第四章-生物信息的传递(下)―从mRNA到蛋白质.ppt

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解旋，以一条链为模板合成RNA,细胞核中,A,G,T,A,C,T,A,A,T,A,G,C,U,G,A,C,G,G,U,U,U,DNA,与RNA的碱基互补配对：,AU,；TA；CG；GC,RNA,聚合酶,细胞核中,A,G,T,A,C,T,A,A,T,A,G,C,G,A,C,G,G,U,U,U,U,组成,RNA,的核糖核苷酸一个个连接起来,细胞核中,A,G,T,A,C,T,A,A,T,G,C,G,A,C,G,G,U,U,U,U,A,细胞核中,A,G,T,A,C,T,A,A,T,G,C,G,A,C,G,U,U,G,U,U,A,细胞核中,A,G,T,A,C,T,A,A,T,G,C,G,A,C,G,U,G,U,U,A,A,细胞核中,A,G,T,A,C,T,A,A,T,G,C,G,A,C,G,G,U,U,A,A,U,细胞核中,A,G,T,A,C,T,A,A,T,G,C,G,A,C,G,G,U,U,A,A,U,A,细胞核中,A,G,T,A,C,T,A,A,T,G,C,G,C,G,G,U,U,A,A,U,A,U,细胞核中,A,G,T,A,C,T,A,A,T,G,G,C,G,G,U,U,A,A,U,A,U,C,细胞核中,A,G,T,A,C,T,A,A,T,G,G,C,G,G,U,U,A,A,U,A,U,C,DNA上的遗传信息就传递到mRNA上,m,RNA,DNA,细胞核中,A,G,T,A,C,T,A,A,T,U,C,A,U,G,A,U,U,A,mRNA,细胞质,细胞核,核孔,DNA,mRNA在细胞核中合成,A,G,T,A,C,T,A,A,T,U,C,A,U,G,A,U,U,A,mRNA,细胞质,细胞核,mRNA通过核孔进入细胞质,U,C,A,U,G,A,U,U,A,mRNA,蛋白质的生物合成步骤,翻译的起始,肽链的延伸,肽链的终止及释放,核糖体与mRNA结合并与氨酰-tRNA生成起始复合物,由于核糖体沿mRNA5端向3端移动，开始了从N端向C端的多肽合成，这是蛋白质合成过程中速度最快的阶段,核糖体从mRNA上解离，准备新一轮合成反应,翻 译 的 动 态 过 程,在合成的各个阶段有许多蛋白质、酶和其他生物大分子参与。参与蛋白质合成的各种组分约占细胞干重的,35%,。在真核生物中有将近,300,种生物大分子与蛋白质的生物合成有关。,蛋白质合成是一个需能反应，要有各种高能化合物的参与。细胞用来进行合成代谢的总能量的,90%,消耗在蛋白质合成过程中。,核糖体是蛋白质,合成的场所。,mRNA,是蛋白质,合成的模板。,转移,RNA(tRNA,),是模板与氨基酸之间的,接合体。,在真核生物细胞核内合成的,mRNA,，要,运送到细胞质，,才能翻译生成蛋白质。,所谓翻译是指将,mRNA,链上的核苷酸从一个特定的起始位点开始，按每,3,个核苷酸代表一个氨基酸的原则，依次,合成一条多肽链,的过程。,蛋白质合成,速度很高,。大肠杆菌只需要,5s,就能合成一条由,100,个氨基酸组成的多肽。,4.1 遗传密码三联子,贮存在DNA上的遗传信息通过mRNA传递为蛋白质。mRNA上每3个核苷酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸，这3个核苷酸,称为密码，也叫三联子密码,翻译时从起始密码子AUG,开始，沿着mRNA5 3的方向连续阅读密码子，直至终止密码子为止，生成一条具有特定序列的多肽链蛋白质,4.1.1 三联子密码及其破译,三种核苷酸代表一种氨基酸,一种核苷酸代表一种氨基酸,两种核苷酸代表一种氨基酸,4种氨基酸,4,2,16种,4,3,64种,在模板mRNA中插入或删除一个碱基，会改变该密码子以后全部氨基酸序列。,若同时对模板进行插入和删除试验，插入和删除的碱基数一样，后续密码子序列就不会变化，翻译得到的蛋白质序列就保持不变(除了发生突变的那个密码子所代表的氨基酸之外)。,如果同时删去3个核苷酸，翻译产生少一个氨基酸的蛋白质，序列不发生变化。