[医学微生物学]病毒感染的检查方法和防治原则.ppt

書式設定,書式設定,第 2,第 3,第 4,第 5,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,病毒感染的,检查方法与防治原则,CHAPTER 25,1,）掌握病毒的分离培养方法；,2,）熟悉标本的采集与送检原则、病毒感染的快速诊断；,3,）了解病毒感染的免疫预防、抗病毒治疗。,学习要求,内 容,第一节 病毒感染的检查方法,第二节 病毒感染的特异性预防,第三节 病毒感染的治疗,第一节,病毒感染的检查方法,一、标本的采集与运送,病人急性期标本,标本抗生素,抑制细菌真菌繁殖,病变组织加入50甘油缓冲盐水低温,保存，尽快送检。,70,保存,血清标本：在发病初期和发病后,2,3W,各取一份血清，对比双份血清抗体效价,的动态变化。,:,病毒的分离培养,病毒的鉴定,病毒数量及感染性测定,二、,病毒的分离培养与鉴定,病毒的分离培养方法：,动物接种,鸡胚培养,细胞培养,:,动物接种,(animal inoculation),动物：,鼠、兔、猴、黑猩猩等,优点：,结果易观察，可建立动物模型,缺点：,有饲养条件要求，费用高、动物,体内常带有潜伏病毒。,目前已很少应用。,Chick embryo inoculation,Chick embryo inoculation,Allantoic inoculation is done mainly for production of vaccine of influenza virus.,主要用于流感病毒疫苗的生产,Viral replication produces visible lesions(pocks),grey-white area in the transparent(,透明的),allantoic(,尿囊的,),membrane.,Poxvirus,inoculate in allantoic membrane,痘病毒,绒膜尿囊膜接种,优点：,易管理,不带微生物,成本较低,缺点：,操作程序复杂,目前用鸡胚培养的病毒主要是流感病毒,鸡胚培养,(embryonated egg culture),(3),细胞培养,(cell culture),根据细胞生长的方式分,:,单层细胞培养（monolayer cell culture）,悬浮细胞培养（suspended cell culture）,根据细胞来源、染色体特征及传代次数分,:,原代培养细胞,二倍体细胞株,传代细胞系或株,(3),细胞培养,(cell culture),原代培养细胞（,primary cultural cells),组织 组织块 分散的单个细胞 单层细胞,剪碎 蛋白酶,(,原代细胞,),单层细胞,(,次代细胞,),传代培养,培养基,原代培养细胞（,primary cultural cells),epithelial cells,特点,:,对多种病毒敏感,生长能力有限,获取成本高,可携带潜伏病毒,应用,:,病毒分离与鉴定,病毒学实验研究,不能,用于制备疫苗,原代培养细胞（,primary cultural cells),体外分裂,50,100,代仍保持二倍染色体数目的单型细胞,特点,:,对多种病毒敏感,不带异种蛋白,(,人源性,),不带病毒,无致瘤潜能,应用,:,病毒分离与鉴定,病毒学实验研究,制备疫苗,二倍体细胞株,(diploid cell strain),fibroblastic cells,传代细胞系,(continuous cell line),特点,:,对多种病毒敏感性高,繁殖能力强,传代时间长,有致癌危险,(,来源于癌细胞或突变的二倍体细胞株,),应用,:,病毒分离与鉴定,病毒学实验研究,不能,用于制备疫苗,能在体外无限传代的细胞系。如,HeLa,Hep-2,epithelioid cells,:,病毒的分离培养,病毒的鉴定,病毒数量及感染性测定,二、,病毒的分离培养与鉴定,病毒鉴定：,病毒在细胞中增殖的指标,病毒形态学鉴定,病毒抗原鉴定,病毒,基因鉴定,细胞病变效应,(cytopathic effect,CPE,),病毒在敏感细胞内增殖引起特有的细胞病变。,CPE,：病毒感染细胞发生形态改变,Syncytium formation in cell culture caused by RSV(top),and measles virus(bottom).,CPE,：,病毒感染细,胞与邻近细胞融合,CPE,：形成包涵体（,inclusion body,）,Syncytial formation caused by mumps virus and haemadsorption of erythrocytes onto the surface of the cell sheet.,红细胞吸附（,hemadsorption,HAd,）,受染细胞膜表面血凝素（,HA,）,RBC,表面,HA,受体,干扰现象（,interference,）,风疹病毒人胚肾细胞 病毒增殖，,CPE,（）,埃可病毒人胚肾细胞 病毒增殖，,CPE,（）,人胚肾细胞,风疹病毒？