分子生物学在医学研究中的应用.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,分子生物学在医学研究中的应用,临床医学研究中心,分子生物学概念及研究内容,分子生物学是从分子水平上研究生物大分子的结构与功能，从而阐明生命现象本质的科学。,研究的主要内容为核酸（,DNA,，,RNA,）和蛋白质。,分子生物学的形成过程,1865,年达尔文,物种起源,：性状可遗传,1879,年弗莱明 发现了染色体,1902,年萨顿提出了染色体遗传学说并认为基因是染色体的一部分,1910,年摩根证明了基因存在于染色体上,1944,年艾弗里证实了,DNA,是构成染色体的大分子,.,1953,年,Watson,和,Crick,发现了,DNA,的双螺旋结构,.,1958,年,M,Meselson,和,F,W,Stahl,提出了,DNA,半保留复制模型,.,1965,年，霍利完成了第一个酵母丙氨酸,tRNA,的核苷酸全序列测定,.,1966,年，尼伦伯格，霍利,科拉纳共同破译了全部的遗传密码,.,1972,年，博伊等人发展了重组,DNA,技术,1975,年，,Sanger,等人发明了快速的,DNA,序列测定技术,.,医学的概念及主要任务,医学是生命科学的重要组成部分，是在人类祖先自我防护本能的基础上，通过长期的劳动实践和抗病害斗争而形成和发展起来的一门科学。,医学的主要任务是防治疾病、保障健康和延年益寿。,现代医学不是单单研究一个个事物，一个个现象，而是研究事物、现象的变化发展过程，研究事物相互之间的关系。由“整理材料”的科学，发展成为严密综合起来的体系。,20,世纪医学的特点是：一方面向微观发展,-,分子医学；一方面又向宏观发展,-,系统医学。,基因克隆、扩增、测序为基础的分子生物学技术已广泛应用于基础医学，以及疾病的发病机理、诊断及治疗。,PCR,技术的出现使人们能在体外快速大量的扩增目的,DNA,，并将此技术应用于病原微生物及特点基因的诊断,基因诊断。,遗传突变致病基因的发现为阐明遗传病的发病机理提供了条件，并为基因治疗提供了靶点及方向。,后面的同学，掌声在哪里,分子生物学在医学研究中的应用,PCR,及基因突变检测技术,基因敲除,(Knock out),及替换,(Knock in),技术,遗传病相关基因的研究,人类基因组计划,基因芯片技术,转基因动物技术,动物克隆技术,从鼠源性到人源性抗体,利用酵母菌双杂合系统确定相互作用的蛋白质,一,.PCR,及基因突变检测技术,聚合酶链式反应,(Polymerase Chain Reaction),简称,PCR,。,PCR,是体外酶促合成特异,DNA,片段的一种方法，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病与病原体微生物的诊断等。,由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的,DNA,得以迅速扩增。,基因突变（,gene mutation,）是由于,DNA,分子中发生碱基对的增添、缺失或改变，而引起的基因结构的改变。基因突变包括插人、缺失及替换几种类型。,某些基因突变会导致编码蛋白质结构异常并最终致病。,异常血红蛋白病,(abnormal hemoglobin),：由于珠蛋白基因突变，导致合成的珠蛋白肽链的结构和功能异常导致的疾病。,异常血红蛋白病发病机制：单个碱基替换、移码突变、整码突变、融合基因、终止密码突变、无义突变。,镰状细胞贫血,Beta chain,6,Glu,Val,AT,基因突变的检测对遗传相关疾病的检测及发病机理研究非常重要。,随机扩增长度多态性,(AFLP),分析,单链构象多态性,(SSCP),分析,1,4,、,7,9,：野生型基因片段；,5,、,6,：两例,Val384Asp,携带者的样本，显示变异的,SSCP,带型,二,.,基因敲除及替换技术,生物体内有些基因发生突变，其功能可被其它成份替换而不导致重要生理功能异常该生物体能够存活或发育，而有些基因突变时可导致严重的生理功能异常使生物体死亡。