基因工程复习题.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,显性质粒 对宿主细胞产生新的遗传表型的质粒；,例如：抗抗生素的抗性质粒（R质粒），产生大肠杆菌素(colicins)的Col质粒、引起细菌接合性的育性质粒（F质粒）和致植物形成冠瘿瘤的Ti质粒等。,隐型质粒 对宿主细胞不产生任何新遗传性状的质粒。,天然DNA的来源和用途,染色体DNA：,染色体DNA是分离目的基因和基因表达调控因子的主要材料，也可提供构建染色体和染色体基因整合平台系统之用；,病毒DNA：,病毒DNA主要用于构建基因克隆载体，也能作为分离目的基因和基因表达调控因子的材料；,质粒DNA：,质粒DNA主要用于构建克隆载体，也能作为分离目的基因和基因表达调控因子的材料；,线粒体和叶绿体DNA：,线粒体和叶绿体DNA主要作为分离目的基因和基因表达调控因子的材料，也能用于构建克隆载体。,质粒（plasmid）细菌或细胞染色体以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的小型共价闭合双链环状DNA，对细菌的某些代谢活动和抗药性的表型有一定的作用。,标记基因：,是一种已知功能或已知序列的基因，能够起着特异性标记的作用，它是对目的基因进行标记的工具。,4.斑点印迹杂交和狭线印迹杂交,斑点印迹杂交（dot blotting）和狭线印迹杂交（slot blotting）是在Southern印迹杂交的基础上发展的快速检测特定核酸（DNA和RNA）分子的核酸杂交技术。使众多待测样品能够一次同步转移到杂交滤膜上，并有规律地排列成点阵或线阵。这两项技术更适应与核酸样品的定量检测。,PCR技术：,即聚合酶链式反应，又称基因的体外扩增法，是通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。,限制性核酸内切酶：,识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链，主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵,相容性末端：虽然不同种的限制性内切酶产生的DNA双链末端在大多数情况下是不同的，但有些不同种限制性内切酶产生的末端却是相同的，即具有相同类型的突出末端（都是5端或3端突出），突出的核苷酸数目相等且序列也相同，因而可以互相连接起来。这种由不同种限制酶产生的能相互连接的末端常称之为相容性末端。这种酶则称之为同尾酶。,部分酶切：指选用的限制酶对在DNA分子上的全部识别序列进行不完全的切割。主要用于构建基因组文库，在目的基因序列中存在该酶的识别序列时，通过部分酶切方法可以得到完整的目的基因片段。,TA克隆载体：用Taq酶的PCR产物3端加上了一个A。根据这一特点研制出一种线性质粒，其5端突出的T，它们之间可以连接，即TA克隆。,表达载体：是指具有宿主细胞基因表达所需的调节序列，能使克隆的基因在宿主细胞内转录和翻译的载体。,感受态细胞：细菌能从周围环境中吸收DNA的生理状态称为感受态。这种细胞称为感受态细胞。,外植体：用于基因转化的植物受体部分通常称为外植体。,基因工程药物：基因工程药物是先确定对末疾病有预防和治疗作用的蛋白质，然后将控制该蛋白合成过程的基因取出来，经过一些列的基因操作，最后将该基因放入可大量生产的受体细胞中去，在受体细胞中不断繁殖过程中，大规模生产具有预防和治疗这些疾病的蛋白质，即基因疫苗和药物。,核酸疫苗：又称DNA疫苗是一种携带外源基因的表达载体，这种外源基因编码某种病毒或病原菌的抗原蛋白质。,转基因动物：将外源重组基因转移并整合到动物受体细胞基因组中，从而形成在体内表达外源基因的动物。,基因治疗：基因治疗是指以正常的基因替代或修补病人细胞缺陷基因，从而达到治疗疾病的目的它是治疗分子疾病最有效的手段之一。,表达系统：外源基因表达系统泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中有效表达目的基因产物。,包涵体蛋白：在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密聚集在一起形成无膜的裸露结构。,星活性：限制酶在非标准反应条件下，能切割与之特异性识别顺序类似的序列，降低酶切的特异性，这种现象称之为星活性。,结构基因：负责编码细胞代谢途径中组成型蛋白质的基因。其所编码的蛋白质一般不作为调节因子。