,埃可病毒,CPE(-),埃可病毒,(,+,),风疹病毒,(+),CPE(+),埃可病毒,(+),风疹病毒,(-),细胞代谢的改变,细胞培养瓶 代谢变化-,PH,病毒在细胞中增殖的指标,细胞病变效应,(cytopathic effect,CPE,),红细胞吸附,病毒干扰作用,细胞代谢的改变,病毒鉴定：,病毒在细胞中增殖的指标,病毒形态学鉴定,病毒抗原鉴定,病毒,基因鉴定,:,病毒的分离培养,病毒的鉴定,病毒数量及感染性测定,二、,病毒的分离培养与鉴定,病毒数量及感染性测定：,50%,组织细胞感染量,蚀,(,空,),斑形成试验,病毒总量,(,活病毒,+,死病毒,),：,感染性病毒量,:,血凝试验,50%,组织细胞感染量,(,50%tissue culture infectious dose,TCID,50,),概念,:,测定病毒感染细胞后引起,50%,细胞病变的最小病毒量。,方法,:,一般是将病毒悬液作,10,倍的系列稀释，分,别接种细胞，经一定时间后观察,CPE,、血细胞吸,附等指标，以能使,50%,细胞感染的病毒的最高稀,释度作为终点。最后用统计方法计算出,50%,组织,细胞感染量。,用途,:,测定感染性病毒的量和毒力,分别为,10,-1,、,10,-2,、,10,-3,、,10,-4,、,10,-5,、,10,-6,倍稀释度的,HCMV,感染的,HEL,细胞,50%,组织细胞感染量,(,TCID,50,),蚀,(,空,),斑形成试验,（,plaque assay,）,原理：,适当浓度的感染性病毒在覆盖琼,脂的细胞层上产生可见和可数的局部病,灶称为,蚀,斑。一个,蚀,斑是由一个感染性,病毒颗粒增殖而形成的，由,蚀,斑的数目,可以计算出原始标本中感染性病毒的含,量。,PLAQUE ASSAY,PLAQUE ASSAY,PLAQUE ASSAY,PLAQUE ASSAY,PLAQUE ASSAY,PLAQUE ASSAY,分别为,10,-1,、,10,-2,、,10,-3,倍稀释度的,HCMV,病毒液感染的,HEL,细胞,蚀,(,空,),斑形成试验,（,plaque assay,）,用途：,测定感染性病毒量,单位,:,PFU(plaque forming unit)/ml,由一个感染性病毒颗粒增殖而形成的一个空斑称为空斑形成单位。,分纯病毒,蚀,(,空,),斑形成试验,（,plaque assay,）,已知抗原,测抗体,（诊断）,已知抗体,测抗原,（鉴定病毒属、种、,型、亚型）,三.病毒感染的血清学诊断,(,1,),中和试验,(Neutralization test),(2),血凝抑制试验,(H,emagglutinati,on i,nhibition test,),(,3,),免疫标记法,(,FIA、EIA、RIA,),蛋白印迹,(Western blot,),方法：,三.病毒感染的血清学诊断,Immunofluorescense,test,Immunofluorescense,test,Positive immunofluorescence test for rabies virus antigen.(Source:CDC),HEL,细胞中,CMV IE1,蛋白的表达,Enzyme immunoassay(EIA),ELISA,C,oloured wells indicate reactivity,AIDS,的确诊试验,Western blot,数小时内出结果,形态学检查,病毒成分（抗原或核酸）,早期抗体检测,（,I,gM,）,四.病毒感染的快速诊断,（一）,形态学检查,电镜和免疫电镜检查,普通光学显微镜检查,包涵体,电子显微镜,：可观察各种病毒的形态,但设备贵、操作复杂，,应用受限,光学显微镜,：可观察,大病毒,（,痘病毒,）和包涵体,对一般病毒检测,意义不大,呼肠病毒感染回肠上皮细胞电镜照片,Electronmicrographs,Inclusion body,Cytomegalic cell,that contains a dense,owls eye,acidophilic intranuclear inclusion body,Negry