及丰度存在明显不同。健康对虾肠道和肝胰腺的菌群的主要功能与发病对虾肠道和肝胰腺的主要功能存在明显差异。本研究有助于了解肝肠胞虫对凡纳滨对虾肠道及肝胰腺细菌群落的影响,并为凡纳滨对虾的疾病管理和健康养殖提供依据。参考文献:Liu W W.The report issued by FAO pointed out that con-tribution of aquatic foods to food security and nutrition isunprecedented J.China 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