,CDNA文库：以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当载体连接后转化受体细胞，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。,启动子：DNA分子上能与RNA聚合酶结合并形成转录起始复合体的区域，在许多情况下，还包括促进这一过程的调节蛋白的结合位点。,酶单位：一个国际通用酶单位指在25C、最适条件下，1min中内能引起1umol底物发生的反应量。以U表示。,定量PCR：定量PCR技术有广义和狭义概念。广义概念的定量PCR是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的检测，进行PCR起始模板的定量。狭义概念的定量PCR技术是指用外标法通过检测PCR过程达到精确定量起始模板数的目的，同时以内对照有效排除假阴性结果。,电穿孔转化法：将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA分子就可进入细胞内。,基因枪法：基因枪法又称微弹轰击法，它是运用高速运行的金属微粒轰击细胞时能进入细胞内的现象，将包裹在金属微粒表面的外源DNA分子带入细胞的基因转化方法。,基因工程研究的技术路线是什么？,答：1.提取目的基因,基因操作的第一步就是提取目的基因，即取得人们所需用的基因。,提取目的基因主要有两条途径：一条是从供体细胞的DNA直接分离基因；另一条是人工合成基因。,2.目的基因与载体结合,将目的基因与载体结合的过程实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。,3.将目的基因导入受体细胞,用人工的方法使体外重组的DNA转移到受体细胞，主要是借鉴细菌或病毒浸染细胞的途径。,4.目的基因的检测和表达,在全部受体细胞中，真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的。重组DNA分子进入细胞后，受体细胞必须表现出特地的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。,重组DNA的含义？,答：在体外将目的基因片段插入载体上，构建重组DNA，并使之进入到原先没有这类分子的受体细胞内，而能持续稳定的增值和表达的过程。,为什么反转录酶在聚合反应中会出错？,答：反转录酶在聚合反应中出错的原因:逆转录酶又称为RNA 指导的DNA聚合酶，以mRNA为模板合成cDNA，逆转录酶有5-3的聚合酶活性，而缺少聚合酶中起校正作用的3-5的外切核酸酶活性，发生突变而使聚合反应出错。,天然DNA包括那些类型DNA？,答：天然DNA包括：染色体DNA，病毒和噬菌体DNA，质粒DNA，线粒体和叶绿体DNA,Northern印迹和Southern印迹的两个根本的区别是什么？,答：Northern印迹和Southern印迹两者的主要区别：1.印迹转移过程中转移对象不同。Nothern转移的是RNA，而Southern转移的是DNA。,2.电泳条件不同，前者是变性条件，后者是非变性条件,5、用于核酸杂交的硝酸纤维素膜和尼龙等膜固相支持物具有哪些优良特性?,答：硝酸纤维素膜具有以下优良特性：1)100纯硝酸纤维素，不含醋酸纤维素，确保最佳的蛋白结合效果；2)有0.2和0.45u两种孔径，分别针对不同大小的蛋白样品；3)不需要甲醇预润湿。,尼龙膜具有以下优良特性：1)可以耐受严谨处理，不会收缩，破碎或撕裂；2)使用定位孔精确对齐；3)使用尼龙lift tab，易于移除膜。,严禁核酸杂交试验是如何控制的?,答：杂交反应的严紧程度有下面两个因素所决定：温度和盐浓度。强的碱基对才能耐受高的温度，而高的盐浓度使弱的碱基对间的配对变得稳定。因此，高度严紧的杂交在高温和低盐浓度下进行，而低严紧型杂交在低温和高盐浓度下进行。,7、什么限制性内切酶的星号活性?受哪些因素影响？,答：限制酶在非标准反应条件下，能切割一些与之特异型识别顺序类似的序列，降低酶切的特异性，这种现象称为星号活性。,引起星号活性的因素有很多：甘油浓度高，酶过量，离子强度高，pH过高或者加入了有机溶剂，或者用其他2价阳离子如Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+代替了Mg2+。,8、Klenow酶在基因工程中有什么作用？,答：（1）补平由核苷酸内切酶产生的5粘性末端；（2）DNA片段的同位素末端标记；（3）cDNA第二链的合成；（4）双脱氧末端终止法测定DNA序列。,克隆载体应具备特点？,答：1.复制起点：因而至少可在一种生物体中自主复制。,2.克隆位点：以供外源DNA插入。,3.