body,（二）,病毒成分检测,1,.,病毒蛋白抗原检测,免疫标记技术,2,.,病毒核酸检测,核酸扩增技术,核酸杂交技术,基因芯片技术,基因测序,（,三,）,早期抗体检测,可诊断急性感染,特异性,IgM,抗体,：,孕妇感染风疹病毒,检测早期抗原抗体是快速诊断的另一途径,EBV,早期抗原,抗体,香港大学专家：患者鼻咽标本,Vero,细胞培养,CPE,EM,观察：,冠状病毒,随后加拿大和美国,CDC,等,SARS,国际协作组的多个实验室也培养出了,冠状病毒,利用免疫荧光法将分离病毒与,SARS,患者血清进行,血清学检测,，,反应呈,阳性,从冠状病毒基因组的保守区设计引物，采用,RT-PCR,方法从培养上清中扩增出了,冠状病毒基因,测序,经,Genbank,数据库同源性比对，发现同源性为,64%,左右,SARS,冠状病毒的分离和鉴定,加拿大专家完成了全基因组测序,发,现与已知人和动物的冠状病毒的同源性差异较大,确,定为,一种新的冠状病毒,。,荷兰的病毒学家：用这种冠状病毒感染猴子,出,现了与,SARS,病人相同的临床表现和病理特征,再,次从动物学实验证实引起,SARS,的病原体是这种冠状病毒,WHO,将其命名为,SARS,冠状病毒,SARS,冠状病毒的分离和鉴定,第二节,病毒感染,特异性预防,微生物及其代谢产物,生物制品,动物免疫血清,（,biological products,）免疫细胞,细胞因子,预防和治疗感染性疾病,灭活疫苗,（,inactivated vaccine,）,活疫苗,（,living vaccine,）,重组载体疫苗,（,recombinant carrier vaccine,）,亚单位疫苗,（,subunit vaccine,）,化学提取或人工合成疫苗,重组疫苗,（,recombinant vaccine,）,核酸疫苗,（,nucleic acid vaccine,）,一、人工主动免疫常用生物制品,二、人工被动免疫常用生物制品,免疫球蛋白,血清丙种球蛋白,细胞免疫制剂,IFN-,、,细胞因子 IL-2、IL-6、IL-12,TNF、CSF,淋巴因子激活的杀伤细胞,LAK,细胞,第三节,病毒感染的治疗,1,抗病毒的化学制剂：,目前抗病毒化学药物主要有核苷类药物。,（,1,）核苷类药物：,通过阻抑子代病毒基因的合成与表达，抑制病毒复制,.,常用药物有,:,用于,DNA,病毒感染,:,阿糖腺苷、碘尿苷、无环鸟苷（阿昔洛韦）、丙氧鸟苷；,用于,HIV,感染,:,叠氮脱氧胸苷（,AZT,）,广谱抗病毒,:,3-,氮唑核苷，对多种,RNA,或,DNA,病毒有抑制作用。,第三节 病毒感染的治疗,（,2,）病毒蛋白酶抑制剂：,通过抑制病毒蛋白酶的活性，阻止病毒的复制,.,常用药物有印地那韦、利多那韦等，对,HIV,有一定抑制作用。,（,3,）其它抗病毒药物：,金刚烷胺或甲基金刚烷胺用于甲型流感的治疗，甲酸磷霉素用于疱疹病毒感染的治疗。,2,干扰素及干扰素诱生剂,:,干扰素具有广谱抗病毒作用，主要用,IFN-,，副作用小，对某些病毒性疾病的防治有较好的效果。,3,中草药,:,黄芪、大青叶、板兰根、贯众。,4,其他,:,单克隆抗体、治疗性疫苗、细胞因子等免疫制剂。,1.,名词解释,:,cytopathic effect,（,CPE,）,2.,分离病毒的标本有何要求？,3.,常用的分离培养病毒的方法有哪些？各有何应用？,4.,病毒在组织细胞中增殖的指标是什么？,思考题,从患者体内分离病毒，采集标本时的错误的是,A,在发病早期采集,B,选取正确部位取材,C,标本冷藏,D,标本尽快送实验室,E,疾病恢复期取材,细胞病变效应不包括：,A,细胞圆缩、脱落,B,细胞融合,C,形成包涵体,D,干扰现象,E,细胞裂解,预防病毒最有效的方法是使用：,A,抗毒素,B,抗病毒化学疗剂,C,中草药,D,疫苗,E,抗菌药物,下列不适于培养病毒的方法是,A,鸡胚培养,B,人工合成培养基培养,C,原代细胞培养,D,二倍体细胞培养,E,动物培养,不能作为病毒在细胞内生长繁殖指标的一项是,A,致细胞病变作用,B,红细胞凝集,C,干扰现象,D,细胞培养液变浑浊,E,细胞培养液,PH,改变,对治疗病毒感染无效的药物是,A,干扰素,B,抗生素,C,阿昔洛韦,D,黄连、黄岑,E,三氮唑核苷,同学们，大家好！我是汲蕊。曾在上一学期给大家教过,人体寄生虫学,，现参加了“全国微课教学比赛”，为争取理想成绩，为学校争得荣誉，请大家广为宣传，参与我的微课作品评选。在评选中请各位注意以下流程：,1.,本比赛官方主页为,以上每一项都希望大家请认真填写提交，同一,IP,应该每天可投票一次，但可评论多次，此项很重要；,3.,在作品网页“刷新”或“,F5”,键可增加“播放次数”，同样会增加作品的“投票指数”。,感谢大家的支持与参与！,