,通过将目的基因从染色体中去除或破坏而观察该基因的生理作用称为基因敲除,(Knock-out),；通过将目的基因插入染色体中而观察该基因的作用称为基因替换（,Knock-in,）。,基因敲除基本步骤,先将有选择性标记基因,(,通常为,neor,基因,),克隆到基因载体上，载体上含有与胚胎干细胞基因组中目标位点同源的序列。将上述载体转染,Es,细胞基因后通过,G418,筛选同源重组后的,Es,细胞，将筛选出的,Es,细胞再用含有突变基因的载体转染，通过同源重组使突变基因置换选择基因，再筛选出含有突变基因的,Es,细胞。,基因替换,将含选择性基因与含有突变的目的基因一起克隆到酵母菌质粒载体上，经扩增后，将上述基因从载体上用合适的酶切下来或与质粒一起转化酵母菌二倍体，含有选择基因的突变目的基因将通过同源重组或整合到酵母菌的染色体中，通过细胞分裂及选择性培养可获得含有基因突变的细胞株。可通过上述类似的方法将目的基因置换或融合到人酵母菌的染色体中。,基因敲除技术的应用,1.,基因敲除可用于建立人类疾病的转基因动物模型，为医学研究提供材料。,1992,年成功建立了囊性纤维化病,(CF),的致病基因,(CFTR),基因敲除的,CF,小鼠模型，为,CF,基因治疗提供了很好的动物模型，得以顺利通过了基因治疗的动物试验，于,1993,年开始临床试验并获得成功。,2.,基因敲除可用于异种器官移植。通过将引起排斥反应的基因敲除，为动物成为人体器官的有效供体提供了可能。,3.,基因敲除可用于治疗遗传病等，包括去除多余基因或修饰改造原有异常基因以达到治疗目的。,4.,基因敲除技术可用于免疫学。同异源器官移植相似，如果将动物免疫分子基因敲除，换以人的相应基因，将产生人的抗体，从而解决人源抗体的生产问题。,5.,基因敲除技术还可用于改造生物，培育新的生物品种。,三,.,遗传病相关基因的研究,随着分子生物学、遗传学的发展，越来越多的与疾病有关的基因被克隆分离出来。,与遗传相关性疾病可分为单基因遗传病与多基因遗传病。前者指疾病的发生是由一个特定基因突变所致，后者指多种基因突变才能导致疾病和发生。,目前克隆并分离出最多的是单基因遗传病。而绝大多数常见的对人类危害极大的多基因遗传病基因的定位与克隆则成为当前医学遗传分子生物学研究的重点与难点课题之一。,在遗传病相关基因定位领域常用的方法有受孕同胞对法,(ASP,法,),，受孕家系成员法,(APN,法,),，连锁分析法与连锁不平衡分析法等。,连锁分析与连锁不平衡分析这两大基本原理是所有这些方法的基础。,连锁分析的基本原理,在家系中，位于同一条染色体上的两个位点,(,致病基因与遗传标记,),在减数分裂的过程中会发生交换与重组。重组率越高，两个位点在一起传给后代的机会就越少，通过对覆盖密度适当的遗传图中遗传标记物,(marker),在家系中进行分型,(genotyping),，以此找到与致病基因紧密连锁的某一标记物，从而确定该基因在染色体上的粗略位置。,在此基础上再在该染色体区域使用覆盖程度更高的标物作深入的连锁分析就可将致病基因确定在较少的区域，这样再利用物理图提供的该区域的染色体片段将基因确定或克隆。,连锁不平衡分析的原理,来自同一祖先的致病突变基因，在经历多代减数分裂后与致病基因连锁的标记基因多次重组而逐渐与致病基因间趋于平衡，离致病基因越远的标记，二者趋于平衡的趋势越大，离致病基因越近的标记，由于重组率低与疾病就处于不平衡即紧密连锁的状态。,这样在该基因发生突变后，它与其周围标记构成的单体型,(haplotype),就会逐渐被新的单体型所取代，保持不变的单体型就越来越短。利用这种原理，只要建立该疾病群体中患者与亲代的单体型，根据整个单体型的改变就可以找到与致病基因有关紧密连锁的标记物，从而将该基因定位。,四,.,人类基因组计划,人类基因组计划,(,Human Genome Project,HGP,）是一项规模宏大，跨国跨学科的科学探索工程。