遗传标记基因：以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞,4.安全性：不含有害基因，不会任意传播其他宿主细胞，尤其是人细胞。,阐述减少质粒和噬菌体载体上某种酶的识别位点的方法和原理?,答：方法：将质粒或噬菌体进行体内或体外突变，使某些酶的识别位点中的某些碱基变化，从而减少酶的识别。,原理：酶都有特异的识别序列，改变后就不能被识别。,什么是质粒的相容性？什么是不相容型？,答：质粒的相容性：两个质粒在同一宿主中能共存的现象。,质粒的不相容性：两个质粒在同一宿主中不能共存的现象。,阐述Ti质粒的4个功能区？,答：A.T-DNA区：Ti 质粒进入植物细胞的只是约25kb的片段，这个片段称为T-DNA（transfer DNA);T-DNA两端各有25bp长的正向重复序列(LTS和RTS)。,B.Vir区：定位在T-DNA区上游的一组基因，它们的表达产物激 活T-DNA向细胞的转移，使植物引发肿瘤，与脓杆菌的致病性相关（virulence）。,C.Con区：与脓杆菌之间的接合转移，即含有tra基因。,D.Ori区：该区的基因能控制Ti质粒的自我DNA复制。,什么是cDNA文库？同基因组文库有何差？,答：同mRNA互补的DNA称为cDNA。cDNA文库是以某一生物的总mRNA为模板，在无细胞系统中，在反转录酶的作用下，首先合成一互补的DNA，即第一链，破坏模板后，再以第一联为模板合成第二链，得到的双链DNA称为cDNA。选用合适的载体，将合成的cDNA重组导入寄主细胞，经筛选得到的cDNA克隆群称为cDNA文库。由于cDNA技术合成的是不含内含子的功能基因，因此是克隆真核生物基因的一种通用方法。,由于细胞内的基因在表达的时间上并非是统一的，具有发育的阶段性和时间性，有些则需要特殊的环境条件。所以，cDNA文库是不可能构建的十分健全的，也就是说任何一个cDNA文库都不可能包含某一生物全部编码基因。,差别：（1）基因组文库克隆的是任何基因，包括未知功能的DNA序列；cDNA文库克隆的是具有蛋白质产物的结构基因，包括调节基因；,（2）基因组文库克隆的是全部遗传信息，不受时空影响；cDNA文库克隆的是不完全的编码DNA序列，因它受发育和调节因子的影响；,（3）基因组文库中的编码基因是真实的基因，含有内含子和外显子；而cDNA克隆的是不含内含子的基因。,建立一个基因组文库后，如何鉴定一个含有目的基因的克隆？,答：带有某一细菌基因的克隆通常可以直接看出来，因为基因表达引起了宿主细胞表型的可见变化。然而，真核生物的基因不都表达，则需要相应的方法来找出带有所需基因特定克隆。一个常用的方法是杂交：（1）从不同的克隆提取DNA，固定于硝酸纤维素滤膜上，然后用NaOH使之变性。,（2）探针必须能与所需的基因互补且被32P标记。探针可以是来自另一不同生物体的相关的基因，或是依据与基因特异相关蛋白质的氨基酸序列设计并经化学合成的一小段DNA分子。,（3）探针只会与特定基因进行碱基配对，冲洗滤膜后，未接合上的标记探针会被出去。,（4）烘干滤膜后进行放射自显影后，所需的克隆就以一个黑点在胶片上显示出来，这就是菌落或原位杂交分析。,有哪些可能的原因使一个基因在DNA文库中丢失?,答：（1）在构建文库过程中，操作不恰当，导致基因片段丢失，后者不完整；（2）酶切得到的基因片段太大了，以至于不能导入受体细胞；（3）在目的基因中存在酶切位点，在酶切后基因被打断以致找不到了；（4）目的基因离酶切位点太远切割的到的片段太大，不能被有效克隆。,16、选择受体细胞的一般原则？,答：(1)便于重组体分子的导入,(2)能使重组体分子稳定存在于细胞中,(3)便于重组体筛选，表达载体所含的选择性标记与受体细胞的基因型必须相配。,(4)遗传稳定性高，易于培养。对于动物细胞而言，应对培养的适应性强，可以进行贴壁培养或悬浮培养，最好能在无血清的培养基中培养。,(5)安全性高，无致病性,不会对外界环境造成污染。,(6)受体细胞的蛋白酶基因缺失或蛋白酶含量低，有利于外源目的蛋白在受体细胞内表达积累。最好能使外源基因高效分泌表达。,(7)受体细胞在遗传密码子的应用上无明显的偏倚性。,(8)具有良好的蛋白质翻译后加工机制。,(9)在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。,CaCl2诱导大肠杆菌转化法的可能机制？,答：(1)在0的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离，形成感受态。,(2)Ca2+与DNA分子结合，形成抗DNase的羟基磷酸钙复合物，并粘附在细菌表面。