生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,生物起搏种子细胞筛选及,HCN,通道电药理学试验研究,汇报人：杨靖,导 师：黄从新 教授,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第1页,研究背景,迟缓性心律失常为临床常见多发病,电子起搏器植入术是治疗严重迟缓性心律失常首选方案,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第2页,电子起搏器存在缺点,非生理性起搏,电池寿命有限,易受外界电磁干扰等,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第3页,生物起搏器构建,-,当前研究热点,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第4页,主要内容,生物起搏器种子细胞筛选,HCN,通道电生理及药理学试验研究,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第5页,第一部分,生物起搏器种子细胞筛选,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第6页,研究对象,心脏干细胞（,CSCs,）,脂肪干细胞（,ASCs,）,骨髓间充质干细胞（,BMSCs,）,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第7页,CSCs,相关研究,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第8页,研究内容,CSCs,分离培养及其判定,5-,氮杂胞苷诱导,CSCs,向窦房结样细胞分化,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第9页,试验方法,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第10页,小园形、亮细胞从组织移植块中爬出（箭头所表示）（,200,）,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第11页,流式细胞仪分选,左图，分选前流式细胞仪检测培养细胞,c-kit,阳性率,右图，用流式细胞仪分选经,c-kit,标识细胞,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第12页,流式细胞仪检测,流式细胞仪判定分选后,CD34,、,CD45,阳性率,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第13页,倒置显微镜观察,分选后单个细胞（左图），培养后簇集式增殖、心球样细胞团形成（右图）（,200,）,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第14页,荧光显微镜观察,在光学显微镜下,(,左图,),、荧光显微镜下（右图）观察刚分选,同一批,c-kit+,细胞（,400,）,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第15页,增殖能力比较,不一样部位间比较,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第16页,增殖能力比较,不一样性别间比较,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第17页,免疫荧光检测,分选后,4,周用抗,cTnI,SMA and CD31,抗体检测培养细胞免疫表型（,A,300;B-C,200,）,A,C,B,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第18页,RT-PCR,检测,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第19页,RT-PCR,检测,RT-PCR,方法分析分选细胞不一样培养时间,GATA-4,HCN2,和,HCN4,mRNA,表示*,P 0.05,#P 0.01,培养,8,周组,vs,培养,4,周组,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第20页,免疫荧光检测,5-Aza,诱导,CSCs,分化,用抗,cTnI,GATA4,抗体检测经,5-Aza,诱导后,CSCs,分化免疫表型,（,A,200;B,400,）,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第21页,免疫荧光检测,用抗,HCN4,抗体检测经,5-Aza,诱导后,CSCs,分化细胞表示,HCN4,蛋白情况,（,A,400;B,200,）,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第22页,荧光检测结果比较,不一样浓度,5-aza,诱导后细胞在,4,周时表示,GATA-4,cTnI,和,HCN4,蛋白情况,.10uM,组与前两组比较，,#P 0.05,5-Aza,诱导浓度,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第23页,RT-PCR,检测,RT-PCR,技术分析在不一样浓度,5-aza,诱导后细胞在不一样培养时间,GATA-4,HCN2,和,HCN4 mRNA,表示,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第24页,RT-PCR,检测,RT-PCR,技术分析在不一样浓度,5-aza,诱导后培养细胞在不一样培养时间,GATA-4,HCN2,和,HCN4 mRNA,表示,.P 0.05,#P 0.01,2,组,vs 3,组或,4,组,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第25页,结 论,体外培养条件下能够取得,c-kit,+,CD34,-,CD45,-,CSCs,不一样部位不一样性别起源,CSCs,增殖,能力存在差异,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第26页,c-kit,+,CSCs,含有向心肌样和窦房结样,细胞分化能力,10M 5-Aza,有增强上述分化作用,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第27页,ASCs,与,BMSCs,相关研究,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第28页,试验流程,ASCs,BMSCs,细胞形态学,流式细胞仪检测,细胞表面标识物,增殖能力比较,5-AZa,诱导,cTnI,阳性率比较,HCN4 mRNA,相,对含量检测,倒置显微镜,观察、拍照,CD29,、,CD44,CD73,、,CD14,CD34,转染,HCN4,基因,CCK-8,试剂盒,转染效率,凋亡率,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第29页,形态学比较（,P5,）,(200),ASCs,BMSCs,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第30页,表面标识物检测（,P5,）,抗原表示水平无显著差异,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第31页,增殖能力比较,*,P,0.05,*,P 