甘草素对乳腺癌内分泌治疗后继发性骨质疏松大鼠Wnt_β-catenin信号通路作用的研究.pdf

世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，实验研究 ：基金项目：河北省 年度医学科学研究课题计划（）；国家自然科学基金（）作者单位：石家庄市第六医院（石家庄市妇幼保健院）普外科，河北 石家庄 ；石家庄燕赵医院骨外科，河北 石家庄 通信作者：邢如温，：甘草素对乳腺癌内分泌治疗后继发性骨质疏松大鼠 信号通路作用的研究邢如温李双进【摘要】目的探讨甘草素（，）对乳腺癌内分泌治疗后继发性骨质疏松症（，）大鼠 信号通路的影响。方法将 只 级 月龄雌性未孕 （）大鼠，按随机数字表法分为假手术组、去势组、模型组、组、组、组、组，每组各 只。建立继发性 大鼠模型，除假手术组外，其余组均进行双侧卵巢切除术，假手术组开腹剪去适量脂肪组织，逐层缝合，术后 周给予蒸馏水；去势组、模型组、组及 各组均行双侧卵巢切除术，术后 周模型组大鼠给予来曲唑，组大鼠给予来曲唑 阿仑膦酸钠，各组均给予来曲唑 甘草素，其中 组给予甘草素高剂量 （），组给予甘草素中剂量 （），组给予甘草素低剂量 （），假手术组和去势组大鼠给予蒸馏水。各组大鼠灌胃 周后腹主动脉取血，使用酶联免疫吸附测定（，）检测血清雌二醇（，）、骨碱性磷酸酶（，）和 型前胶原氨基端原肽（，）；处死大鼠后取右侧股骨，使用显微断层扫描（）检测骨密度及骨小梁微结构、染色观察骨组织形态；取第四腰椎骨（），使用 型生物力学测试系统进行腰椎压缩试验，分析各组大鼠骨生物力学性能；蛋白免疫印迹法（）检测大鼠胫骨组织 信号通路相关蛋白表达。结果与假手术组比较，去势组、模型组大鼠最大载荷和刚度、含量明显降低，、明显增加，骨小梁纤细且分布稀疏、结构不完整，、蛋白表达水平均明显降低；与模型组比较，组、组、组、组大鼠最大载荷和刚度、含量明显增加，、明显降低，骨组织形态均有明显改善，、蛋白表达水平均明显上调；与 组比较，组、组、组大鼠最大载荷和刚度、含量明显增加，、明显降低，骨组织形态均有明显改善，、蛋白表达水平均明显上调；差异均有统计学意义（）。结论 可有效改善乳腺癌内分泌治疗后继发性 大鼠雌激素水平低下的病理状态，提高骨密度、骨生物力学特性，其机制可能与 提高雌激素水平，激活 信号通路，上调 、蛋白，抑制 活性，减少 降解，促进骨细胞增殖分化，增加骨密度，从而改善骨组织形态。【关键词】甘草素；乳腺癌；内分泌治疗；继发性骨质疏松症；信号通路【中图分类号】【文献标识码】，（，（），；，）【】（）（）（），（），（），世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，：（），：（），：（），（）（），（），（）（），（）（），（），【】；临床实践指南建议激素受体阳性的乳腺癌患者术后需进行 年内分泌治疗 ，内分泌治疗是绝经后乳腺癌患者常用的一线辅助激素疗法，但它在抑制雌激素依赖性乳腺癌细胞生长的同时，也会抑制雌激素对骨组织的保护效应，即抑制成骨细胞的形成，增加破骨细胞的活性，从而增加乳腺癌患者内分泌治疗后发生骨质疏松症（，）的风险 ；临床表现为关节钝痛、骨骼酸麻无力，在劳累后更为明显。目前，治疗 的主要措施有选择性雌激素受体调节剂、雌激素替代疗法等，但这些疗法在减轻骨丢失的同时也会导致心血管疾病、子宫内膜癌、非典型股骨骨折等副作用，从而限制了临床应用 。因此，寻求有效低毒的 治疗替代方案已成为一项重要的公共卫生课题。近年来，为提高疗效且降低副作用，医学研究者们提出使用天然植物提取物作为治疗骨骼疾病的有效措施。其中，甘草素（，）是一种从甘草根中提取的三萜类化合物，目前大量研究已证实 具有明显的抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等生物学特性 。