其宗旨在于测定组成人类染色体（指单倍体）中所包含的,30,亿个碱基对组成的核苷酸序列，从而绘制人类基因组图谱，并且辨识其载有的基因及其序列，达到破译人类遗传信息的最终目的。测序方法：分级霰弹枪测序法,人类基因组图谱,人类,22,号染色体,基因组计划是人类为了探索自身的奥秘所迈出的重要一步，是人类科学史上的又一项伟大工程。截止到,2005,年，人类基因组计划的测序工作已经基本完成（,92%,）。今天，人类,DNA,序列已经存储在数据库中，任何人都可以通过互联网下载。美国国家生物技术信息中心和位于欧洲和日本的相关组织储存着整个基因序列，其中包含已知序列，假设基因和蛋白质。,塞雷拉人类基因组计划,塞雷拉人类基因组计划，在国际人类基因组计划启动八年后的,1998,年，美国科学家克莱格,凡特创办了一家名为塞雷拉基因组（,Celera Genomics,）的私立公司，开展独立的人类基因组计划。因为塞雷拉基因组的竞争促使国际人类基因组计划不得不改进其策略，进一步加速其工作进程，使得人类基因组计划得以提前完成。,测序方法：霰弹枪测序法（鸟枪法）,人类基因组计划的应用,破译人类遗传信息，将对生物学，医学，乃至整个生命科学产生无法估量的深远影响。目前基因组信息的注释工作仍然处于初级阶段。随着将来对基因组的理解更加深入，新的知识会使医学和生物技术领域发展更为迅速。,人类基因组计划为疾病的基因诊断和基因治疗奠定了基础，推动了亨廷顿舞蹈病、遗传性结肠癌和乳腺癌等一大批单基因遗传病致病基因的发现。目前对于心血管疾病、肿瘤、糖尿病、神经精神类疾病（老年性痴呆、精神分裂症）、自身免疫性疾病等多基因疾病是目前疾病基因研究的重点。,事实上，在人类基因组计划完成之前，它的潜在使用价值就已经表现出来。大量的企业，例如巨数遗传公司（,Myriad Genetics,）开始提供价格适宜，而且容易使用的基因测试，其声称可以预测包括乳腺癌、凝血、纤维性囊肿、肝脏疾病在内的多种疾病。,人类基因组计划对许多生物学研究领域有切实的帮助。例如，当科研人员研究一种癌症时，通过人类基因组计划所提供的信息，可能会找到某个或某些相关基因。,如果在互联网上访问由人类基因组信息而建立的各种数据库，可以查询到其他科学家相关的文章，包括基因的,DNA,、,cDNA,碱基顺序，蛋白质立体结构、功能，多态性，以及和人类其他基因之间的关系。也可找到和小鼠、酵母、果蝇等对应基因的进化关系，可能存在的突变及相关的信号传导机制等。,分析不同物种的,DNA,序列的相似性会给生物进化和演变的研究提供更广阔的路径。事实上，人类基因组计划提供的数据揭示了许多重要的生物进化史上的里程碑事件。如核糖体的出现，器官的产生，胚胎的发育，脊柱和免疫系统等都和,DNA,载有的遗传信息有密切关系。,五,.,基因芯片技术,生命的遗传信息贮存于,DNA,碱基序列中，人类基因组计划已得到人类,3 x 10,9,bP,全序列。这些,DNA,序列的生物学意义是什么，在疾病状态下这些,DNA,序列会出现什么样的变化都是非常重要的研究课题，,DNA,芯片技术的出现为解决上述问题提供了方法。,基因芯片技术的基本原理,根据,DNA,碱基互补特异结合原则，利用,DNA,探针的特异性、灵敏性，通过将特定的,DNA,序列按特异顺序固化在一载体，如玻璃或三维孔板内，然后用标记的,DNA,探针或标记的,DNA,样品进行反应，通过分析特异结合作用的图谱而判断其生物学意义。,基因芯片的测序原理,基因芯片技术中的关键组成部分包括微电子蚀刻技术、微液分配技术、,DNA,固定及原位合成技术、高灵敏度探测技术、快速数据获取、存贮及处理技术。,DNA,芯片技术有两个发展趋势：,一种是以,Affymetrix,公司为代表的向高密度发展，已推出,HIV,芯片，乳腺癌芯片和,P53,芯片。,另一种是以,Nanogen,公司为代表的低密度集成的趋势，具有,便携,、,灵活、速度快、成本低,的特点。,基因芯片技术基本流程,(1)DNA,芯片的制备。