0.05,（,400,）,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第35页,ASCs,和,BMSCs,转染,HCN4,后凋亡率,比较,a ASCs,b BMSCs,c,二者对比,P5,代,ASCs,转染,HCN,基因后凋亡率低于,BMSCs P 0.05,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第36页,结 论,来自同一个体,ASCs,与,BMSCs,相比,含有更强体外增殖能力,含有更强向心肌样细胞及窦房结样细胞分化能力,二者基因转染效率,相同,，但,转染,HCN4,基因后,ASCs,凋亡水平更低,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第37页,第二部分,HCN,通道电生理及药理学试验研究,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第38页,主要内容,HCN,通道在卵母细胞中表示,HCN2/HCN4,通道复合体转染,ASCs,胺碘酮对,HCN,通道作用及机制,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第39页,HCN,通道在卵母细胞中表示,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第40页,爪蟾卵母细胞,HCN,通道基因,分离,扩增、酶切、线性化,培养,体外转录,细胞内显微注射,通道表示,卵母细胞钳统计通道电流,试验流程,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第41页,电生理学指标,电流表示幅值,通道动力学特征,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第42页,HCN,通道电流,A.HCN1,电流,B.HCN2,电流,C.HCN4,电流,D.,激活曲线,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第43页,HCN,通道动力学,A.,经典电流,B.I-V,曲线,C.,去激活常数,D.,激活常数,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第44页,HCN1/HCN2,共表示形成电流幅值,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第45页,HCN1/HCN4,共表示形成电流幅值,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第46页,HCN2/HCN4,共表示形成电流幅值,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第47页,HCN1/HCN2,与单个亚型通道动力学比较,A.,电流图,B.,激活时间常数,C.,激活曲线,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第48页,HCN1/HCN4,与单个亚型通道动力学比较,A.,电流图,B.,激活时间常数,C.,激活曲线,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第49页,HCN2/HCN4,与单个亚型通道动力学比较,A.,电流图,B.,激活时间常数,C.,激活曲线,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第50页,结 论,HCN1,、,2,和,4,共表示后均可形成复合体电流,HCN2/4,以,1:1,百分比共表示所形成复合体电流幅度最大，激活速度最快,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第51页,HCN2/HCN4,通道复合体转染,ASCs,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第52页,试验流程,共聚焦摄影,ASCs,细胞培养,构建荧光标识基因,质粒转染细胞,固定,提取,RNA,RT-PCR,检测,抽提蛋白,Western blot,爬片,通道电流统计,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第53页,共转染,HCN2/4,通道,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第54页,通道,mRNA,表示水平,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第55页,通道蛋白表示水平,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第56页,封接带荧光,ASCs,细胞,200,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第57页,膜片钳统计,HCN,电流,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第58页,通道动力学研究,激活常数,激活曲线,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第59页,结 论,HCN2,及,HCN4,通道可分布在,ASCs,细胞膜共同区域,二者共表示存在促进作用,HCN2/HCN4,通道复合体表示在,ASCs,上与表示在爪蟾卵母细胞上电生理学特征一致,较单一亚型含有更加快激活动力学特征,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第60页,胺碘酮对,HCN,通道作用及机制,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第61页,胺碘酮对,HCN,通道浓度依赖性阻滞,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第62页,胺碘酮使用依赖性阻滞作用,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第63页,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第64页,胺碘酮对HCN通道激活曲线作用,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第65页,结 论,胺碘酮可呈浓度依赖性及使用依赖性阻滞,HCN,通道,且并不改变其电流激活电压依赖性,其对,HCN,通道可能是一个开放态阻滞作用,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第66页,谢谢,生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究专家讲座,第67页,