人源化抗体和单克隆抗体制备的主要方法.pptx

,2/15/2019,#,M,ono,c,l,ona,l,an,t,i,bod,y,人源化抗体和单克隆抗体制备的主要方法专家讲座,第1页,197,5,wi,t,h,a,t,e,c,hniqu,e,de,v,i,s,e,d,b,y,K,hle,r,an,d,Mil,s,t,ei,n,(,f,o,r,whi,ch,t,he,y,wer,e,awarde,d,a,Nobe,l,P,ri,z,e),.,T,he,y,di,d,t,hi,s,b,y,li,t,erall,y,f,u,s,in,g,m,y,elom,a,c,ell,s,wi,t,h,an,t,ibod,y,-,s,e,c,re,t,in,g,c,ell,s,f,ro,m,a,n,immuni,z,e,d,mou,s,e,.,T,h,e,t,e,c,hniqu,e,i,s,c,alle,d,s,oma,t,i,c,c,el,l,h,y,bridi,z,a,t,ion,.,Th,e,r,es,u,l,t,i,s,a,h,y,b,ri,do,m,a,(N,S,-,1,),.,N,S,-,1,是穩定小白鼠,BA,L,B,/,c,癌細胞株，除了能在培養基中 永續生長外还有一主要特征，細胞缺乏兩種核酸代謝主要酵素,T,K,t,h,y,midin,e,k,ina,se,H,G,P,RT,h,y,po,x,an,t,hine-guanin,e,pho,s,phoribo,syl,t,ran,s,f,era,se,pur,i,nes,人源化抗体和单克隆抗体制备的主要方法专家讲座,第2页,HA,T,m,e,d,i,u,m,be,c,au,s,e,i,t,c,on,t,a,i,n,s,:,h,y,po,x,an,t,h,i,n,e,a,mi,nop,t,e,r,i,n,t,h,e,p,y,r,imi,d,i,n,e,t,h,ymi,d,i,n,e,Th,e,l,og,i,c,:,Un,f,u,s,e,d,my,e,l,o,m,a,c,e,ll,s,c,anno,t,g,r,o,w,be,c,au,s,e,t,he,y,l,a,c,k,H,GP,R,T,.,Un,f,u,s,e,d,no,r,m,a,l,s,p,l,ee,n,c,e,ll,s,c,anno,t,g,r,o,w,i,nde,f,i,n,i,t,e,l,y,be,c,au,s,e,o,f t,he,i,r,limi,t,e,d,li,fe,s,pan,.,H,y,b,r,i,do,m,a,c,e,ll,s,a,r,e,ab,l,e,to,g,r,o,w,i,nde,f,i,n,i,t,e,l,y,be,c,au,s,e,t,h,e,s,p,l,ee,n,c,e,l,l,pa,r,t,ne,r,s,upp,li,e,s,H,GP,R,T,an,d,t,h,e,my,e,l,o,m,a,pa,r,t,ne,r,i,s,imm,o,r,t,a,l,.,B,ce,l,l,my,e,l,o,m,a,f,us,i,on,H,AT,EL,I,SA,人源化抗体和单克隆抗体制备的主要方法专家讲座,第3页,ELI,S,A,抗體生產：,1,),可把挑選出來融合細胞打入小鼠腹部，誘生腫瘤，然後以針頭搜集所產生腹水，通常可,取,15m,L,左右；腹水中抗體濃度非常高，每,m,L,可達數,m,g,。,2,),把融合細胞在大型培養槽中培養，搜集培養液上清即得抗體，但每,m,L,只好約數,m,g,，濃度較腹水稀約一 千倍。最近有一種細胞培養瓶，可產生如腹水般濃度上清，但價格極為昂貴,(,I,B,S,I,n,t,egr,a,B,io,sc,ien,c,e,:,I,n,t,egr,a,Celline,),。,3,),得到穩定抗體後，通常要再以,E,L,I,S,A,方法,檢定該抗體,s,ub,c,la,ss,是屬於,I,gG,I,g,M,或,I,g,A,等。,免疫時 間太短，較可能取得,I,gM,，但普通仍以,I,g,G,較多，注意,I,g,G,又可分成幾種,s,ub-,s,ub,c,la,s,s,。,4,),所得到抗體再經純化步驟，以除去雜質，可用以下各種方法組合,硫酸銨分劃：,搜集約,40,%,飽和度沉澱，是最經濟、方便方法。,離子交換法：,用,D,EA,E,陰離子交換法，多用在純化,I,gG,。