将目的基因利用原位合成或蚀刻技术固相于一载体上如玻璃片等，使一很小的固相载体上含有足量的基因，并可大量制备完全相同的,DNA,芯片。,(2),将标记的,DNA,探针,与基因芯片上的,DNA,序列相结合。组织中或微生物中的,DNA,经纯化后用萤光或同位素标记，然后与,DNA,芯片上的,DNA,片段相,结合,，经洗涤等处理去除非特异结合部分而保留特异,结合,。,(3),用计算机对阳性杂交斑点进行统计分析，总结出生物学意义,。,微阵列实验结果,基因芯片技术在医学上的应用,疾病的诊断,可以同时检测多种疾病，有利于医生综合,的,了解各个系统的疾病状况,。,如癌症的早期诊断,；,与遗传有关疾病的基因诊断,，,如应用于产前遗传性疾病检查，抽取少许羊水就可以检测出,胎儿,是否患有遗传性疾病,。,病原微生物的检测,医生在短时间内就能知道病人是哪种病原微生物感染,，,而且能测定病原体是否产生耐药性、对哪种,抗生素,产生耐药性、对哪种抗生素敏感等等，这样医生就能有的放矢地制定科学的治疗方案,。,新药的设计、筛选与开发,由于所有药物都是直接或间接地通过修饰改变人类（或相关动物）基因的表达及表达产物的功能而生效，芯片技术具有高通量、大规模、平行性地分析基因表达或蛋白质状况的能力，在药物筛选方面具有巨大的优势。用芯片作大规模的筛选研究可以省略大量的动物试验甚至临床，缩短药物筛选所用时间，提高效率，降低风险。,六,.,转基,因,动物技术,转基因动物是指基因组中整合有外源基因的一类动物。,只有部分组织细胞的基因组中整合有外源基因动物称为嵌合体动物,。,只有当外源基因整合入生殖细胞时，才能将其携带的外源基因遗传给子代，否则外源基因将不能传给子代。,动物所有的细胞均整合有外源基因，则具有将外源基因遗传给子代的能力，通常把这类动物称为转基因动物,转基因动物技术包括显徽注射法，逆转录病毒法，胚胎干细胞法，精子载体法等。,目前转基因鱼、鼠、兔、猪、羊及牛均已制备成功。,蜘蛛羊,抗癌老鼠,转基因动物,技术,的基本原理是将改建后的目的基因，用显微注射等方法注人实验动物的受精卵,(,或着床前胚胎细胞,),，然后将此受精卵,(,或着床前胚胎细胞,),再植,入,受体动物的输卵管或子宫中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物，人们可通过分析转基因和动物表型的关系，从而揭示外源基因的功能，也可以通过外源基因培育品种优良的工程动物等。,转基因动物技术,的应用,(1),基因组或阶段特异表达的研究,(2),通过研究转入外源基因后的新型可以发现基因的新功能,(3),导,入,外源基因后，由于基因的随机插人,，,可能会导致内源基因的突变，这些突变表型的分析，可以发现新的基因,(4),可用于只在胚胎期才表达的基因的结构和功能的研究,(5),可以,建立研究外源基因表达、调控的动物模型,(6),可用于遗传性疾病的研究,(7),探讨生殖细胞的基因治疗方法或建立人类疾病的动物模型，为人类的基因治疗提供依据,(8),可用于动物新品种的培育,(9),可用于病毒性疾病的研究,(10),基因工程药物生产。在转基因动物药物生产方面的关键技术是外源目的基因在特定靶器官的特异表达。如将外源性人凝血因子基因转入牛或羊中使其在乳腺组织中特异表达，从而可从乳汁中提取出凝血因子用于疾病的治疗。,七,.,动物克隆技术,克隆译自英文“,clone,”，基础医学领域与克隆,定义有关的内容有三个,。,细胞单克隆抗体技术,：,指通过将骨髓瘤细胞,与鼠免疫细胞融合后，筛选出能产生,某,种抗,体的细胞系的技术。,基因克隆是指将目的基因获取并通过载体转,移,入,宿主细胞使其增殖表达的过程,动物克隆是不经过有性生殖过程，而是通过,核移植生产遗传结构与细胞核供体相同动物,个体的技术。,开始人们将成年动物,(,羊,),的体细胞核分离出来，移植入除去了细胞核的卵母细胞中，再放回母体子宫中,培育,成功了第一代克隆动物,。