等发现 ，可降低斑马鱼糖皮质激素诱导的 模型中的破骨细胞活性。然而，在大鼠体内是否也具有相同功效尚不确切。本研究通过去势大鼠造 模型 ，术后灌以来曲唑，模拟内分泌治疗状态 ，通过 治疗中对骨代谢指标、骨密度、骨微结构等指标的改变，模拟临床用药疗效，探究 治疗乳腺癌内分泌治疗后继发性 大鼠的影响及保护机制，以期为临床治疗 提供理论依据。材料与方法 材料 实验动物 级 月龄雌性未孕 （）大鼠，只，体质量 ，由北京科兴生物制品有限公司提供（动物合格证号：（京）；动物生产许可证编号：（京），严格遵循动物饲养规则统一正常喂养，周后用于模型构建。本课题所有动物实验均已通过本院动物保护与伦理委员会批准（审批号：）。实验动物饲养条件：所有大鼠饲养条件一致，标准清洁级动物房，专人饲养管理，洁净饮水、标准大鼠饲料、白天 黑夜：，单笼喂养，自由饮食，动物房通风良好，光照充足，室温 ，湿 世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，度 。主要实验试剂及仪器 主要试剂甘草素（武汉天植生物技术有限公司，货号：，纯度 ）；来曲唑（江苏恒瑞医药股份有限公司，生产批号 ）；雌二醇（，）、骨碱性磷酸酶（，）大鼠酶联免疫吸附（，）测定试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，批号：）、型前胶原氨基端前肽（，）大鼠 试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司，批号：）；兔抗大鼠 抗体（美国 公司，批号：）；兔抗大鼠 、抗体（美国 公司，批号：、）；兔抗大鼠 多抗、苏 木 素 染 色 液（美 国 公 司，批 号：、）；伊红染色液（国药集团化学试剂有限公司，批号：）；甘油醛 磷酸脱氢酶（）（武汉博士德生物工程有限公司，批号：）。主要仪器 （，比利时）；病理切片机（，德国徕卡）；酶标仪（北京普朗新技术有限公司，）；脱水机（武汉泰兴电子有限公司，）；灰度分析软件（，）；图像分析软件（，）；电子天平（梅特勒 托利多仪器有限公司，）。方法 分组与用药将 只大鼠按照随机数字法分为假手术组（假手术，蒸馏水）、去势组（行双侧卵巢切除术，蒸馏水）、模型组（行双侧卵巢切除术，来曲唑）、组（行双侧卵巢切除术，来曲唑 阿仑膦酸钠）、组（行双侧卵巢切除术，来曲唑 甘草素高剂量）、组（行双侧卵巢切除术，来曲唑 甘草素中剂量）、组（行双侧卵巢切除术，来曲唑 甘草素低剂量），每组各 只。大鼠乳腺癌内分泌治疗后继发性骨质疏松症模型建立 大鼠去势模型建立除假手术组，其余 组行双侧卵巢切除手术（），建立骨质疏松症大鼠模型。给予模型组及治疗组大鼠腹腔注射 水合氯醛注射液麻醉（），于腹正中（腹股沟连线中点）做 左右切口，进入腹腔，轻提乳白色脂肪组织，找到子宫颈，沿着子宫末端可见卵巢（子宫呈 型），将卵巢与子宫之间夹闭后结扎，完整切除双侧卵巢，确认无渗血后，将周围组织放回原位，逐层缝合伤口，而假手术组开腹剪去适量脂肪组织，逐层缝合。术后给予大鼠腹腔注射青霉素预防感染。术后 自由进水，后投食，术后 进行细胞涂片及苏木精伊红染色法（，），结果假手术组表现为动情间期及动情期交替出现，其余大鼠均表现为动情间期连续 。若光镜下可观察到较多外底层细胞及白细胞，并无动情周期规律性变化，观察阴道脱落细胞的角化细胞说明雌激素水平降低 ，则卵巢摘除手术成功，去势模型建立，见图 。图 光镜下大鼠不同时期阴道涂片（）动物分组及给药处理术后 周开始给药，假手术组和去势组大鼠给予蒸馏水 （），模型组：来曲唑 （），组：来曲唑 （）阿仑膦酸钠 （），组：来曲唑 （）甘草素高剂量 （），组：来曲唑 （）甘草素中剂量 （），组：来曲唑 （）甘草素低剂量 （）。每日上午给药 次，共给药 周，每周称重 次，按体质量调整给药剂量，并观察生命及活动情况。