第6章-大肠杆菌的.ppt

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第六章 大肠杆菌的克隆载体,6.1 基于大肠杆菌的克隆载体,克隆载体：是一种能携带外源DNA片段进入受体细胞，并在受体细胞中得到维持或表达的DNA分子。,通常由天然的质粒、噬菌体或动植物的病毒改造而成。,6.1.1 质粒克隆载体的命名法,pBR322,“p”代表质粒,“BR”代表构建的实验室,“322”区别于其他的质粒,6.1.2 pBR322 一些有用特性,质粒载体的构建,将选择标记引入质粒中,调整质粒的结构，提高载体的效率（大小，克隆位点）,引入多种用途的辅助序列,R7268,Ap,R,R1,drd,19,Ap,R,Cm,R,Sm,R,Su,R,Km,R,pMB3,Ap,R,pSF2124,Ap,R,pBR312,Ap,R,Tc,R,pSC101,Tc,R,1,2,pM88,pMB9,Tc,R,3,4,ColE1,5,6,6,pBR313,Ap,R,Tc,R,pBR322,Ap,R,Tc,R,7,8,pMB1,(b),6.1.3 pBR322的家谱,6.1.4 更为复杂的大肠杆菌质粒克隆载体,pUC载体乳糖选择质粒,具有更高的拷贝数,重组体的识别只需要一步,拥有更多的多克隆单酶切位点,pUC载体乳糖选择质粒,(1)来自pBR322质粒的,复制起点(ori)；,(2)氨卞青霉素,抗性基因(Amp,R,),，但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的限制酶的单识别位点；,(3)大肠杆菌,-半乳糖苷酶(,lac,Z)的启动子及其编码该基因氨基端-肽链的DNA序列,此结构特称为,lac,Z,基因,；,(4)多克隆位点,(MCS)区段,：位于,lac,Z 基因中的靠近5端，内含十几个单一的限制性内切酶识别切割位点，使含有不同粘端的目的DNA片段可方便地定向插入载体中。但它并不破坏,lac,Z 基因的功能。,a-互补显色反应（蓝白斑筛选）,lacZ,-,-半乳糖苷酶,-,分解半乳糖,i,P,O,调控蛋白P,-肽段,分解,X-gal,产物呈现蓝色,诱导剂IPTG,-半乳糖苷酶基因lacZ突变体M15,6.1.4 更为复杂的大肠杆菌质粒克隆载体,pGEM载体克隆DNA的体转录,加入了两个短片段，这两个片段在限制性酶切位点的两侧，可被T7噬菌体的RNA聚合酶或SP6 T7噬菌体的RNA聚合酶的识别,方便了克隆DNA的体外转录，便于研究RNA加工，合成蛋白质等的研究等,6.2.1 M13克隆载体的开发,III VI I IV II X V VII IX VIII,野生型M13RF-DNA,M13mp系列载体,lacZ,polylinker,III VI I IV II X V VII IX VIII,M13mp系列载体,lacZ,polylinker,宿主菌缺陷型缺失,N,端第,11,41,位氨基酸：,-,半乳糖苷酶没有生物活性,未插入外源基因的M13mp1与该缺陷型基因可以产生互补,插入外源基因的M13mp1与宿主不互补,编码-半乳糖苷酶N端146氨基酸的基因序列,1、对野生噬菌体的改进,A、删除多余的限制性内切酶的位点。,B、切除一些非必需序列，增加载体的容量。,C、设计阳性选择重组子的方法。,D、设计可方便地通过转录作用制备外源插入DNA的RNA探针,的载体,E、发展可以使插入的真核cDNA与,半乳糖苷酶形成融合蛋白的载体。,6.3 基于噬菌体的克隆载体,6.3.1,噬菌体基因组可删除的部分不影响生存能力,噬菌体基因组中可以删除的序列与噬菌体进入从裂解状态进入溶源状态以及从溶源状态进入裂解状态有关，即与噬菌体整合和脱离大肠杆菌的染色体相关,删除了这部分序列的噬菌体只能进行裂解循环,6.3 基于噬菌体的克隆载体,6.3.3噬菌体载体可分为,插入型载体：只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点。,失去了非必需区,切点又位于报告基因上，故在切开DNA并插入外源基因后，报告基因失活，即可依此进行重组体的筛选,可插入长度为10kb的外源DNA,替换型载体：具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的 DNA区段可以被外源插入的DNA所取代。,可克隆的片段大，最大可达23kb，而质粒最大仅10 kb左右；,DNA的长度,大于,野生型噬菌体DNA,长度的75而不超过其105时，才能被包装成噬菌体颗粒，当DNA的长度短于野生型的75%或超过105%时，噬菌体的活性就急剧下降，,因此要求载体DNA和外源DNA长度之和在3953kb之间。