,T4,噬菌体,r位点上两个基因,对烟草坏死卫星病毒的研究发现：,其外壳蛋白亚基由400个氨基酸组成，而相应的RNA片段长约1200个核苷酸，与假设的密码三联子体系正好相吻合,在20世纪60年代，由于体外蛋白质合成体系的建立和核酸人工合成技术的发展，科学家花了几年时间破译了遗传密码，即确定了代表每种氨基酸的具体密码,一、通用的三联体密码,DNA遗传信息,mRNA,蛋白质,遗传密码,1、,Codon 的特征,a、概念：mRNA上连续排列的三个NT序列，编码一个,AA信息的遗传单位,b、具有四大生物系统（病毒、细菌、动植物）的通用,性和保守性（Mt除外）,C、一个基因序列中，有不重叠性和无标点性,遗传密码的破译,归功于三个经典的生物化学实验：,体外翻译系统的建立,核苷酸结合技术,核酸的人工合成,体外翻译系统,尼伦伯格(.M.W.Nirenberg),ATP、GTP、AA,体外翻译系统,按一定的碱基比例来合成RNA,。,碱基比为U,:,G5,:,1，,三联体8种：UUU，UUG，UGU，GUU，GGG，GGU，GUG，UGG。,UUU,:,UGG（555）,:,（511）25,:,1,UUU,:,UUG5,:,1,根据这样的推测，在无细胞系统中以这种比例合成的mRNA产生的氨基酸的比例也应是相应的，这样可以,推测出密码子的组成,。如氨基酸测定结果：,苯丙氨酸（UUU）,:,半胱氨酸（UGU）5,:,1,苯丙氨酸（UUU）,:,缬氨酸 （GUU）5,:,1,体外翻译系统,核苷酸结合技术,实验为20组：,Ser,C14,、Leu、Lys、Arg.（20种）,Ser、Leu,C14,、Lys、Arg.,Ser、Leu、Lys,C14,、Arg.,分析留在滤膜上的核糖体中的AAtRNA和其,相应的模板,此方法未能破译全部的codon,（结合效率）,Ser,-C14,.,Leu,-C14,.,Lys,-C14,.,Gly,-C14,.,核苷酸结合技术,核苷酸结合技术,人工合成核苷酸,（作为模板，加入dNTP,据合成的多肽链的氨基酸组成，破译氨基酸的密码）,柯腊拉（H.G.Khorana）,（1922）,表,14-1,用二个或三个、四个核苷酸构造重复共聚体来确定密码子,重复顺序,可组成的三联密码,多肽的氨基酸组成,(UC)n,UCU,-CUC,Ser,-Leu,(UUC)n,(UUC),;,(UCU),;,(CUU),poly Phe,poly Ser,poly Leu,(UUAC)n,(,UUA-CUU,-,ACU,-,UAC,),Leu-Leu,-,Thr,-,Tyr,4.1.2 遗传密码的性质,1.连续性（commaless）,遗传密码的特点,编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体密码连续阅读，密码间既无间隔也无重叠。,重叠密码,非重叠,连续的,密码,不连续的密码,基因损伤引起mRNA阅读框架内的碱基发生插入或缺失，可能导致框移突变(frameshift mutation)。,由于对mRNA外显子的加工，造成mRNA与其DNA模板序列之间不匹配，使同一mRNA前体翻译出序列、功能不同的蛋白质。这种基因表达的调节方式称为mRNA编辑（mRNA editing)。,mRNA编辑,2.简并性（degeneracy）,遗传密码中，除色氨酸和甲硫氨酸仅有一个密码子外，其余氨基酸有24个或多至6个密码子为之编码。,遗传密码的简并性,密码子简并性的生物学意义：减少有害突变。,遗传密码的特异性主要取决于前两位碱基。,GCU ACU,GCC ACC,GCA ACA,GCG ACG,Ala,Thr,3.通用性（universal）,蛋白质生物合成的整套密码，从,原核生物到人类都通用。,有,少数例外，,如动物细胞的线粒体、植物细胞的叶绿体。,密码的通用性进一步证明各种生物进化自,同一祖先。,4.摆动性（wobble）,tRNA上反密码子的,第1位,碱基与mRNA密码子的,第3位,碱基配对时，可以在一定范围内变动，即并不严格遵循碱基配对规律，这一现象称为,摆动性,。,酪,5,5,3,AUG,GUU UAC ACA,酪氨酰,-,tRNA,反密码,mRNA,密码与反密码的碱基配对,摆动配对,U,在密码子与反密码子的配对中，前两对严格遵守碱基配对原则，第三对碱基有一定的自由度，可以“摆动”,为I(次黄嘌呤)时可识别3种密码子,为G或U时可以识别2种密码子,反密码子第一位为A或C时只能识别1种密码子,三中读二一般可分为三种情况：,(1)第,两个碱基形成个氢键时，可三中读二。