生物技术与作物育种专题知识.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第十五章 生物技术与作物育种,第1页,第1页,第一节 细胞工程与作物育种,植物细胞工程：是以植物组织和细胞培养技术为基础发展起来一门科学。,它以细胞为单位，在体外（in vitro）条件下进行培养、繁殖或人为地使细胞一些生物学特性按人们意愿生产某种物质过程。包括花药培养、,体细胞变异筛选,、幼胚培养、试管受精和,原生质体融合,等,第2页,第2页,理论基础：,细胞全能性（cell totipotency）。指细胞所含有形成各种细胞类型潜在能力。由于细胞核内有保持物种遗传性所需要全套遗传物质因此高度分化体细胞含有发育成一个生物体能力。,第3页,第3页,一、植物细胞和组织培养技术,（一）培养基及其构成,1、培养基种类和特点,（1）MS培养基,（2）B5培养基,（3）White培养基,（4）N6培养基,（5）KM-8p培养基,（6）SH培养基,第4页,第4页,2、培养基成份,无机盐和水,大量元素,C.H.O.N.P.K.Ca.Mg.S.Cl,微量元素,Fe.Cu.Mo.Zn.Mn.Co.B.Na,水,蒸馏水、双蒸水或使用去离子水,有机化合物,糖,碳源和能源,氨基酸类,有机氮源,维生素类,维生素b1(盐酸硫胺素)、维生素b6(盐酸砒哆醇)、生物素、烟酸、叶酸等,生长调整物质,生长素,IAA、NAA、2,4-D、IBA,细胞分裂素,天然：6-BA、KT（激动素，糠基酰嘌呤）,人工：ZT（玉米素）、2-iP,赤霉素,GA,3,成份不定物质,椰乳、酵母提取物、番茄汁、香蕉泥,琼脂,从海藻中提取一个高分子碳水化合物,第5页,第5页,3、培养基配备,(1)水和药物,水必须采用蒸馏水或无离子水，药物最好采用分析纯，至少是化学纯药物。,(2)母液配备,为以便培养基制备，现将培养基各种成份分类配成浓缩母液，正式配制时按要求用量稀释混合。,(3)制备培养基,混合各成份母液,熔化琼脂,(4)培养基消毒,主要有高温高压灭菌和过滤灭菌两种办法。,调pH值,分装,灭菌,放置备用,搅拌混匀,第6页,第6页,4、无菌操作办法,（1）消毒剂,消毒剂 使用浓度（%）消除难易 消毒时间（min）消毒效果,次氯酸钠 2 易 530 较好,次氯酸钙 910 易 530 较好,过氧化氢 1012 最易 515 好,溴水 12 易 210 较好,硝酸银 1 较难 530 好,氯化汞 0.11 较难 210 最好,抗生素 450mg/L 中 3060 较好,第7页,第7页,（2）无菌操作,（3）无菌培养,二、细胞和组织培养与作物育种,（一）体细胞克隆变异及其育种利用,1、体细胞克隆变异遗传基础,（1）染色体数目变异,（2）染色体结构变异,（3）点突变,2、突变体筛选,第8页,第8页,3、在作物改良上应用,（1）抗病,（2）抗除草剂,（3）抗氨基酸或氨基酸类似物,（4）耐盐,（5）耐旱,优良品种,细胞培养,R0,R0群体,改良体细胞克隆,拟定遗传方式,遗传稳定性测试,田间试验,育种新品系,多点田间试验,区域试验,继续田间试验、种子富集,审定,投入生产,利用体细胞克隆变异技术路线,第9页,第9页,（二）单倍体细胞培养及育种利用,1、单倍体细胞培养在遗传和育种中应用价值,（1）后代快速纯合,（2）提升选择效率,（3）排除杂种优势对后代选择干扰,（4）遗传研究良好试验材料体系,（5）突变体筛选,第10页,第10页,母本 X 