细菌药敏试验及其耐药表型检测.pptx

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,Fresno 11/00,*,细菌药品敏感试验及其耐药表型检测,沙湾县人民医院检验科,张伟荣,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第1页,抗菌药品敏感试验,测定抗菌药品在体外对病原微生物有没有抑菌或杀菌作用方法称为抗菌药品敏感性试验（,Antimicrobial Susceptibility Test,），简称药敏试验（,AST,）。,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第2页,药敏试验意义,预测抗菌治疗效果；,指导抗菌药品临床应用；,发觉或提醒细菌耐药机制存在，能帮助临床医生选择适当药品，防止产生或加重细菌耐药；,监测细菌耐药性，分析耐药菌变迁，掌握耐药菌感染流行病学，以控制和预防耐药菌感染发生和流行。,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第3页,药敏试验,MIC,：在与微生物生长速率相关特定时间间隔内，通常是,18,24,小时，能够抑制被测菌生长最低药品浓度。,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第4页,敏感性分类,(CLSI,定义),敏感（,Susceptible,）,用常规用量治疗有效,常规用药时到达平均血药浓度超出细菌,MIC 5,倍以上。,耐药（,Resistance,）,用常规用量治疗不能抑制细菌生长,MIC,高于药品在血、体液中可能到达浓度,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第5页,敏感性分类（,2,）,中介,(Intermediate),MIC,靠近,血、体液中药品浓度，治疗反应率低于敏感株,药品生理浓集部位有效,(,尿,-FQ),加大用药剂量可能有效,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第6页,药敏试验方法学,半定量,纸片扩散法 (抑菌圈直径),MIC,法：,稀释法(肉汤、琼脂),自动化仪法,抗生素连续梯度法(,Etest),流式细胞仪,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第7页,将含有定量抗菌药品纸片贴在已接种测试菌琼脂平板上，纸片中所含药品吸收琼脂中水分溶解后不停向纸片周围扩散形成递减梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌生长被抑制，从而形成无菌生长透明圈即为抑菌圈。,抑菌圈大小反应测试菌对测定药品敏感程度，并与该药对测试菌,MIC,呈负相关关系。,纸片扩散法（,Kirby-Bauer,法）,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第8页,纸片扩散法,水解酪蛋白（,MH,）培养基，,pH7.2,7.4,，做成琼脂厚度,4mm,，直径,90mm,平板；,挑取孵育,16,24,小时已分纯菌落，置于生理盐水管中，振荡混匀后校正浓度至,0.5,麦氏标准。,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第9页,纸片扩散法,用无菌棉拭子蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多出菌液,；,然,后在,MH,琼脂表面均匀涂布接种,3,次，每次旋转平板,60,度,；,最终沿平板内缘涂抹,1,周,；,平板在室温下干燥,3,5min,，用无菌镊子或商品化纸片分配器将含药纸片紧贴于琼脂表面，各纸片中心距离应大于,24mm,，纸片距平板内缘大于,15mm,。,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第10页,纸片扩散法,35,孵育,16,24,小时量取抑菌圈直径；,依据抑菌环直径，按照,CLSI,标准判读，汇报敏感、中介、耐药。,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第11页,12,纸片扩散法影响原因,MIC,接种菌量,细菌生长率,抗生素含量、扩散性,平皿厚度,温度，预孵育时间,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第12页,13,纸片扩散法标准化,CLSI,：美国试验室标准化委员会,(Clinical and Laboratory Standards Institute),每年修订更改,包含质控,新药判定标准,特殊耐药性检测,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第13页,14,CLSI,法规,要求纸片含量、接种浓度、培养基、平皿厚度、判定标准、质控；,要求常规测试汇报抗生素；,不一样药判定标准不一样；,不一样菌判定标准也不一样。,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第14页,15,常规测试并汇报药品分组,(1),肠杆菌科,绿脓和非肠杆菌科,一 级 氨苄西林 头孢他啶，庆大霉素,头孢唑林，庆大霉素替卡西林，哌拉西林,二级 阿米卡星 阿米卡星,氨苄西林,/,舒巴坦 头孢吡肟，头孢哌酮,阿莫西林,/,克拉维酸氨曲南,头孢呋肟，头霉素环丙沙星，亚胺培南,头孢噻肟，头孢曲松 替卡西林,/,克拉维酸,环丙沙星，亚胺培南 妥布霉素，复方磺胺,替卡西林，哌拉西林,三级 氨曲南，头孢他啶头孢曲松,卡那霉素，奈替米星 氯霉素，奈替米星,妥布霉素,四环素，氯霉素,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第15页,16,常规测试并汇报药品分组,(2),葡萄球菌,肠球菌,一级 苯唑西林，青霉素 青霉素，氨苄西林,二级 红霉素类万古霉素,克林霉素，万古霉素,三级 氯霉素庆大霉素,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第16页,17,常规测试并汇报药品分组,(3),流感嗜血杆菌,肺炎链球菌,一级 氨苄西林，青霉素青霉素，红霉素,复方磺胺,复方磺胺,二级 头孢呋肟，头孢噻肟氧氟沙星，四环素,头孢他啶，氯霉素 万古霉素,三级 