灌药过程中各组大鼠均有死亡，经解剖发现假手术组死亡只（灌胃损伤食管），去势组死亡 只（只灌胃损伤食道，只蒸馏水进入肺内），模型组死亡 只（均为灌胃损伤食管），阿仑膦酸钠组死亡只（只药液进入肺内，只灌胃损伤食管），甘草素高剂量组死亡 只（药液进入肺内），甘草素中剂量组死亡只（药液进入肺内），甘草素低剂量组死亡只（灌胃损伤食管）。世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，标本采集取材前，大鼠禁食不禁水 。对大鼠采用腹腔注射 水合氯醛注射液（）进行麻醉，腹主动脉取血，收集并分离血清，保存备用。取大鼠双侧股骨、胫骨及第四腰椎骨（），去除附着的结缔组织及肌肉，将右侧股骨、胫骨置于液氮中保存备用，将左侧股骨、胫骨置于 多聚甲醛中固定，椎体用生理盐水浸透的湿纱布包裹备用。骨生物力学测定检测前修剪 椎体，砂纸打磨椎体上下端，保证两面水平，使用 型生物力学测试系统进行腰椎压缩试验，分析 椎体最大载荷及刚度。大鼠股骨组织形态学分析首先进行骨组织脱钙：取大鼠右侧股骨，制成约 大小骨标本，进行常规固定后，分别使用 、蒸馏水清洗，将股骨组织转移至 脱钙液（）中脱钙，脱钙液每周一换并检查脱钙程度，脱钙 周，以大头针可轻松穿透股骨即为脱钙终点。已脱钙标本使用流水冲洗 后，乙醇进行梯度脱水，石蜡包埋、切片。行 染色，染色前将石蜡切片常规脱蜡，脱蜡完成后依次按照如下顺序进行染色：苏木素染色 ，纯水洗 ，伊红染色 ，纯水洗 ，盐酸 乙醇分化也分化 ；染色完成后对组织进行梯度乙醇脱水及二甲苯透明；中性树脂胶封片，光学显微镜下观察股骨组织结构。骨密度及骨小梁微结构检测使用显微断层扫描（）检测骨密度及骨小梁微结构。取出备用的右侧股骨，扫描右侧股骨远端局部骨密度（，）及骨小梁微结构：骨体积分数（）、骨小梁厚度（）、骨小梁数目（）、骨小梁分离度（），其中发生骨质疏松时，、指标降低，增大。将处理好的离体股骨样本置于扫描管中扫描，按照仪器标准操作规范进行，扫描参数：电压 ，电流 ，曝光 ，设定测量精确度 。使用 软件重新扫描，扫描后将数据导入 软件，以生长板为参考层面绘制小梁感兴趣区域（），厚度参数为 ，手动勾选股骨区域，测量兴趣区区域骨小梁结构参数。软件计算得到各部位 值，通过与相同条件扫描的标准品对应 值，换算得到 值（单位 ）。随后使用 构建三维模型，观察骨小梁结构变化。血清中雌二醇（）及骨代谢标记物检测使用 检测大鼠血清中骨碱性磷酸酶（）、型前胶原氨基端原肽（）及 含量，检测严格按照试剂盒说明书步骤进行操作，反应结束后，即刻用酶标仪在 波长处测定每孔吸光度 ，通过标准曲线计算大鼠血清中 、及 含量。蛋白免疫印迹法（）检测大鼠胫骨组织 信号通路相关蛋白表达取大鼠右侧股骨组织约 ，使用 法测定蛋白含量。规定蛋白量为 ，进行 电泳分离，转至 膜，加含有 的封闭液室温封闭 ，缓冲液洗膜 次，加入 （），（），（），（），（）一抗，孵育过夜，次日用缓冲液清洗 膜次，加入二抗（）常温下孵育 ，洗膜 次，最后加 发光液曝光，胶片成像，为内参，采用 图像分析软件测定各电泳条带的灰度值。统计学方法采用 统计学软件进行统计分析，计量资料均服从正态分布，多组件均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用 检验，作图工具采用 软件。为差异有统计学意义。结果 各组大鼠骨生物力学指标比较与假手术组比较，去势组、模型组大鼠最大载荷和刚度明显降低，差异有统计学意义（）；与模型组比较，组、组、组、组大鼠最大载荷和刚度明显增加，差异有统计学意义（）；与 组比较，组、组、组大鼠最大载荷和刚度明显增加，差异有统计学意义（）。结果见图 。对大鼠股骨形态结构的影响假手术组大鼠骨组织表现为骨小梁结构完整且连接均匀，骨细胞及脂肪细胞形态清晰；去势组与模型组大鼠表现为骨小梁纤细且分布稀疏，结构不完整，且模型组表现更严重；相比于模型组，组、组、组、组的骨组织形态均有明显改善，提示干预药物均可改善继发性骨质疏松样病变骨质。