α-淀粉酶酶蛋白的纯化.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,离子交换层析上柱前的准备工作,-,淀粉酶酶蛋白的纯化,离子交换层析,目的要求,了解针对蛋白质纯化的方法及相关原理,掌握离子交换层析用,-,淀粉酶酶蛋白的纯化方法及步骤,了解及学习利用柱层析系统的相关仪器组成、原理及基本操作,层析法又称色谱法或色层分析法，,1903,年茨维特（,M.S.Tsweet,）利用活性碳酸钙与石油醚的共同作用把叶绿素分离呈现出不同颜色的色谱带。茨维特把上述分离方法叫做,色谱（,chromatography,）,茨维特实验,按操作形式不同分类,柱层析：,将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。,纸层析：,用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。,薄层层析：,将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定,按流动相与固定相的不同划分,气相层析、液相层析。,这两大类层析是以,流动相,不同来划分的。,如同时区分,流动相,和,固定相,，划分为：气固层析、气液层析、液固层析和液液层析等。,常见酶蛋白的纯化方法,按层析过程的机理分类,吸附层析,利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴定的目的,分配层析,利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，使之分离。,离子交换层析,利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。,凝胶层析,利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。,亲和层析,利用生物分子间的特异性相互作用达到分离的目的。,凝胶过滤层析,亲和层析,0.05mol/L Tris-HCl pH8.0,缓冲液（含,5mmol/L,CaCl,2,）,量取,500mL 0.2mol/L Tris-HCl pH8.0,缓冲液，稀释定溶至,2000mL,；,加入,1.11g,无水,CaCl,2,（分子量,110.98,）溶解后（,5mmol/L,），用,pH,计调节,pH=8.0,；,0.5mol/L NaCl,梯度洗脱液的准备：上样前，量取,250mL,加入,NaCl,（分子量为,58.44,）,7.31g,（,0.5mol/L,）。,分组情况,每班次安排,6,组，,1,批完成；,上课前一天，溶解粗酶粉（具体后详述）；,晚上,22,：,30,左右上完样（,15ml,左右），用,0.05mol/L Tris-HCl pH8.0,缓冲液（含,5mmol/L,CaCl,2,）洗脱至基线走平（,1530,分钟）；,更换为梯度洗脱（,NaCl 00.5mol/L,），并用分部收集器定时定量收集洗脱液（,1,管,/5,分钟，,6mL,左右），收集,8,小时内有吸收峰的各管；,测定酶活力及蛋白质含量，并计算出比酶活力。,纤维素基离子交换剂的类型与特点,交换剂,名 称（纤维素）,作 用 基 团,特 点,阴离子交换剂,二乙氨基乙基,DEAE,+,O,C,2,H,4,N,+,（,C,2,H,5,）,2,H,最常用在,pH8.6,以下,三乙氨基乙基,DEAE,+,O,C,2,H,4,N,+,（,C,2,H,5,）,3,氨乙基,AE,+,O,C,2,H,4,N,+,H,3,胍乙基,强碱性、极高,pH,仍有效,阳离子交换剂,羧甲基,CM,O,CH,2,COO,最常用在,pH4,以上,磷酸,P,O,P O,2,用于低,pH,磺甲基,SM,O,CH,2,SO,3,磺乙基,SE,O,C,2,H,4,SO,3,强酸性用于极低,pH,商品,DEAE-,纤维素和,CM,纤维素的类型和特性,纤维素,形状,长度,交换当量,（毫克当量,/,克）,蛋白质吸附容量,（,mg/g,牛血清白蛋白）,床体积（,ml/g,）,pH6.0,pH7.6,DE-22,改良纤维,12400,1.00.1,450,7.7,7.7,DE-23,改良纤维（除细粒）,18400,450,8.3,9.1,DE-32,微粒型（干）,2463,660,6.0,6.7,DE-52,微粒型（湿）,2463,660,6.0,6.3,DE-11,旧型号,50250,130,与以上相应型号同,溶菌酶,pH5,CM-22,0.60.06,600,7.7,7.7,CM-23,600,9.1,9.1,CM-32,1 260,6.8,6.7,CM-52,1.00.1,1 260,6.8,6.7,DEAE-Sepharose CL-6B,是一种弱用离子交换剂，有非常好的流动性质和很高的容纳所有,pI,值蛋白质的能力，离子交换群体是二乙氨乙基，它可以保持带电状态并在整个工作范围,pH3-9,维持持续的高容量。,CL,经交联增加强度，可耐高压高温；,6B,数字表示含胶百分比，越大孔径越小,总离子容量：,0.130.17m mol/mL,胶,有效容量：甲状腺球蛋白（,TG,）,MW669.000 2mg/ml,血清白蛋白（,HAS,）,MW 68000 170 mg/ml,2-,乳清蛋白质,MW 14 300 150 mg/ml,颗粒结构：,67,交联,agarose,颗粒尺寸范围：,45165um,平均粒子尺寸：,90um,最大流速：,150 cm/h,最大操作压力：,0.015Mpa(0.15bar,2psi),pH,稳定性：长期,312,；短期,210,Sepharose CL-6B,引入基团示意图,过一段时间后，打开下部开关，使蒸馏水流出，进一步使,DEAE-Sepharose CL-6B,压紧（注意上部的蒸馏水不能干）。