,如,，,，,和,(3)第，两个碱基形成个氢键时,当第二个碱基为嘧啶时，可三中读二；,如,，,，,和,。,当第二个碱基为嘌呤时则不能三中读二，,如,，,，,和,X。,(2)第1,2两个碱基形成4个氢键时,不可三中读二。,如,AA,X，,，,X 和,如果有几个密码子同时编码一个氨基酸，凡是第一、二位碱基不同的密码子都对应于各自独立的tRNA。第一、二位碱基相同的密码子，则共用一种tRNA,原核生物中有3045种tRNA,真核细胞中存在50种左右tRNA,4.2 tRNA,tRNA,为每个三联密码子翻译成氨基酸提供了接合体；,为准确无误地将所需氨基酸运送到核糖体上提供了运送载体（又被称为第二遗传密码）。,各种,tRNA,形成三叶草形的二级结构。三叶草形,tRNA,分子上有,4,条根据它们的结构或已知功能命名的手臂。,4.2.1 tRNA,最小的 RNA，4S，70,80个base,1、tRNA的高级结构,1964 Holly.R.鉴定出 tRNA,phe,的二级结构为三叶草,形（77个NT）,（1）三叶草结构 （4个臂 4个环）,a、氨基酸接受臂（aa accept arm）受体臂,tRNA 的5与3-末端碱基配对形成,3 端永远为不配对的,CCA,序列,最后的A的 3 或 2-OH可以被氨酰化,b、另外是 D（DHU环 双氢脲嘧啶）环 D臂,c、含丰富的稀有碱基（约70余种,碱基 核糖残基,）,反密码子 3 端邻近部位.,反密码子环 反密码子臂(anticodon arm),附加臂（extra arm）T,C环 TC臂,其中 附加臂通常是可变的,稀有碱基出现的频率高，对于维持反密码环的稳定性、密码子和反密码子之间的配对很重要,T,C环,附加环,反密码子环,DHU环,aa接受臂,（2）“L”形三级结构,-anti-codon arm 位于”L”另一端，与结合在核糖体,小亚基上的 codon of mRNA配对,b、“L”结构域的功能,-aa accept arm 位于“L”的一端，契合于核糖体的肽基,转移酶结合位点 P A,以利肽键的形成,a、“L”构型的结构力,二级结构中的碱基堆积力和氢键,二级结构中未配对碱基形成的氢键,氢键维持了“L”型的结构,-T,C loop&DHU loop,位于“L”两臂的交界处，,利于“L”结构的稳定,反密码子臂,AA受体臂,TC臂,D,臂,-“L”结构中碱基堆积力大,使其拓扑结构趋于稳定,wobble base,位于“L”结构末端,堆积力小,自由度大,使碱基配对摇摆,2、tRNA 的种类,（2）同工tRNA（isoaccepting tRNAs）,（1）起始tRNA和延伸tRNA,起始tRNA:,Prok中，携带甲酰甲硫氨酸（fMet）,Euk中，携带甲硫氨酸（Met）,延伸tRNA：其他tRNA.,携带AA相同而反密码子不同的一组tRNA,不同的反密码子识别AA的同义密码,结构上能被AA tRNA合成酶识别的共性,(3)校正tRNA,无义抑制也会造成对正常终止密码子的通读，产生比野生型长的蛋白质,错义抑制tRNA 要和正常的tRNA去竞争，因此成功率50,3、副密码子与氨酰基tRNA的合成,（1）氨酰基tRNA的合成执行着双重功能,为肽建的合成提供能量,执行遗传信息的解读,（2）AA tRNA合成酶（AARS）,需要三种底物 AA tRNA ATP,氨酰基与tRNA的 3端A的 2/3OH结合,AA tRNA+AMP+ppi,AARS,因此有三个位点,aa binding site,tRNA binding site,ATP site,反应为,AA+tRNA+ATP,Prok中AARS有20种，对AA专一（同工受体）,Prok和Euk有一定的差别,可分为两类,反应机制的差别：,Type,类酶,先将氨酰基转移到,tRNA 3 端A的 2-OH,然后通过转酯反应转移到 3 OH上,Type,类,酶 直接将氨酰基转移至 3 OH 