结果见图 。世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，注：与假手术组比较，；与模型组比较，；与 组比较，图 各组大鼠骨生物力学指标比较图 对各组大鼠股骨形态结构的影响（染色，）各组大鼠股骨骨密度及骨微结构表达比较与假手术组比较，去势组、模型组大鼠 、明显降低，明显增加，差异有统计学意义（）；与模型组比较，组、组、组、组 大 鼠 、明显增加，明显降低，差异有统计学意义（）；与 组比较，组、组、组大鼠 、明显增加，明显降低，差异有统计学意义（）。结果见图 ，图 。各组大鼠骨小梁 重建图与 染色结果基本一致。结果见图。各组大鼠骨代谢水平比较与假手术组比较，去势组、模型组大鼠 、含量均明显增加，差异有统计学意义（）；与模型组比较，组、组、组、组大鼠 、含量均明显降低，差异有统计学意义（）；与 组比较，组、组、组大鼠大鼠 、含量均明显降低，差异有统计学意义（）。结果见图 。注：与假手术组比较，；与模型组比较，；与 组比较，图 各组大鼠股骨骨密度水平比较世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，注：与假手术组比较，；与模型组比较，；与 组比较，图 各组大鼠股骨骨微结构参数比较图 各组大鼠股骨骨小梁 重建图 各组大鼠血清 含量比较与假手术组比较，去势组、模型组大鼠 含量均明显降低，差异有统计学意义（）；与去势组比较，模型组大鼠 含量明显降低，差异有统计学意义（）；与模型组大鼠比较，组、组、组、组大鼠 含量均无明显差异（）。提示各用药组均未对 产生明显影响。结果见图 。各组大鼠骨细胞中 、蛋白表达比较与假手术组比较，去势组、模型组大鼠 、蛋白表达水平均明显降低，差异有统计学意义（）；与模型组比较，组、组、组、组大鼠 世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，注：与假手术组比较，；与模型组比较，；与 组比较，图 各组大鼠骨代谢水平比较注：与假手术组比较，；与去势组比较，图 各组大鼠血清 含量比较 、蛋白表达水平均明显增加，差异有统计学意义（）；与 组比较，组、组、组大鼠 、蛋白表达水平均明显增加，差异有统计学意义（）。结果见图 。讨论 是一种从中药甘草中提取的黄酮类化合物，在中医药中，常被作为许多中草药配方不可获取的药材，发挥调和药性、保肝的作用。近年来大量研究证实 ，具有抗炎、抗肿瘤和调节女性内分泌失调的功效。对于“绝经后”这一特殊生理年龄的女性患者普遍肝肾亏虚，而用于内分泌治疗绝经后乳腺癌患者的内分泌药物更增加了该类患者发生 的风险 。本研究基于该类患者体质特点，以及 药理特性，内分泌治疗的不良反应及以往文献提示 治疗绝经后 的相关报道 ，研究 是否同样可应用于内分泌治疗绝经后乳腺癌患者出现的继发性 。由于去卵巢 大鼠模型建模成功率高、建模因素单一、可重复性好及能较好体现 水平下降后骨量丢失、降低等，已成为绝注：与假手术组比较，；与模型组比较，；与 组比较，图 各组大鼠骨细胞中 、蛋白表达比较经后 研究应用最广泛的动物模型 。本研究亦构建去卵巢 模型，结果显示，与假手术组比较，去势组大鼠血清中 含量明显降低，提示本研究较好地模拟绝经后状态。来曲唑是一种芳香化酶抑制剂，可抑制雄激素向雌激素转化，本研究显示，经内分泌药物（来曲唑）治疗后 水平更为降低，提示去势后来曲唑加重 趋势，内分泌治疗后继发性 模型构建成功。世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，血清中 由成骨细胞分泌产生，可反映成骨细胞活性，是骨形成的催化剂，是评价骨形成的关键性指标，二者含量增加可间接反映骨丢失增多 。及骨生物力学可反映骨量、骨强度及物理特征，常被用于骨折危险性及骨脆性的判定，是临床预测骨折风险及诊断 的金标准，可客观反映 发生及药物对 的疗效 。