父本,F1,F2,品系比较试验,区域试验,花药培养,花药培养,加倍,选择鉴定,杂交育种与单倍体育种周期比较,第11页,第11页,2、离体培养条件下小孢子发育,（1）营养细胞发育路径,（2）生殖细胞发育路径,（3）,营养细胞和生殖细胞并进发育路径,（4）花粉均等发育路径,3、影响花药培养原因,（1）供体植株生长条件,（2）供体植株年龄,（3）花粉发育时期,（4）花蕾和花药处理,（5）培养基,（6）培养条件,第12页,第12页,4、单倍体细胞培养与植物育种,A品种,X,B品种,F1杂种,单倍体培养,重组纯合体,重组了A和B品种长处纯系,遗传稳定性测试,新品系,品种,亲本,推广利用,杂种优势利用,田间测试,自交，田间测试,拟定遗传基础,杂交和分离测试,选择,染色体加倍,小孢子培养或花药培养,第13页,第13页,三、植物原生质体培养和体细胞杂交,植物原生质体：指用特殊办法脱去细胞壁、裸露、有生活力原生质团。,第14页,第14页,（一）原生质体分离,原则：确保原生质体不受伤害及不损害它再生能力，先决条件要有一个适当渗入压。,1、分离办法,（1）机械法,（2）酶法,第15页,第15页,2、影响原生质体分离原因,（1）材料起源,（2）渗入压,（3）酶,（4）分离培养基,（5）培养条件,（6）组织前处理,3、原生质体搜集、纯化和活力测定,第16页,第16页,（二）原生质体培养,（三）细胞融合（体细胞杂交）,1、融合办法,（1）NaNO3处理诱发融合,（2）高pH-高浓度钙离子处理,（3）PEG处理,（4）电融合,2、融合方式,第17页,第17页,3、杂种细胞筛选,（1）形态互补,（2）遗传互补,（3）代谢互补,（4）生长互补,4、杂种鉴定,5、细胞融合与作物育种,第18页,第18页,第二节 转基因技术与作物育种,作物转基因育种：依据育种目的，从供体生物中分离目的基因，经DNA重组与遗传转化或直接运载进入受体作物，通过筛选取得稳定表示遗传工程体，在通过田间试验与大田选择育成转基因新品种或种质资源。,第19页,第19页,常规育种技术相比，转基因育种含有很大优势：,1.能够利用基因资源大大拓宽。,2.为哺育优良品种提供了崭新育种路径。,3.能够对植物目的性状进行定向变异和定向选择。,4.能够大大提升选择效率，加速育种进程。,第20页,第20页,（一）作物转基因技术,1、转基因技术发呈现实状况,（1）国际转基因植物研究与现实状况,作物,1996年,1997年,1997年/1996年,大豆,玉米,烟草,棉花,油菜,累计,50,30,100,80,12,280,510,320,160,140,120,1250,10.2,10.7,1.6,1.8,10,4.5,全球转基因作物种植面积比较（单位：万公顷）,第21页,第21页,（2）我国转基因作物研究与利用概况,转Bt基因抗虫棉对棉铃虫抗性表现,第22页,第22页,（二）转基因育种程序,目的基因或DNA获取,含有目的基因或者DNA重组质粒构建,受体材料选择和再生系统建立,转基因办法确实定和外源基因转化,转化体筛选和鉴定,转基因植株育种利用,第23页,第23页,1、目的基因取得,（1）依据基因表示产物-蛋白进行基因克隆,分离和纯化控制目的性状蛋白质或多态，进行氨基酸序列分析;,依据所氨基酸序列推导相应核苷酸序列;,采用化学合成办法合成该基因;,通过相应功效鉴定来拟定所推导序列是否为目的基因。,第24页,第24页,（2）从基因组DNA或mRNA序列克隆基因,A、同源序列法和表示序列标签法,同源序列法是依据基因家族组员所编码蛋白质结构中含有保守氨基酸序列特点发展一条快捷克隆即因家族未知组员新路径，即基于同源序列候选基因法。,表示序列标签是指能够特异性标识某个基因部分序列，通常包括了该基因足够信息区，因而能够和其它基因相区别。当前，表示序列标签主要是通过cDNA路径取得。