上,两类酶与tRNA反应时接近模式不同,合成酶与tRNA相互束缚的普通模型提出：,蛋白沿L型分子的一侧束缚tRNA（tRNA的两端被束缚）,1型与tRNA的D-环结合，识别其受体臂的小沟,2型在另一侧结合，识别可变环和受体臂的大沟,（3）Paracodon,(副密码子)的概念；,tRNA中决定负载特定氨基酸的空间密码,AARS,tRNA binding site aa binding site,Paracodon of tRNA 装载 Amino Acid（R）,tRNA中的特定序列与AARS 的tRNA binding site的特异基团间的分子契合,a,、,1988.Schimmel 和侯雅明,G3:U70,是决定tRNA 负,载,Ala,的特异密码信息,b、,1991.,schumman L.,证明；tRNA,met,f,的paracodon 位于anti-codon,c、,paracodon,的特征,-为同一种AARS 所识别的一组同功受体具有相同的,副密码子,-,paracodon,是为AARS（特定氨基酸）所识别的若干,碱基（并非均为一对核苷酸）,-AARS 对,paracodon,的识别与结合是通过氨基酸与,碱基之间的连接实现的。属于生物,II 型空间密码,tRNA,Ala,(GGC),tRNA,Ala,(UGC),具有,G3：U70,paracodon,d、按氨基酸序列将AARS分为两类,type I,包括,Val,Arg,Gln,Glu,Ile,Leu,Met,Trp,Tyr,paracodon 大多位于反密码子臂,type II,paracodon 大多位于氨基酸接受臂,个别还同时在附加臂上有相应碱基,4.2.2 tRNA的功能,转录：DNA,RNA；结构上相似；碱基配对；一对一,翻译：mRNA,蛋白质；结构极不相同；复杂,功能一：tRNA的解码机制完成翻译,AA,AA tRNA,mRNA-核糖体复合物,AAtRNA合成酶,ATP,密码子与反密码子识别配对,功能二：tRNA是AA与mRNA的接合体,4.3 核糖体,执行蛋白质合成的功能。,由几十种蛋白质和几种核糖体RNA（rRNA)组成的亚细胞颗粒。,一个细菌细胞内约有20000个核糖体，真核细胞内可达10,6,个。,AA tRNA进入核糖体和退出核糖体进行新一轮循环,核糖体,AA tRNA,与mRNA模板和延伸中的肽链相互作用,迅速,起始或延伸因子作用,卸去所载氨基酸,tRNA退出核糖体,新一轮反应,4.3.1 核糖体及rRNA的结构,Euk中大多与细胞骨架和内质网膜结合在一起,(游离、多聚),是翻译进行的场所，含大小亚基,Prok.protein 约占细胞的10，RNA占总RNA的,80，Euk中相对比例小些,细菌中常以多聚核糖体的形式,1、核糖体的结构,(2)核糖体的装配,（1）,Prok E.coli,小亚基 16SRNA 21种proteins S1-S21,大亚基 23SRNA 5SRNA 34种proteins L1-L34,Euk,大亚基 28SRNA 5SRNA 5.8SRNA 49种proteins,小亚基 18SRNA 33种proteins,核糖体蛋白质rRNA,按一定的顺序形成完整的核糖体,按一定顺序结合,rRNAs是亚基中的骨架,蛋白质和rRNA必须形成完整的核糖体结构才能发挥各自的功能,除去Mg,2+,添加Mg,2+,2、核糖体的活性位点,30S小亚基,头部 基底部 中间有一,豁口,50S大亚基,三个,突起,头部,基底部,小亚基,大亚基,前缘,脊背,中央隆起,背部,柄,脊背,核糖体蛋白,大肠杆菌核糖体小亚基由21种r-蛋白组成，用S,1.,S,21,表示，大亚基由36（34）种r-蛋白组成，分别用L,1,L,36,表示，真核生物中，大亚基含有49种r-蛋白，小亚基由33种r-蛋白组成。