骨微结构退化主要观察骨小梁变化，显微 分辨率可达微米级，可精确测量骨小梁变化 。本研究发现，与假手术组比较，染色发现模型组大鼠骨小梁结构不完整，分布稀疏；骨微结构参数 、明显降低，而 明显增加；骨最大载荷和刚度均明显降低；血清中 含量明显减少；骨代谢指标 、含量均明显增加；提示乳腺癌内分泌治疗后继发性 大鼠模型的雌激素水平下降，骨强度下降，骨量丢失，骨微结构退化。与临床上绝经后 病理状态相符。阿仑膦酸钠（，）是一种临床上用于治疗绝经后妇女的骨质疏松症，以预防髋部和脊柱骨折（椎骨压缩性骨折）。本实验选其作为阳性对照药，经药物干预后，与模型组比较，各剂量组及 组大鼠骨小梁结构形态、骨微结构均有明显改善，骨生物力学性能提高，明显增加；血清中 明显增加；骨代谢指标 、含量明显降低。由此说明，具有与 相似的药理作用，可改善大鼠体内雌激素水平下降，延缓骨量流失，骨密度及骨强度增加。阐明药物的作用位点，不仅有利于揭示疾病的病理机制，并且能更有力的推动药物的开发以及临床应用。已有研究报道 ，信号通路紊乱与 的发生密切相关。、是 信号通路的主要蛋白。是 通路的开关，决定该通路的激活与关闭 。是该通路的拮抗物，用于调控 的降解及被磷酸化 。是调控骨重塑的关键因子，该基因表达下调会使 通路活性下降 。当 信号通路激活时，及其受体与 结合，增强 、的磷酸化，抑制 活性，降解减少，导致 在细胞质中聚集，并转移到细胞核中，与核内转录因子 细胞因子 淋巴细胞增强因子（）结合，促进靶基因转录翻译，维持细胞的增殖和分化。本研究结果显示，与假手术组比较，去势组、模型组大鼠的 、蛋白表达水平均明显降低，提示乳腺癌内分泌治疗后继发性 大鼠体内 信号通路处于抑制状态，磷酸化降低且活性增加，降解增加，使得 在细胞质中含量减少，转移到细胞核中的量减少，启动内质网应激，骨细胞凋亡增加，诱发 ，与文献报道相符 。药物干预后，与模型组比较，各组和 组的 、蛋白表达水平均明显增加，提示 可激活 信号通路，上调 的表达，使得 活性降低，减少 的降解，胞质中更多的 向核内转移，进而骨母细胞向成骨细胞分化，增加骨密度。综上所述，可有效改善乳腺癌内分泌治疗后继发性 大鼠雌激素水平低下的病理状态，提高骨密度、骨生物力学特性，其机制可能与 提高雌激素水平，激活 信号通路，上调 、蛋白，抑制 活性，减少 降解，促进骨细胞增殖分化，增加骨密度，从而改善骨组织形态。参考文献 ，：？（），（）：，（），（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，？，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：（收稿日期：）（上接第 页）沈丕安 中华本草 上海：上海科学普及出版社，：王国强 全国中草药汇编 北京：人民卫生出版社，：，：，（）：，（）：清叶天士 临证指南医案 北京：中国医药科学技术出版社，：李晓林，沈金鳌，李占永 杂病源流犀烛 北京：中国中医药出版社，：王飞雪，黄小波，裴卉，等 血管性痴呆中医病机理论的传承和发扬 世界中医药，（）：向岁，石和元，谭爱华，等 基于“脑肠轴”学说探讨血管性痴呆的中医 脑肠 同 治 思 路 时 珍 国 医 国 药，（）：胡起超 血管性痴呆中医证候流行病学调查 光明中医，（）：曹放，何兴伟，郭翠，等 基于数据挖掘及网络药理学方法探讨血管性痴呆用药规律及机制研究 中医临床研究，（）：，（）：，“（）”（），（）：，（）：，：，（）：强伟杰，陈颖，贺福元，等 基于网络药理学探析远志散治疗痴呆的分子生物机制研究 数字中医药（英文版），（）：王守富，李建生，张伯礼 活血化瘀 法在心脑血管疾病中的运用 辽宁中医杂志，（）：郭先帅，吴纯伟，梁生旺，等 大黄与人参配伍用于治疗缺血性脑中风的探讨 中国现代医药杂志，（）：（收稿日期：）