,第25页,第25页,B、,依据连锁图谱克隆基因,准拟定位大片段,DNA文库,连锁分子标识筛选,含目的基因大片,段DNA克隆,含目的基因精细,物理图,染色体步行,分段制成探针,cDNA文库,目基因,亚克隆文库,含目的基因,亚克隆,序列分析及,基因克隆,目的基因图位克隆办法示意图,第26页,第26页,C、转座子标签法,纯合体突变株,核基因库1,带转座子DNA片断,野生型植株,核基因库2,完整目的基因,互补测验,检测功效,转座子探针,亚克隆片断做探针,转座子标签法克盛大要农艺性状基因示意图,第27页,第27页,D、差异显示法,在生物个体发育不同阶段或是在不同组织、空间进行有序表示方式，叫做基因差异表示。,差异显示PCR是指经过对起源特定组织类型总mRNA进行PCR扩增、电泳，并找出待测组织和对照之间特异扩增条带，该条代就有可能是全长或是部分特异表示基因，利用这种方法进行基因克隆方式就是差异显示法基因克隆。,现在又出现了限制性消减杂交（SSH）和RNA任意引物PCR（RAD-PCR）等各种方法。,第28页,第28页,2、目的基因重组质粒构建,质粒重组基本环节：,从原核生物中获取目的基因载体并进行改造；,利用限制性内切核酸酶将载体切开，并用连接酶把目的基因连接到载体上，取得DNA重组体。,第29页,第29页,第30页,第30页,3、受体材料选择,（1）良好植物基因转化系统应含有条件：,高校稳定再生能力；,受体材料要有较高遗传能力；,含有稳定外植体起源；,对筛选剂敏感。,（2）惯用受体材料类型：,愈伤组织再生系统,直接分化再生系统,原生质体再生系统,胚状体再生系统,生殖细胞再生系统,第31页,第31页,4、转基因办法确实定和外源基因转化,（1）.载体介导转移系统,将外源基因重组进入适合载体系统，通过载体携带将外源基因导入植物细胞并整合在核染色体组中伴随核染色体组一起复制和表示。,主要办法有：,叶盘法,真空渗入法,原生质体共培养法,第32页,第32页,（2）.外源基因直接导入法,这是一个不需要借助载体介导，直接利用理化原因进行外援遗传物质转移办法。,主要办法有：,化学刺激法,基因枪轰击法(,gene gun,),高压电穿孔法(,electroporation,),微注射法(,microfibers,),超声波介导法,脉冲电泳法,离子束介导法,第33页,第33页,5、转化体筛选和鉴定,1.转化体筛选,2.转化体鉴定,（1）DNA水平鉴定,（2）转录水平鉴定,（3）翻译水平鉴定,6、转化体安全性评价和育种利用,第34页,第34页,二、转基因作物遗传特点,（一）、外源基因整合机制,1、同源重组整合（homologous recombination）,外源DNA与受体细胞染色体DNA上同源序列之间发生互换替换，并整合到受体染色体组上。,2、位点特异性重组（site-specific,recombination）,在两条DNA特异位点上，通过位点特异性重组酶作用对DNA进行特异性切割，实现外源基因整合。,第35页,第35页,3、转座作用（transposition,）,通过体外重组将外源基因插入到转座子系统中，当携带有目的DNA片段重组转座成份复制并整合插入到染色体其它区域时实现外源基因整合。,4、异常重组（illegimate recombination）,异常重组整合是外源基因整合到植物基因组最常见方式。,第36页,第36页,（二）、整合后外源基因在植物体内表现,共克制：,向受体植物种导入一个与受体内某基因同源基因，导入基因及受体内与它同源基因表示都也许削弱现象。,基因沉默,：,转基因植株由于外源基因结构被破坏或者外源基因插入了染色体异染色质区域，出现外源基因序列不表示。