,膠體過濾法：,以分子量差異分劃出各種抗體，多用在純化,I,gM,。,親和層析法：,以,P,ro,t,ei,n,A,-,吸著劑,專一性地吸住抗體分子,(,I,gG),。,T,o,a,c,h,i,e,v,e,t,h,i,s,end,w,e,r,a,is,e,d,m,ono,cl,ona,l,an,t,i,bod,i,e,s,aga,i,n,s,t t,h,e,Kcs,A,K,+,c,hanne,l,en,l,a,r,g,e,c,u,l,ture,an,d,s,e,l,e,c,t,e,d,cl,one,s,o,n,t,h,e,ba,si,s,o,f t,he,i,r,ab,ili,ty,to,r,e,c,ogn,iz,e,t,h,e,t,e,t,r,a,m,e,r,i,c,bu,t,no,t t,h,e,m,ono,m,e,r,i,c f,o,r,m,o,f t,h,e,c,hanne,l,.,人源化抗体和单克隆抗体制备的主要方法专家讲座,第4页,抗体检测,1,.,E,L,I,SA,用于检测针对可溶性抗,原,(,蛋白,质,),和细胞表面抗原,mA,b,。,2,.,F,A,C,S,(,流式细胞,仪,),用于检测细胞表面抗原,mA,b,。,3,.,用,we,s,t,e,r,n,b,l,o,t,检测单抗特异性。,杂交瘤细胞克隆化,克隆化普通是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经,过,H,A,T,筛选后杂交瘤克隆不能确保一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多克隆，可能包含抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞；所需要抗,体,(,特异性抗,体,),分泌细胞和其它无关抗体分 泌细胞。要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化。克隆化标准是，对于检测抗体阳性杂交克隆应尽早进行克隆化，不然抗体分泌细胞 会被抗体非分泌细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞生长速度比抗体 分泌细胞生长速度快，二者竞争结果会使抗体分泌细胞丢失。即 使克隆化过杂交瘤细胞也需要定时再克隆，以预防杂交瘤细胞,突 变或染色体丢,失,，从而丧失产生抗体能力。用克隆化方法很多，而最惯用就,是,有限稀释,法,和软琼脂平板法。,单抗制备过程影响原因,A,.,污染：包含细菌、霉菌和支原体污染。,B,.,融合后杂交瘤不生长,：在确保融合技术没有问题前提下主要考虑以下因,素,PE,G,有毒性 或作用时间过长,。,牛血清质量太差，用前没有进行严格筛选,。,骨髓瘤细胞污染了 支原体,。,HA,T,有问题，主要,是,A,含量过高,或,H,T,含量不足。,C,.,杂交瘤细胞不分泌抗体或停顿分泌抗体,：,融合后有细胞生长，但无抗体产生，可 能,是,HA,T,中,A,失效或骨髓瘤细胞发生突变，变,成,A,抵抗细胞所致,。,有可能是免疫原抗原 性弱，免疫效果不好,。,对于原分泌抗体杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞支原体污 染，或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长，从而抑制了抗体分泌细胞生长。也可能发生染 色体丢失。,D,.,杂交瘤细胞难以克隆化：,可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞活性状态相关，或因为细 胞有支原体污染，使克隆化难以成功。若是融合后早期克隆化，应在培养液,加,H,T,。,人源化抗体和单克隆抗体制备的主要方法专家讲座,第5页,单克隆抗体应用,（,1,）沉淀反应,：,P,r,e,c,i,p,i,t,a,t,i,o,n,r,e,a,c,t,i,o,n,（,2,）凝集试验,：,h,a,e,m,a,g,l,u,t,i,n,a,t,i,o,n,（,3,）放射免疫学方法检测免疫复合物,（,4,）,流式细胞仪：用于细胞分型和细胞分离。