,进而人们又将体细胞中的染色体提取出来注射入去除细胞核的卵细胞中也成功地培育出了克隆动物,。,现在克隆羊、克隆牛、克隆兔等都已完成。第一代克隆羊又成功地产出了小羊，证明克隆动物与自然受孕的动物在遗传信息的传递及发育等力面完全相同。,克隆之父,伊恩,维尔穆特,克隆羊多利,动物克隆技术,的应用,(1),复制濒危的动物物种，保存和传播动物物种资源，对濒危物种的繁衍有重要意义,。,如我国正在开展克隆,大,熊猫的研究,(2),培育优良畜种和生产实验动物,(3),生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法,八,.,从鼠源性到人源性抗体,鼠源性单克隆抗体已广泛应用于疾病的体外诊断中，但因其来源于鼠当在人体内应用时由于存在抗原性容易导致针对其抗体的产生，所以在长期用药时因被体内产生的抗体中和而失去作用,。,再者鼠源性抗体为异种蛋白,，,所以容易引起过敏反应。,80,年代初期开始了基因工程抗体的研究，采用基因工程技术对鼠单抗进行结构改造，构建了单链抗体,，,嵌合抗体，人源化抗体等,。,单链抗体是由抗体重、轻链的可变区基因,(VH,、,VL),之间通过一段编码连接肽基因拼接后表达形成的重组蛋白，具有分子量小易穿透组织等优点，但无,Fc,端效应功能。,嵌合抗体是在基因水平上连接小鼠抗体,V,区和人抗,C,区并在转染细胞中表达。嵌合抗体虽然已经减少了抗鼠抗体的产生，但是其整个,V,区仍然全部是鼠源性的，自然可被人体免疫系统识别而产生抗鼠抗体,。,利用基因工程技术，将人抗体可变区中互补决定簇,(CDR),序列改换成鼠源单抗,CDR,序列，构建出即保留鼠源性单抗的特异性与亲和力又减少了对人抗原性的重构型抗体，又称,CDR,移植抗体或改型抗体。,目前已构建了,30,余种针对不同抗原的,Rab,，有些已应用于临床诊治，并取得了令人满意的效果,。,如消除肿癌、延长器官移植生存期，改善类风湿关节炎，感染性疾病及免疫紊乱性疾病等,。,美国,FDA,已,批准治疗乳腺癌的人源化抗体,Herceptin,上市,。,构建人源化抗体常常达不到原先鼠单抗的亲和力。人们开始于,90,年代初利用抗体组合文库技术制备完全人源性的单克隆抗体。,利用组合抗体库技术已成功制备了抗乙肝表面抗原,(HbsAg),的,Fab,段。,九,.,利用酵母菌双杂合系统确定相互作用的蛋白质,许多生物学活动包含生物大分子之间的相互作用，如蛋白质,-,蛋白质；蛋白质,-,核酸之间的反应。经典的研究蛋白质,-,蛋白质结合的方法包括亲和层析法，受体配体结合试验，用这些方法很难得到稀有的相互作用蛋白。,90,年代以来新发展了一种从基因水平上研究蛋白质,-,蛋白质相互作用的酵母双杂交系统，为相互作用蛋白的研究提供了有效的方法。目前已用此方法发现了许多有生物学意义的相互作用蛋白质。,酵母菌双杂合系统的基本原理,许多转录活化因子都含有两个分开的结构：结合区,(Binding domain,BD),和活化区,(Active domain,AD),，结合区可与基因上游的启动区域结合，活化区负责活动下游报道基因开始转录。报道基因上游的启动区域与转录因子结合后，使下游的报道基因表现。酵母蛋白,GAL4,就是这样一个蛋白。,-,半乳糖苷酶报道基因的活化可用于检测,GAL4,下游靶基因的转录,为了方便筛选可将一个基因载体上构建亮,氨酸表达基因，以便使含两个共转染质粒的,酵母菌能在无亮氨酸的培养基上生长。,将已知蛋白的基因作为诱饵与,GAL4,的结合区域相连，再将要筛选蛋白的,cDNA,文库与,GAL4,的活化区域相连，共转染酵母菌后通过筛选可以选出有相互作用的阳性菌落，再将阳性菌落中的,DNA,质粒提取出来转染细菌扩增后可通过序列测定测出该蛋白的,DNA,序列进而推导出其氨基酸序列。,也可用此,DNA,序列为探针，从,cDNA,文库中筛选出具有全长,DNA,序列的基因，将此基因在大肠杆菌或细胞中表达后再用体外蛋白质结合后共免疫沉淀等进一步检定两个蛋白之间的相互作用,谢 谢,