,第37页,第37页,(三)、外源基因在后代中遗传规律,分离类型,家系数,百分率,1各位点整合（3:1）,81,52,2各位点整合,不连锁（15:1）,32,21,连锁（3:1,15:1）,9,6,3各位点整合,不连锁（63:1）,9,6,3各以上位点（255:1）,5,3,例外（3:1）,20,13,累计,156,100,第38页,第38页,三、转基因作物品种选育,（一）、转基因作物育种目的制定,依据市场经济需要和生产发展前景,依据不同自然环境、栽培条件,落实详细性状目标,要考虑品种搭配,要充分考虑转基因作物，尤其是外援目标基因对人类健康和环境安全影响,第39页,第39页,（二）、转基因办法确实定及转基因植株取得（三）、转基因作物品种选育,纯系育种,回交育种,杂交育种,杂种品种,第40页,第40页,（四）转基因作物生物安全性,（1）转基因作物环境安全性,转基因作物演变为农田杂草也许性,基因漂流到近缘野生种也许性,对自然生物类影响,（2）转基因作物食品安全性(food safety),有毒物质(potential toxicity),过敏源(allergenicity of newly introduced proteins),changes in concentrations of key nutrients or natural toxicants.,第41页,第41页,第42页,第42页,第三节、分子标识辅助选择育种,一、分子标识类型和作用原理,1、分子标识类型和特点,类型（按技术特性分类）,Hibridisation-based markers以分子杂交为基础DNA标识技术（RFLP标识、DNA指纹技术、原位杂交）,PCR-based markers以PCR反应为关键德DNA指纹技术（RAPD标识、SSR标识、SSLP标识、SCAR标识、AFLP标识、STS标识）,Sequencing based markers新型分子标识（SNP标识、EST标识）,第43页,第43页,2、原理和遗传特性,(1)RFLP标识,A.RFLP标识原理,植物基因组DNA上,碱基替换、插入、缺失,或重复等，造成某种限,制性内切酶酶切位点,增长或丧失，从而产生,限制性片断长度多态,性。,第44页,第44页,基本环节,DNA提取,用DNA限制性内切酶消化,凝胶电泳分离，转移到滤膜上,Southern,杂交,放射性自显影或酶学检测,第45页,第45页,B、RFLP标识特点,（1）遍及于整个基因组，,数量 几乎是无限；,（2）无表型效应，,不受发育阶段器官特异性限制；,（3）共显性，,可区别纯合子和 杂合子；,（4）结果稳定、可靠；,（5）DNA需要量大，检测技术繁杂，,难以用于大规模育种实践中,第46页,第46页,（2）RAPD标识,A、RAPD标识原理,B、RAPD标识特点,（3）AFLP标识,A、AFLP标识原理,B、AFLP标识特点,第47页,第47页,（4）SSR标识,A、SSR标识原理,依据微卫星DNA两端单,拷贝序列设计一对特异引,物，利用PCR技术，扩增每个,位点微卫星DNA序列，通过,电泳分析关键序列长度多,态性。,第48页,第48页,基,本,步,骤,设计探针，筛选重组克隆,依据SSR两侧序列设计并合成引物,PCR扩增反应,建立基因组DNA质粒文库,对阳性克隆DNA插入序列测序,凝胶电泳检测多态性,第49页,第49页,B、SSR标识特点,（1）SSR标识为共显性标识，可判别出纯合子和杂合子。,（2）重复性高，稳定可靠。,（3）DNA用量少，对DNA质量要求也不太高。,（4）使用SSR技术需要知道重复序列两翼DNA序列。,第50页,第50页,二、主要农艺性状基因连锁标识筛选技术,（一）、遗传图谱构建与主要农业性状基因标识,1、遗传作图原理,其原理是基于染色体互换与重组。在细胞减数分裂时，非同源染色体上基因互相独立，自由组合，而位于同源染色体上连锁基因在减数分裂前期I非姊妹染色单体间互换而发生基因重组，用重组率来表示基因间遗传距离。遗传图谱只显示基因间在染色体上位置，并不反应DNA实际长度。