,（,5,）,E,L,I,S,A,等免疫学检测,（,6,）,B,I,A,c,o,r,e,b,i,o,s,e,n,s,o,r,:,检,测,A,b,-,A,g,或与蛋白亲和力,。,(,7,),免疫印记,（,w,e,s,t,e,r,n,b,l,o,tt,i,n,g,),（,8,）,免疫沉淀：,（,9,）,亲和层析：分离蛋白质,（,1,0,）,磁珠分离细胞,（,1,1,）临床疾病诊疗和治疗；,人源化抗体和单克隆抗体制备的主要方法专家讲座,第6页,人源化抗体,（,hu,m,an,i,z,e,d,an,t,i,bod,y,）,人源化抗体和单克隆抗体制备的主要方法专家讲座,第7页,抗体药品,市场巨大，前景辽阔。,当前单抗用作治疗药品研究趋势为：,应用领域：抗肿瘤、抗本身免疫病、抗感染为主,。,1,.,寻找新分子靶点；,2,.,抗体人源化；,开发类型：人源化及全人为发展方向。,抗体药品在应用中存在问题：,普通必须用小鼠骨髓瘤制备单抗，故所得鼠源性单抗，必须人源化，在临床上可降低异源性 蛋白所引发过敏反应和增加疗效。,鼠源抗体人源化后，抗体效价显著降低，造成临床疗效降低。,临床治疗需要大量抗,体,(,克级），故需要生物反应器制备抗体。因为抗体产量和质量受到 限制，而影响疗效。,基因工程抗体优点和缺点,优点：,不受动物品系,（,s,pe,c,ie,s),和抗体类型,（,i,s,o,t,y,pe,),限制。,利用嵌合抗体，使鼠源抗体人源化，降低潜在抗原表位，增强抗体疗效。,全人源化抗体，能够降低抗体异源性和免疫源性，最大化提升抗体疗效。,缺点：,抗体亲和力减弱，与完整抗体结构相比，功效显著降低。,3,.,偶联物分子微小化；,4,.,单抗药品高效化；,5,.,双特异性抗体以激活宿主效应细胞；,6,.,改变一些氨基酸以增加抗体亲协力；,7,.,抗体导向酶活化前体药品技术。,目标：,减小鼠源性成份，降,低,H,A,M,S,反应（,huma,n,易于大规模生产和应用于临床。,保留抗体抗原结合能力。,基本原理：,again,st,mou,se,sy,ndrome,),。,借助基因工程伎俩，将编码,A,b,重轻链可变区基因重组到真核表示载体上并进行表示。,人源化抗体和单克隆抗体制备的主要方法专家讲座,第8页,一、,嵌合抗体,应用,DNA,重组技术将小鼠抗体基因上可变区与人抗体基因恒定区重组,再将重组后基因导入骨髓瘤细胞中表示。依据所用载体质粒标识基因产物,选取适当抗生素或制剂进行筛选,再用与传统技术相同方法克隆出分泌人鼠嵌合抗体细胞株。,二、,CDR,移植人源化抗体,鼠源性抗体,V,区中,FR,仍残留一定免疫原性,这种抗体还远非真正人源化抗体,有些还能产生很强抗独特型反应。为降低鼠源成份,人们深入用人,FR,替换鼠,FR,形成更为完全人源化抗体,即 除 了,3,个,CDR,是 鼠 源 外,其 余 全部是人源结构,又称,CDR,移植抗体,(CDR-grafted antibody),或改型抗体,(reshaped antibody),。,1,.,人源改造抗体,（,1,）嵌合抗体,（,ch,imer,i,c,an,ti,bod,y,）,（,2,）人源化抗体,（,hu,m,an,i,zed,an,ti,body,）,（,3,）完全人源抗体,基因工程抗体分类,人源化抗体和单克隆抗体制备的主要方法专家讲座,第9页,三、,完全人源化抗体,1.,抗体库技术,噬菌体抗体库技术产生依赖于,3,项试验技术发展,:,一是,PCR,技术发展使人们能够用一组引物,(,免疫球蛋白可变区中骨架部分保守序列,),经过,RT-PCR,直接从,B,淋巴细胞总,RNA,克隆出全套免疫球蛋白可变区基因,从而使抗体库构建简单易行,;,二是噬菌体展示技术,(,即将抗体经过与噬菌体外壳蛋白融合表示在噬菌体表面,进而经亲和富集法筛选表示有特异活性抗体,),建立,实现了基因型和表型统一,提供 了 高效率筛选系统,这是噬菌体抗体库技术关键,;,三是从大肠杆菌分泌表示有结合功效免疫球蛋白分子片段。,噬菌体抗体库将基因型和表型统一于一体,将选择能力与扩增能力偶联起来,含有强大筛选功效,能够在体外模拟体内抗体生成过程,使抗体工程技术进入了一个新时代。噬菌体抗体库技术发展使体外不经过免疫取得抗体成为可能。因为它发生于体外,所以不依赖体内抗原识别和提呈系统,在理论上能够产生抗任何物质抗体。