,根据功能将核糖体上的活性部位分为两类,翻译区域 7个活性位点 占2/3,逐出位点 2个位点（多肽的逐出）占1/3,(1)mRNA结合位点,a、位于30S 亚基的头部,b、S1（可防止mRNA 链内碱基对的形成）,（与S18和S21,结合,mRNA、起始tRNA、,IF3,）,核糖体的功能部位,c、16S rRNA 3端是mRNA 与小亚基初始结合不可,缺少的,（2）P位点：肽酰tRNA位点,a、大部分在小亚基内，小部分在大亚基内,16SrRNA的3 末端、L2等蛋白,b、能够与起始 tRNA（fMet-tRNA,fMet,）相结合，,且P位点会影响A位点的活性,（3）A位点：氨酰基 tRNA 位点,a、主要在大亚基上,b、A位点内mRNA 表面只对特定的 AAtRNA 分子,表现出特异性，,且A位点结合aatRNA 要求在P,位点上必须有肽酰tRNA存在,（4）肽基转移酶活性位点,活性中心在大亚基上，位于P位点和A位点的连接处,靠近 tRNA的接受臂,（5）5s rRNA位点,（与tRNA进入有关）,（6）EFTu位点,位于大亚基内，与氨酰基 tRNA的结合有关,（7）EFG 转位因子结合位点,大亚基靠近小亚基的界面处,（8）E 位点,（包括两个：脱酰基tRNA和,多肽的逐出位点,）,E1为脱酰基tRNA 离开核糖体提供出口,E1对蛋白质合成的准确性起重要作用,E2为多肽离开核糖体提供出口（占核糖体13）,延伸因子的结合位点,Peptidyl transferase,EF-Tu site,E2 位点,膜,fMet-tRNA,met,f,(Met-tRNA,met,i,)way in P site,脱酰基tRNA转移至E位点使A位点出现有利于新的氨酰tRNA结合的构象（空间结构改变）；当新的氨酰tRNA与A位点结合后，使E位点结构改变，脱酰基-tRNA脱离E位点,4.3.2 rRNA,5S rRNA,细菌5S rRNA含有120或116个核苷酸,5S rRNA有两个高度保守的区域,其中一个区域含有保守序列CGAAC，这是与tRNA分子TC环上的GTCG序列相互作用的部位，,是5S rRNA与tRNA相互识别的序列,另一个区域含有保守序列GCGCCGAAUGGUAGU，与23S rRNA中的一段序列互补，,这是5S rRNA与50S核糖体大亚基相互作用的位点,16S rRNA,长度在1475-1544个核苷酸之间，含有少量修饰碱基。该分子全部压缩在30S小亚基内,3端一段ACCUCCUUA的保守序列，与mRNA5端翻译起始区富含嘌呤的序列互补,靠近3端处还有一段与23SrRNA互补的序列，在30S与50S亚基的结合中起作用,23S rRNA,包括2904个核苷酸,在大肠杆菌23S rRNA第19842001核苷酸之间，存在一段能与tRNA,Met,序列互补的片段，表明,核糖体大亚基23S rRNA与tRNA,Met,的结合有关,靠近5端(143-157位核苷酸之间)有一段12个核苷酸的序列与5S rRNA上第72-83位核苷酸互补，,表明在50S大亚基上这两种RNA之间可能存在相互作用。核糖体50S大亚基上约有20种蛋白质能不同程度地与23S rRNA相结合,5.8S rRNA,长度为160个核苷酸，含修饰碱基。真核生物大亚基特有,含有保守序列CGAAC（原核5SrRNA），可能是与tRNA作用的识别序列,人类基因组中18S和5.8SrRNA基因的数量大大低于原来的估计,18S rRNA,酵母18S rRNA由1789个核苷酸组成,3端与大肠杆菌16S rRNA有广泛的同源性其中酵母18S rRNA、大肠杆菌16S rRNA和人线粒体12S rRNA在3端有50个核苷酸序列相同,位于真核生物小亚基内，与原核16SrRNA类似,28S rRNA,长度约在38904500bp左右，具体功能不清,综上，rRNA之间以及rRNA与tRNA及mRNA之间存在有机的联系，这种关系是建立在序列互补或同源的基础之上的,4.3.3 核糖体的功能,核糖体存在于每个进行蛋白质合成的细胞中。尽管在不同生物体内其,大小有别,，,但,组织结构基本相同，,而且,执行的功能完全相同。,核糖体小亚基功能,对模板mRNA进行序列特异性识别,提供mRNA的结合位点,大肠杆菌中与翻译真实性有关的蛋白质S4及S12 也属小亚基,核糖体大亚基功能,负责携带AA及tRNA,肽键的形成,AA-tRNA、肽基-tRNA的结合,A位、P位、转肽酶中心等在大亚基上,核糖体,游离大小亚基,70S/80S的颗粒,翻译起始,翻译进程,肽链释放,核糖体（70S）,游离大小亚基,70S/80S的颗粒,Mg,2,10,-3,mol/L,Mg,2,10,-2,mol/L,大肠杆菌体外反应体系,4.4 蛋白质合成的生物学机制,蛋白质是生物活性物质中最重要的大分子组分，生物有机体的遗传学特性要,通过蛋白质,来得到表达。