,(3)当42热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多缝隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。,重组子筛选的营养缺陷型检测法？,答：根据目的基因在受体细胞中表达产物的性质，筛选出含目的基因的克隆子，如果目的基因产物能降解某些药物使菌株产生抗性标记，或基因产物与某些药物作用是显色反应，则可根据抗性或颜色直接筛选出含目的基因的克隆子。,前提：目的基因能在受体细胞中表达，不能表达则不能检测。,从细菌中提取基因组DNA，应采取哪些措施可获得高分子量的DNA?,答：（1）提取过程中加入核酸酶的抑制剂；（2）提取操作温和，减少机械剪切力；（3）避免高温的环境，控制一定的pH；（4）保持一定的离子浓度。,阐述提高外源蛋白表达量稳定性的措施？,答：（1）构建融合蛋白表达系统,（2）构建分泌蛋白表达系统,（3）构建包涵体表达系统,（4）选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统,用亲和层析纯化外源基因表达蛋白的原理？,答：原理是利用外源基因表达蛋白的特异性，使其与特定的抗体由于亲合力作用而结合，从而达到分离纯化的目的。,22、用IFN来治疗哪些疾病？,答：可以治疗：白血病，肝炎，癌症，AIDS,23、为什么要研究和应用转基因动物？,答：可以：提高动物的生长速度，改善畜产品的品质，用转基因动物生产药物，用转基因动物做器官移植的供体。,何理解基因工程两个特点？,答：其两个特点是分子水平上的操作和细胞水平上的表达。分子水平上的操作包括DNA分离、切割和连接（还有其他一些DNA的修饰等）。由于体外重组DNA的最终目的是要改变生物的遗传性，所以分子水平的操作和细胞水平上的表达式基因工程的两个最基本的特点。,25、简述复制子的结构和功能?,答：复制子是能够进行独立复制的一种遗传因子。每一个复制子都含有一个与特定的RNA聚合酶结合的序列和DNA复制起始位点。另外，复制子也包括一个复制的终止区。一个失去了复制起点的DNA不能独立进行复制，但是，当它和另一个复制子连接起来时，就能在后者的带动下进行复制。,阐述SangerDNA测序法测定基因测序的原理？,答：双脱氧（2，3）-核苷酸可以象2-脱氧核苷酸那样直接掺入新合成的DNA链中，但因3 端不具OH基，DNA链合成至此中断。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，故可根据不同长度的DNA片段测定出核苷酸序列。,27、用于克隆的DNA在质量上有那些要求？,答：（1）稳定性：保持DNA的高分子量和原有构型；（2）低蛋白质含量；（3）DNA样品中应不含RNA（4）不含可透析的小分子。,28、对于电泳分离DNA来说，琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶各有什么特点？,答：琼脂糖凝胶电泳分辨DNA片段的范围为0.250kb之间，用于DNA和RNA的常规分析。,聚丙烯酰胺凝胶:其分辨范围为1个碱基对到1000个碱基对之间，常用于小分子核酸和蛋白质分析。,说出4种外源DNA转化植物细胞的方法？,答：（1）脓杆菌介导的Ti质粒转化法（2)电穿孔转化法（3)花粉管通道法（4)显微注射法（5)激光微束穿孔转化法（任选四种）,30、用限制性内切核酸酶切割DNA后，经电泳检查，发现有拖尾现象，其可能的原因是什么？,答：1）蛋白与DNA的结合；2）酶混杂；3）酶切条件不适；4）有外切核酸酶污染。,31、如果已知某一基因的功能及其编码的蛋白质氨基酸序列，可以通过何种方法克隆该基因？,答：可以通过合成核苷酸探针或设计简并PCR引物从cDNA文库或基因组文库中筛选。或者利用相应的抗体从cDNA表达文库中筛选相应的克隆。,用蓝白斑筛选法区分重组子和非重组子的原理？,答：蓝白斑筛选重组子和非重组子的原理是根据载体的遗传特征筛选重组子，如-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为-互补。由-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。,放射性抗体检测法的基本原理是什么？,答：这一方法的原理是根据抗体、抗原分子的三个基本特性而设计的一种筛选鉴定重组体的方法。这三个基本特性是：（1）抗体分子可以牢固地吸附在固体基质上而不被洗脱掉；（2）一个抗原可以同几种不同的抗体结合；（3）抗体分子可以通过碘化作用被标记）。,