当前噬菌体抗体库技术也存在不足之处,如从未经免疫动物抗体库取得抗体亲和力不高、受外源基因转化率限制、抗体库库容不足以涵盖一些动物抗体多样性等。所以,大容量抗体库是取得高亲和力抗体和针对稀有抗原抗体关键。,2,转基因小鼠技术,经过基因敲除技术使小鼠本身基因失活并导入新基因,创造出携带人体抗体重、轻链基因 簇,而 自 身 抗 体 基 因 失 活 转 基 因 小 鼠。这 种 转 人 抗 体 基 因 小 鼠,(human antibody mouse,HuMab),所携带人,DNA,片段具 有 完备功效,能够有效地进行同种型转换和亲和力成熟。,转基因小鼠制备人抗体,其功效优于其它技术生产抗正常人体蛋白单抗。小鼠识别抗原和动员抗原抗体系统仍保持完整,轻易把人体蛋白识别为异物。另外,因为抗体是体内产生,经历了正常装配和成熟过程,从而确保成品含有较高靶结合亲和力。但转基因小鼠也存在一些缺点,即转基因通常有体细胞突变和其它独特序列,造成不完整人序列,;,而且,由 于抗体是在小鼠体内装配,因而产生单抗含有鼠糖基化模式,所以这些单抗最终并不是全人源化。,人源化抗体和单克隆抗体制备的主要方法专家讲座,第10页,2,.,小分子抗体,（,1,）,F,ab,片段,（,2,）单链抗体,（,s,i,ng,l,e,cha,i,n,an,ti,bod,y,，,sc,F,v,）、双链抗体、三链抗体,（,3,）微型抗体,（,mi,n,i,body,，两,个,sc,F,v,与抗体,CH,3,区连接）,（,4,）双特异性抗体,（,d,i,abod,y,）,（,5,）其它形式抗体（细胞内抗体、催化抗体、免疫脂质体、最小结合单位等）,人源化抗体和单克隆抗体制备的主要方法专家讲座,第11页,基因工程抗体制备主要方法：,1,.,人鼠嵌合抗体,（,C,h,i,me,r,i,c,A,nt,i,bod,i,e,s,）,原理：利用基因重组技术，把鼠抗体重轻链可变区部分与人抗体 重轻链恒定区进行重组，降低鼠源结构，增加人源结构，而保持 抗体与原抗原特异性结合。,缺点：,鼠抗体部分亦能作为一个异种抗原，屡次重复使用在人体产生抗体及过 敏反应,（,H,A,MS,反应,，,hu,m,a,n,aga,i,n,s,t,m,ou,se,sy,nd,r,o,m,e,),。,嵌合抗体可保持特异性结合和外源性抗原降低，但亲和力显著下降。,杂交瘤细胞株,取得两个可变区,酶切，连接,克隆载,体,(,T,载体,),原核表示系统检测,酶切,是,测序,是,酶切，连接,构建表示载体,R,T,-,PC,R,转化,否,否,1,。取得鼠单抗重轻链可变区基因片段。,2,.,基因片段插入含有,人,I,g,G,重轻链恒定区表示载体。,2,.,人源化抗体（,Humanized Antibodies,）,H,u,m,ani,z,a,t,ion,o,r,re,s,haping,o,f,m,urin,e,an,t,ibodie,s,i,s,a,n,a,tt,e,m,p,t,t,o,t,ran,s,f,e,r,t,h,e,f,ul,l,an,t,ige,n,s,pe,c,i,f,i,c,i,t,y,an,d,bindin,g,a,v,idi,t,y,o,f,m,urin,e,m,ono,c,lona,l,an,t,ibodie,s,t,o,a,hu,m,a,n,an,t,ibod,y,b,y,gra,ft,in,g,t,h,e,m,urin,e,c,omplemen,t,ari,t,y,de,t,erminin,g,region,s,(CDR,s),on,t,o,a,huma,n,v,ariabl,e,regio,n,f,ramewor,k,。,人源化抗体和单克隆抗体制备的主要方法专家讲座,第12页,S,D,R,gra,fti,n,ga,new,approa,ch,t,o,an,ti,body,hu,m,an,i,za,ti,on,d,iff,eren,ce,be,t,w,een,t,he,S,D,R,gra,fti,ng,and,t,he,CD,R,gra,fti,ng,人源化抗体和单克隆抗体制备的主要方法专家讲座,第13页,3,.,Full,y,hum,a,n,m,A,b,s,1,）,tra,n,s,g,e,n,i,c,m,i,ce,首先把小鼠,编,码,I,g,重轻链基因剔除。