,第51页,第51页,2、构建遗传图谱主要步骤：,依据遗传材料之间多态性确定亲本组合，建立作图群体。,对群体中不同植株标识进行基因性分析。,借助计算机程序构建连锁群,3、构建遗传图谱，首先要选择适当亲本及分离群体，而且亲本之间差异不宜过大，不然会降低所建图谱准确度和合用性。,4、用于分子标识遗传作图可分为两类：,暂时性分离群体，包含F2群体、BC等,永久性分离群体，包含重组自交系群体、加倍单倍体群体等,第52页,第52页,自花授粉作物作图群体构建办法,P,1,P,2,F,1,F,2,F,3,F,4,F,1,B1:BC,1,F,1,P,1,F,1,P,1,F,1,P,1,B2:BC,2,DHL,异花授粉作物作图群体构建办法,ABCDEfG,AbcdEfg,AbCDEfG,aBCdefg,杂合F,1,对B、D、G位点来说，相称于,F,2,对A、C、E位点来说，相称于测交,F位点不分离,第53页,第53页,F2,BC1,DH,RIL,群体,形成,F1自交后代,F1回交后代,F1花粉分化个体,F2个体自交后代,性状研究对象,个体,个体,品系,品系,准确度,低,低,高,高,必要群体规模,大,大,中,中,分离百分比,1:2:3或3:1,1:1,1:1,1:1,不同作物群体特点,第54页,第54页,（二）、近等基因系哺育与主要农艺性状基因标识,（三）,、群体分离分析法与主要农艺性状基因标识,（四）、数量性状基因定位,第55页,第55页,三、作物MAS育种,（一）、作物MAS育种须具备条件,分子标识与目标基因共分离或紧密连锁，普通要求二者间遗传距离小于5cM,最好1cM或更小。,含有在大群体中利用分子标识进行筛选有效手段，主要是应用PCR技术。,筛选技术在不同试验室间重复性好，且含有经济、易操作特点。,含有实用化程度高并能帮助育种家作出抉择计算机数据处理软件。,第56页,第56页,供体,受体,RR Rr rr,(1-P),2,2P(1-P)P,2,M,R,m,r,M,R,m,r,目的基因与DNA标识间遗传距离位p,亲本中DNA标识带型,F,1,杂种中DNA标识带型,在F,2,分离群体中分子标识类型,即MM,Mm,mm,MM类型分子标识所代表目的基因型及其频率,利,用,MAS,遗,传,基,础,（以,RFLP,为,例）,M抗性标识 R抗性基因,m感病标识 r感病基因,第57页,第57页,（二）、MAS育种办法,1、回交育种,2、SLS-MAS,3、MAS聚合育种,第58页,第58页,受体亲本,供体亲本,(不含优质基因)(含优质基因),F,1,受体亲本,BC,1,目的基因定位,标识辅助选择,中选BC,1,受体亲本,(含优质基因),BC,2,BC,3,标识辅助选择,标识辅助选择,中选BC,3,(含优质基因),新育成优质品种,(受体亲本遗传本背景+优质基因),自,交,目的基因定位,与标识辅助回交,育种相结合程序图,中选BC,1,受体亲本,(含优质基因),第59页,第59页,受体亲本 供体亲本A,(无优质基因)(含优质基因A),受体亲本 供体亲本B,(无优质基因)(含优质基因B),F1(含优质基因A)F1(含优质基因B),复杂杂种(分离群体),受体亲本 供体亲本C,(无优质基因)(含优质基因C),中选杂种个体 F1,(含优质基因A和B)(含优质基因C),复杂杂种(分离群体),中选杂种个体 受体亲本,(含优质基因A、B和C),新育成优质品种,(受体亲本遗传背景+优质基因A、B和C),回交12代，标识辅助选择,自交,标识辅助选择,标识辅助选择,标,记,辅,助,基,因,聚,合,与,品,质,改,良,相,结,合,程,序,图,第60页,第60页,（三）,、,提升分子标识筛选效率,1、多重PCR办法,2、用相斥相分子标识进行育种选择,3、克服连锁累赘,4、减少MAS育种成本,第61页,第61页,