,6.3.4 用,插入或置换载体进行克隆实验,环状,DNA的克隆（p110）,线状DNA的克隆（p110）,pHC79,6.4 kb,柯斯质粒载体pHC79图,由pBR322质粒DNA与噬菌体DNA的cos位点及其控制包装作用的序列构成,2、在柯斯质粒载体中克隆的过程,（1）用相同的内切酶处理柯斯质粒载体和外源DNA片段,（2）连接,（3）体外包装,（4）转染,（5）按质粒的方式进行复制,DNA ligase (high DNA concentration),Packing in vitro,Transducing particle containing cosmid recombinant,Absorption+injection,Cosmid,+,+,etc,37-52 kb,cos,Restriction,endonuclease,Restriction,Endonuclease,Target site,Ap,R,Foreign DNA,restriction,fragment,Ap,R,Select ApR clone,DNA circuarizes after injection,6.4 载体的用途和其他高容量的载体,噬菌体载体是主要用于cDNA文库，基因组文库的构建，也经常用于外源目的基因的克隆。,基因文库（gene library）是指汇集了某一生物基因组DNA全部序列的重组体DNA群体（转化子群）。,1、用,克隆载体构建基因组文库,Question 1：构建含多少重组子的库能覆盖一个选定的基因组？,考虑两个因素：载体的装载能力,目标基因组的大小,目标基因组的大小,载体装载的平均片段,重组子的个数,6.4 载体的用途和其他高容量的载体,Question 2：如何保证目标基因包含在所构建的文库中？,考虑两个实际问题：,选择的载体装载量,所用的内切酶对基因组DNA的完全切割频率和不完全切割,6.4 载体的用途和其他高容量的载体,2、其他高容量载体,BAC（bacterial artificial chromosome）,A、以大肠杆菌（,E.coli,）F性因子为基础构建的载体。,B、特点：,容纳大约200Kb的片段,可以像大肠杆菌的质粒一样繁殖（低拷贝，严谨型）,在宿主细胞中不会发生重组,6.4 载体的用途和其他高容量的载体,6.4 载体的用途和其他高容量的载体,2、其他高容量载体,P1以及PAC载体（,Pl-derived Artificial Chromosome）,A、,P1载体,组件：,包装位点（,pac,）,：,体外包装重组子称为噬菌体粒子所必需。,两个loxP位点,：,能被噬菌体重组酶（,cre,基因的产物）所识别,补充知识点,Cre重组酶：,于1981年从P1噬菌体中发现，属于 Int酶超基因家族。Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp（,EMBL,数据库登录号X03453），编码38kDa蛋白质。是一种位点特异性重组酶，能介导两个LoxP位点（序列）之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。,LoxP（locus of X-over P1）序列：,来源于P1噬菌体，是有两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。Cre在催化DNA链交换过程中与DNA共价结合，13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。其序列如下：,ATAACTTCGTATA,-GCATACAT-,TATACGAAGTTAT,+,Cre recombinase protein circularizes injected DNA at the lox P sites.DNA-replicates using plasmid replicon,Plasmid copy number is increased by induction of P1 lytic replicon.,Pac extract cleaves at,pa,c site and inserts DNA into p1 heads.Tails are attached,Allow phage to adsorb to host strain and inject DNA into,cre,+,host cell.,PAC载体（P1-derived artificial chromosome，PAC),Loannou,et al.,(1994)等发展的；,具有P1 和 F-因子 的特性,能插入100-300片段,高容量载体构建基因组克隆优点：,A、所需要的重组子少（即文库中包含的克隆数目较少）。,B、目标基因相对比较完整。,