,制备表示人,I,g,重轻链,转,基因小鼠。,上二种小鼠回交，取得只表示人,I,g,重轻链基因小鼠。当用抗原免疫后，小鼠可产生完全人源抗体。,人源化抗体和单克隆抗体制备的主要方法专家讲座,第14页,2,）,H,u,m,a,n,a,n,t,i,bod,y,-,d,i,s,p,l,a,y,li,b,r,a,ri,e,s,a,.,把人,Ig,重轻链可变区基因片段展示,在,l,噬菌体表,面,组成抗体库。,S,c,h,e,m,a,t,i,c,r,e,p,r,e,s,e,n,t,a,t,i,o,n,o,f,d,i,ff,e,r,e,n,t,a,n,t,i,bod,y,f,o,r,m,a,t,s,C,on,s,t,r,u,c,t,ion,o,f,a,n,t,ibod,y,lib,r,a,r,ie,s,DN,A,se,qu,e,n,ce,s,e,n,c,od,i,n,g V,H,a,n,d VL,dom,ai,n,s,a,r,e,a,mp,li,f,ie,d,b,y,P,C,R,V,H,a,n,d VL,dom,ai,n,s,a,r,e,p,ai,r,e,d,r,a,ndom,ly,i,n,c,r,easi,n,g,f,un,c,t,i,on,a,l,d,ive,r,sity i,n,t,h,e,li,b,r,a,r,y,Th,e,sc,FV,se,qu,e,n,ce,s,a,r,e,a,mp,li,f,ie,d,b,y,P,C,R,u,si,n,g,p,r,i,m,e,r,s,i,n,c,o,r,po,r,a,t,i,n,g,r,es,t,r,ic,t,i,o,n,si,t,e,s,cl,on,i,n,g,i,n,to,t,h,e,ph,a,g,e,m,i,d,vec,t,o,r,t,r,a,n,s,f,o,r,m,e,d,i,n,to,E,.,.,.,.,c,c,c,c,o,o,o,o,l,l,l,l,i,i,i,b,b,b,b,y,y,y,y,e,e,e,e,l,l,l,l,e,e,e,e,c,c,c,c,t,t,t,t,r,r,r,r,o,o,o,o,p,p,p,p,o,o,o,o,r,r,r,r,a,a,a,a,t,t,t,t,i,i,i,i,o,o,o,o,n,n,n,n,a,ft,e,r,r,esc,u,e,w,ith,h,el,p,e,r,ph,a,g,e,t,h,e,r,a,ndo,m,c,omb,i,n,a,t,o,r,ia,l,li,b,r,a,r,y,o,f,a,n,t,i,bod,ie,s,i,s,d,is,p,laye,d,o,n,ph,a,g,e,w,h,o,l,e,A,b,(,15,0,k,D,),F,V,(,2,5,k,D,),s,c,F,V,(,2,7,k,D,),F,a,b,(,5,0,k,D,),C,L,C,H,2,C,H,3,V,H,C,H,1,V,L,a,n,t,i,g,e,n,b,in,d,in,g,s,i,t,e,人源化抗体和单克隆抗体制备的主要方法专家讲座,第15页,b,.,经过噬菌体把抗体表型和基因型相偶联，易进行分子克隆和基因操作。,c.,抗体库起源影响筛选结果（免疫和正常人）。,d,.,高通量筛选与抗原结合抗体，但亲和力低。,A,m,p,l,i,f,i,c,a,t,i,o,n,E,lu,t,e,W,a,s,h,S,e,l,ec,t,i,o,n,o,f,a,b,in,d,in,g,s,p,ec,i,f,i,c,i,t,y,f,r,o,m,a,p,h,a,g,e,d,i,s,p,l,a,y,l,i,b,r,a,r,y,N,e,x,t,p,a,nn,i,n,g,c,y,c,l,e,A,n,t,i,bod,y,l,i,b,r,a,r,y,o,n,p,h,a,g,e,A,n,t,i,g,e,n,c,o,lu,m,n,人源化抗体和单克隆抗体制备的主要方法专家讲座,第16页,3,）用人骨髓瘤细胞直接制备全人抗体,关键点：建立好人骨髓瘤细胞。稳定性高和融合率高,M,ou,se,my,e,l,o,m,a,Hu,m,a,n,my,e,l,o,m,a,Doub,l,e,s,e,l,ect,i,n,g,m,a,r,k,ers,G,41,8,a,n,d,HA,T,H,u,man,LN,B,cell,s,人源化抗体和单克隆抗体制备的主要方法专家讲座,第17页,