,蛋白质的生物合成包括,氨基酸活化、肽链的起始、伸长、终止以及新合成多肽链的折叠和加工，,现将各阶段的必需成分列于下表。,4.4.1,氨基酸的活化,第一步反应,第二步反应,AA+tRNA,AA-tRNA,ATP,AMP,PPi,氨酰-tRNA合成酶,Mg,2+,AA-AMP-E tRNA AA-tRNAAMP E,AA ATP,E AA-AMP-E AMP PPi,第一步反应,AA ATP,E AA-AMP-E AMP PPi,第二步反应,AA-AMP-E tRNA,AA-tRNAAMP E,Type 类酶 先将氨酰基转移到 tRNA 3 端A的 2-OH,然后通过转酯反应转移到 3 OH上,Type 类酶 直接将氨酰基转移至 3 OH 上,高度特异性（活化位点）,对氨基酸有极高的专一性,对tRNA具有极高专一性,反密码子,第二套遗传密码系统,校对作用（水解位点）,只作用于L-氨基酸,tRNA,氨基酰-,tRNA,合成酶,ATP,氨基酰tRNA合成酶(amino acyl-tRNA synthetase，aaRS),存在于所有的生物体，定位于胞液中,与特异氨基酸的活化以及,氨基酰tRNA的合成有关,Ile H COOH,CH,3,CH,2,CCH,CH,3,NH,2,Val H COOH,CH,3,CCH,CH,3,NH,2,Ile-RS,In vitro,200X,1X,Val-tRNA,Ile,错误负载机率,1/200,!,In vivo,Val:Ile=5:1,但实际测定的错译机率,仅为1/12000?!,Val-tRNA,Ile,错误,负载机率 1/40!,Val:Ile=1:1,（异亮氨酸）,（缬氨酸）,I,V,B,H,ValAMP,B,H,B,H,aa-tRNA loading,B,H,V,I,Ile 分子构型大于Val,Val进入B 位点并进入H 位点而被降解,Ile进入B 位点但不能进入H 位点,B，结合位点,H，水解位点,AA-tRNA的表示方法：,Ala-tRNA,Ala,Ser-tRNA,Ser,Met-tRNA,Met,起始肽链合成的AA-tRNA,真核生物：Met-tRNA,i,Met,原核生物：fMet-tRNA,f,fMet,蛋白质合成起始需要：,核糖体大、小亚基,起始tRNA,几十个蛋白质因子,ATP、Mg,2+,参与翻译的蛋白质因子,阶段原核 真核 功 能,起始,IF1,IF2,e,IF2 参与起始复合物的形成,IF3,e,IF3、,e,IF4C,CBP I 与mRNA帽子结合,e,IF4A B F 参与寻找第一个AUG,e,IF5,协助eIF2、eIF3、eIF4C的释放,e,IF6,协助60S亚基从无活性的核糖体上解离,延长,EF-Tu,e,EF1,协助氨酰-tRNA进入核糖体,EF-Ts,e,EF1,帮助EF-Tu、eEF1,周转,EF-G,e,EF2 移位因子,终止 RF-1,e,RF 释放完整的肽链,RF-2,因子前加“,e,”表示真核生物(eukaryotic),原核生物起始复合物形成：,30S,+,mRNA,=,mRNA,30S,+,fMet-tRNA,i,fMet,=,mRNA,30S,fMet-tRNA,i,fMet,+,50S,=,mRNA,30S,fMet-tRNA,i,fMet,50S,真核生物起始复合物形成：,40S,+,=,mRNA,40S,+,Met-tRNA,i,Met,=,mRNA,40S,Met-tRNA,i,Met,+,60S,=,mRNA,40S,Met-tRNA,i,Met,60S,Met-tRNA,i,Met,起始复合物的生成需要：,GTP提供能量,Mg,2+,、NH,4,+,3个起始因子（IF-1、,IF-2,、,IF-3,）,与30S小亚基结合松散，用1mol/LNH,4,Cl可解离,4.4.2 翻译的起始,细菌中翻译的起始需要如下7种成分:,30S小亚基，,模板mRNA，,fMet-tRNA,fMet,，,3个翻译起始因子(IF-l、IF-2和IF-3)，,GTP，,50S大亚基，,Mg,2,。