,再过一段时间后，关闭下部开关，接上上部转接头（旋紧不漏液），并连接到恒流泵上的硅胶软管，打开下部开关，开动恒流泵，用蒸馏水洗涤柱子（开始流速可以高一些），可以进一步压紧填料。,一段时间后，就可以使用此根装填柱子。,注意：,装柱不能有气泡、不均匀现象出现。,离心交换层析柱的再生及上样平衡处理,使用前，调节恒流泵至,1.2mL/,分钟（用蒸馏水计时收集称重调节）；,先用,0.5mol/L NaOH,洗涤再生柱子（,1,个柱体积左右）,大约,4,小时；,蒸馏水洗涤柱子至中性,大约,4,小时（泵速可以高些）；,用,0.2mol/L Tris-HCl pH8.0,缓冲液平衡至,pH8.0,（,2,个柱体积左右）,大约,4,小时；,用,0.05mol/L Tris-HCl pH8.0,缓冲液（含,5mmol/L,CaCl2,）继续平衡柱子准备上样。,注意：,每次换液时要先停泵，不要使气泡进入吸液硅胶软管口。,上样量大约,1517mL,（知道流速而以时间控制）,上样液、柱层析后收集液都需留样，分装于,2,个,eppendorf,离心管（,1.01.5mL/,管,）,，以备今后分析检测用。,上样、洗脱操作流程,0.5mol/L NaOH,再生,蒸馏水水洗,缓冲液平衡柱子,准备梯度洗脱液,启动电脑色谱软件，熟悉软件,1.2mL/mL,流速上样,12min,先停泵换液后再启动,更换缓冲液进液,10min,连接梯度洗脱器,（注意排管道内空气）,调节泵速至,0.6mL/min,，开泵,提前打开所有仪器设备电源，并进行预调节，熟悉仪器,调节紫外检测器后，打开,1,个新的洗脱色谱图,计时,3.5,分钟后，打开部分收集器,装柱平衡调整,测定恒流泵的流速并调整至,1.2mL/min,先停泵换液后再启动,先停泵换液后再启动,分别加入梯度洗脱仪中（左高右低,）,设置分部收集器（,10,管,/10min,）,等待,10,分钟，分部收集器正常转动,1,管后，离开,12,小时以后观察结果，并进行后继检测,停泵,打开电源、阀门开关，并调节搅拌转速,先停泵换液后再启动,先停泵换液后再启动,上样酶液紫外分光光度法测定蛋白质含量的稀释要求,酶溶化后稀释至,50,100,倍测定,A280,和,A260,；,代入,Lowry-Kalckar,经验公式：,蛋白质含量（,mg/mL,）,=（1.45A,280,0.74A,260,）N,上样酶液酶活力测定需要稀释倍数估算公式,柱层析后样品紫外分光光度法测定蛋白质含量的稀释要求,酶溶化后稀释至,1020,倍测定,A280,和,A260,；,代入,Lowry-Kalckar,经验公式：,蛋白质含量（,mg/mL,）,=（1.45A,280,0.74A,260,）N,柱层析后样品酶活力测定需要稀释倍数,根据上样酶液酶活力测定时所需要稀释倍数来确定（,5080%）,。,按照,DNS,方法测定。,注意,操作的可行性,操作的条件可控制,每一步操作完成后都要测定酶活力，计算出相应的提取率、提纯倍数、比酶活力。,酶蛋白纯度检测,蛋白质电泳检测,单一蛋白条带,酶蛋白生物特性研究,最适温度,最适,pH,酶的热稳定性,酶蛋白的分子量测定,多种金属离子对酶蛋白活性的影响,补充：蛋白含量的测定,凯氏定氮法,紫外分光光度计,Folin-,酚试剂法,双缩脲法,考马斯亮兰,G250,染色法,二喹啉甲酸（,BCA）,检测法,微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量,被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量（,mol,）相当于被测样品中氨的量（,mol,），根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。,因为蛋白质含氮量通常在,16%,左右，所以将凯氏定氮法测得的含氮量乘上系数,6.25,，便得到该样品的蛋白质含量。,双缩脲法（,Biuret,法）,双缩脲（,NH3CONHCONH3,）是两个分子脲经,180,左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与,CuSO4,形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。,紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为,110mg,蛋白质。,干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、,Tris,缓冲液和某些氨基酸等。,Folin-,酚试剂法（,Lowry,法）测定蛋白质浓度,蛋白质含有两个以上的肽键（,-,CO,-,NH,-,），因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与,Cu,2+,形成络合物。,Folin,酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进,Folin,试剂（磷钼酸,-,磷钨酸试剂），蛋白质,-,铜络合物能还原磷钼酸,-,磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。本法的优点是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏,10,20,倍，较双缩脲法灵敏,100,倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰。,紫外分光光度法测定蛋白质浓度,由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在,280 nm,波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（,OD,280,）,与其含量呈正比关系，可用作定量测定。,利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。,BCA,（,Bicinchoninic acid,，二辛可宁酸、二羧基二喹啉）,准确灵敏：,BCA,试剂的蛋白质测定范围是,20-2000g/ml,；,Micro BCA,试剂测定范围是,0.5-20g/ml,快速：,45,分钟内完成测定，比经典的,Lowry,法快,4,倍而且更加方便,经济实用：除试管外，测定可在微孔板中进行，大大节约样品和试剂用量,不受样品中离子型和非离子型去污剂影响,检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝,基本原理,碱性条件下，蛋白将,Cu2+,还原为,Cu+,，,Cu+,与,BCA,试剂形成紫颜色的络合物，测定其在,562nm,处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。,BCA,蛋白质检测流程,考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度,考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律，因此可以通过测定染料在,595nm,处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。,该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高（比,Lowry,法灵敏,4,倍）。,PROTEIN,+,A,max,=595nm,BLUE,Acid,Coomassie G-250,Protein-Dye,Complex,O,CH,2,CH,3,NH,C,CH,3,CH,3,N,CH,2,SO,3,-,CH,3,CH,2,N,CH,2,CH,2,CH,3,SO,3,Na,+,Coomassie Dye-Based,蛋白质定量,三、操作方法,1.,标准曲线制作,取,14,支试管，分两组按下表平行操作。,试管编号,0 1 2 3 4 5 6,标准蛋白含量,(,g)0 10 20 30 40 50 60,标准蛋白溶液,(mL)0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06,待测蛋白质溶液,(mL),蒸馏水,(mL)0.1 0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04,考马斯亮蓝试剂,(mL)2.5 mL,摇匀，,1 h,内以,0,号试管为空白对照，在,595nm,处比色,OD,595nm,以,OD,595nm,为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。,2.,未知样品蛋白质浓度的测定,测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内，根据所测定的,OD,595nm,值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度,(mg/mL),。,四,.,注意事项,（,1,）如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的,5-20 min,内测定光吸收，因为在这段时间内颜色最稳定。,（,2,）测定中，蛋白,-,染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，但此复合物的吸附量可以忽略。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。,五思考题,(1),与其它测定蛋白质浓度的方法相比，考马斯亮蓝染色法测定有何优点？,蛋白质含量测定方法介绍,常用测定方法,1.,凯氏微量定氮法,2.,紫外分光光度法,3.,双缩脲法,4.Folin,酚试剂法,(Lowry,法,),6.BCA,5.,考马氏亮蓝,-G250,紫外分光光度法,蛋白质分子中,酪氨酸和色氨酸,残基的苯环含有,共轭双键,，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在,280 nm,波长处。,在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值,(,OD,280,),与其含量呈正比关系，可用作定量测定。,2026/10/26,Biochemistry Experiments,55,紫外分光光度法,Lowry-Kalckar,经验公式,1.45 A,280,0.74 A,260,Warbury-Christian,经验公式,1.55 A,280,0.76 A,260,蛋白质浓度,（,mg/ml,）,以下经验公式是通过一系列已知不同浓度比例的蛋白质（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所测定的数据来建立的。,Waddell,经验公式,144,（,A,215,-A,225,）,