,翻译起始又可被分成3步。,核蛋白体大小亚基分离,IF-3,IF-1,核蛋白体大小亚基分离,mRNA在小亚基定位结合,S-D,起始氨基酰tRNA结合到小亚基,S-D,核蛋白体大亚基结合形成起始复合物,IF-2,GDP,PPi,IF-3,IF-1,真核生物翻译起始复合物形成,60S,40S,eIF-2B,eIF-3,eIF-6,60S,40S,eIF-3,Met,40S,Met,40S,Met,40S,Met,mRNA,eIF-5,Met-tRNAi,Met,eIF-2GTP,ATP,ADP+Pi,eIF4E,eIF4G,eIF4B,eIF4A,PAB,各种eIF释放,ADP+Pi,1、起始 tRNA 与起始密码子的识别,（1）细菌,tRNA,Met,f,能识别 AUG、GUG,tRNA,Met,f,Met.fMet-tRNA,f,转甲酰酶,tRNA,Met,m,识别内部的AUG，内部GUG由tRNA,Val,m,识别,（2）Euk 中,tRNA,Met,i,tRNA,Met,m,tRNA,fMet,f,接受臂的两个碱基均为不配对状态,（3）线粒体中 Met甲酰化,（4）tRNA,fMet,f,和tRNA,Met,m,结构上存在差异,tRNA,fMet,f,.T,C,A,，而tRNA,Met,m,.T,C,G,反密码子的3端临位,tRNA,fMet,f,A tRNA,Met,m,烷基化的A,起始 tRNA 的结构,G-C,G,烷基化的A,2、起始复合物的生成,（1）,起始因子,及 30S 亚基与mRNA的结合,Prok.的三种起始因子（initiation factor IF）,参与蛋白质合成起始的可溶性蛋白因子辅助,起始复合物：核糖体、mRNA、aa-tRNA三元复合物,三种IF分别为：IF1 IF2 IF3,IF1-加强IF2、IF3的酶活,IF2-促使 fMet-tRNA,Met,f,选择性的结合在,30S亚基上,30S-IF3,+mRNA,30S+IF3+mRNA,（30S复合物）,IF3-促使 30S亚基结合于 mRNA 起始部位，阻,止30S亚基与50S亚基的结合，或者说促进,70S核糖体的解离,a、30S亚基与 mRNA 的结合,IF3,+30S,IF3赋予30S 亚基与mRNA 结合的能力,（30S亚基没有与mRNA主动结合的能力）,SD序列控制起始复合物形成的频率翻译产物数量,IF3 使30S 亚基不能与50S亚基结合（形状.）,30S 亚基与mRNA 的结合,SD与16S rRNA的 3 端,30S 复合物中，起始 codon 正好位于P位点，且只有,fMettRNA,fMet,f,才能进入,(2)起始 tRNA 的结合,IF2,+fMet-tRNA,f,IF2-fMet-tRNA,f,30S-IF3-mRNA,30S-IF3-mRNA-IF2-fMet-tRNA,f,-GTP,GTP,IF2与起始 tRNA 之间作用严格专一,很强的GTP酶活性,（3）70S 起始复合物的形成,a、,IF3游离,30S-,IF3,-mRNA-IF2-fMet-tRNA,f,-GTP,与50S亚基的结合导致,（IF3与50S亚基的竞争）,b、,70S 起始复合物形成,50S亚基的结合激活IF2 的GTP酶活性，水解,GTP并解离下来（IF1）,GTP水解释放的能量改变两者的构象,IF辅助因子,形成,30S-mRNA-fMet-tRNA-50S,IF2-fMet-tRNA,f,结合上来,c、Met的甲酰基的除去.合成到1530个AA,3、Euk 蛋白质合成的起始,（1）机制与Prok.基本相同，差异主要是所涉及的因素,本身的差异所导致,去甲酰基酶（细菌、线粒体）,氨肽酶去除Met,甲酰基,氨基,氨肽酶,去甲酰基酶,a、核糖体较大,b、mRNA 是单顺反子,c、其mRNA 具有m,7,GpppNp帽子结构，从而导致起始时,识别信号的差异,d、Met-tRNA,Met,不甲酰化,e、有较多的起始因子,（2）Euk蛋白质合成的起始因子,（3）起始机制,对AUG的识别涉及：,Euk 蛋白质合成起始中的重要参与者：,密码子与反密码子的配对,起始AUG上下文结构特点的作用,MettRNA,i,核糖体 AUG上下文特点,eIF 2作用 eIF-4F,修饰的帽子,小亚基连接到修饰的帽子,小亚基迁移到连接位点,eIF-2,Met,Met,Met,4.4.3,肽链的延伸,EFTu-GTP,+AA-tRNA,三元复合物,起始 tRNA 不能结合，保证了.,Prok肽链的延伸,以氨酰tRNA 进入70S 起始复合物,的A位为标志（第一个进位过程）,1、后续AA-tRNA与核糖体结合,（1）三元复合物生成,EFTu,+GTP,AA-tRNA,EFTu,GTP,mRNA内部的AUG不会被起始tRNA读出，肽链中间不会出现甲酰甲硫氨酸,（2）三元复合物进入A位,要求P位点被起始 氨酰tRNA 或肽酰tRNA占据,同时，EF-Tu催化GTP水解，释放 EFTuGDP,（3）Ts循环（TuTs 循环）,EFTs 能够使 EFTuGDP转变为 EFTuGTP,因为-EFTuGDP 不能有效地结合氨酰基tRNA,循环过程：,EFTuGDP,EF-Ts,EFTuEF-Ts,GTP 取代,EFTu-GTP,2、肽键生成（转肽反应）,（1）肽酰转移酶（peptidyl transferase）,位于核糖体大亚基，催化肽键生成,若干蛋白质、23S rRNA、5S rRNA,（2）形成过程：,把两个氨酰tRNA 定位于调准的位置,将处于P位的甲酰甲硫氨酰基或肽酰基转移到A位的氨酰基tRNA 的氨基上形成肽键,肽链延伸一个AA,进位,Tu,Ts,GTP,是指根据mRNA下一组遗传密码指导，使氨基酰tRNA进入核蛋白体A位,fMet,GTP,Tu,GDP,Ts,GTP,fMet,E位,fMet,转位（成肽）,是转肽酶催化的肽键形成的过程,E位,fMet,移位,在转位酶的作用下，促进核糖体向mRNA的3测移动，使,新形成的,肽酰tRNA和mRNA相对位移,由A位,进入核蛋白体P位，而卸载的tRNA进入E位,E位,fMet,AA3,Tu,GTP,移位,进位,转位,移位,（1）需要GTP 和 延伸因子 EFG,a、过程：,EFG 和 GTP 结合,-核糖体中具有GTP酶活性,的蛋白GTP水解,-A位生成的肽基转移到P位，P 位空载的 tRNA,进入E位,（此过程 mRNA 移动了一个密码子）,3、移位（translocation）,肽键生成后，核糖体沿,mRNA,向前移动一个密码子的距离,延伸的实质：即核糖体沿 mRNA 移动的实质-tRNA 的移动,tRNA和mRNA以相同的方向沿核糖体移动,b、EFG和 GDP 必须释放,下一个三元复合物进位,c、抗生素甾酸酶素（fusidic acid）实验证实,d、核糖体固有的移位性质可被 EFG 所催化,抗生素甾酸酶素能使核糖体停在移位后的状态（其稳定了EFG与GDP核糖体的构象）,实验表明：EFG 不存在时核糖体也可以发生移位,延伸,4、两类延伸因子的交替作用,使,肽键生成,和,移位,有条不紊的进行,EFG 和 GTP 的结合,要求,EFTu离开核糖体，新 的氨酰基tRNA进入A位,要求,EFG离开核糖体,氨酰基tRNA 三元复合物（EF-Tu）进入A,位点必须要求P位点被肽酰tRNA占据而A位点空载,EFG 和 GTP 结合.只有在肽键生成后，肽基转移到A位、P位 tRNA 空载,两种延伸因子交替与核糖体发生相互作用，使,肽键生成,和,移位,有条不紊的进行,5、Euk 肽链的延伸,（1）与 Prok 相似,eEF1 取代 EFTu 和 EFTs,eEF2 取代 EFG,真菌-eEF3 参与(维持翻译的准确性),（2）eEF1 大多数由,、,四个亚基,eEF-1,与GTP结合,酵母中过量表达可导致翻译忠实性的提高、果蝇,中可延长其寿命,衰老过程中，eEF1,活性下降,因此-衰老过程中可能伴随着翻译忠实性的下降,大量表达还可以提高细胞的生长能力,一些影响细胞生长的因素也可以引起细胞内eEF1,的,大量表达，如：癌基因vfos 的诱导,（3）有些资料表明：eEF2 并不是延伸所必须，只起到加,速的作用,6、GTP 的作用,（1）使各种翻译因子与 tRNA 或核糖体易于以非共价键结合；,水解成 GDP 和 Pi 的反应是释放结合因子的信号,Prok-IF2、EFTu、EFG,Euk -eIF2、eEF1、eEF2,GTP 是一种变构因子,（2）GTP 水解释