阿奇霉素，头孢克罗氯霉素，利福平,环丙沙星，亚胺培南利福平，四环素,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第17页,18,预报用药,(,一,),测试药菌名推测其它药品敏感性,苯唑西林葡萄球菌全部,-,内酰胺类,四环素全部（除葡多西环素，米诺环素,萄球菌和不,动杆菌,红霉素,G,球菌罗红,霉素,，克拉,霉素,，,阿奇霉素,克林霉素全部林可霉素,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第18页,2026/10/15,19,预报用药,(,二,),测试药菌名推测其它药品敏感性,氨苄西林肠球菌青霉素,青霉素,G,葡萄球菌氨苄,西林,，美洛,西林,替卡,西林,头孢噻吩肠杆菌科,头孢,拉定，头孢氨苄,头孢,克罗,奈啶酸,肠杆菌科全部,氟喹诺酮类,万古霉素,全部替考拉宁,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第19页,以一定浓度抗菌药品与含有被试菌株培养基进行一系列不一样倍数稀释（通常为双倍稀释），经培养后观察其最低抑菌浓度。,稀释法中用琼脂培养基者为琼脂稀释法，用肉汤培养基者为肉汤稀释法。,药敏试验,-,稀释法,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第20页,E test 法,E,试条是一条,5mm50mm,无孔试剂载体，一面固定有一系列预先制备，浓度呈连续指数增加稀释抗菌药品，另一面有读数和判别刻度；,抗菌药品梯度可覆盖有,20,个,MIC,对倍稀释浓度宽度范围；,将,E,试条放在细菌接种过琼脂平板上，经孵育过夜，围绕试条显著可见椭圆形抑菌圈，圈边缘与试条交点刻度浓度即为抗菌药品抑制细菌最小抑菌浓度。,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第21页,2026/10/15,wanghui-ART,22,E test 法,细菌生长区,E test,塑料,条,椭圆形,细菌生长,抑制区,256,128,8,016,判读抑菌浓度,（,MIC ug/ml),细菌药敏试验及其耐药表型检测,第22页,E test 法,菌液制备及接种均同纸片扩散法。,90mm,平板上可放,E,试验试条,1,2,条，,140mm,平板最多可放,6,条。,孵育温度及时间同纸片扩散法。,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第23页,2026/10/15,24,E test 法,优点,连续浓度梯度，与琼脂稀释法相关性好,影响原因少，稳定性高,操作简单，省时,缺点：昂贵,用途：快生长菌，苛养菌，厌氧菌，酵母菌，,分枝杆菌,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第24页,细菌耐药机制,细菌耐药机制主要有四种：,产生一个或各种水解酶、钝化酶和修饰酶；,抗生素作用靶位改变，包含青霉素结合蛋白位点、,DNA,解旋酶、,DNA,拓扑异构酶,改变等；,细菌膜通透性下降，包含细菌生物被膜形成和通道蛋白丢失；,细菌主动外排系统过分表示。,在上述耐药机制中，第一、二种耐药机制含有专一性，第三、四种耐药机制不含有专一性。,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第25页,-,内酰胺酶,内酰胺酶是一类水解青霉素、头孢菌素类抗生素灭活酶；该酶位于革兰阳性球菌菌体外，革兰阴性杆菌间质中；,检测方法有微生物培养法、碘淀粉法、头孢硝噻吩纸片法。其中头孢硝噻吩纸片法因为简单、方便、快速，应用于临床检测。,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第26页,葡萄球菌属,青霉素,方法,敏感,中介,耐药,MIC,0.12,g/ml,-,0.25,g/ml,纸片扩散法,29 mm,-,28 mm,CLSI M100-S20.Table 2C.,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第27页,诱导,-,内酰胺酶试验,苯唑西林,(,诱导剂,),接种纯菌落于琼脂上,(,比如，,BAP,MHA),；,贴,-,内酰胺类纸片,(,比如,苯唑西林,头孢西丁,),；,孵育过夜；,测试抑菌圈周围细菌；,假如,-,内酰胺酶阳性,汇报青霉素,R,。,Pos,Neg,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第28页,超广谱,-,内酰胺酶（,ESBLs,）,ESBLs,是指由质粒介导能水解青霉素类、头孢菌素类和单环,内酰胺类氨曲南一类酶；,ESBLs,不能水解头霉素类和碳青霉烯类药品，能被克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦等,内酰胺酶抑制剂所抑制；,ESBLs,主要见于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，另外也见于肠杆菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、沙雷菌属等其它肠杆菌科细菌、不动杆菌、铜绿假单胞菌。,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第29页,超广谱,-,内酰胺酶（,ESBLs,）,纸片法，出现以下一个情况即可怀疑该菌株产生,ESBL,（筛选阳性）：,头孢泊肟,17mm,头孢他啶,22mm,头孢噻肟,27mm,头孢曲松,25mm,氨曲南,27mm,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第30页,超广谱,-,内酰胺酶（,ESBLs,）,纸片法（表型确认试验）,头孢他啶和头孢他啶,/,克拉维酸、头孢噻肟和头孢噻肟,/,克拉维酸。,任一复方制剂抑菌圈直径与对应单药抑菌圈直径相差,5mm,时，即可判断该菌产,ESBL,。,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第31页,超广谱,-,内酰胺酶（,ESBLs,）,稀释法，出现以下一个情况即可怀疑该菌株产生,ESBL,：,头孢他啶或头孢噻肟或头孢曲松或氨曲南,MIC2,m,g,/mL,或头孢泊肟,MIC8,m,g,/mL,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第32页,超广谱,-,内酰胺酶（,ESBLs,）,稀释法（表型确认试验）,头孢他啶和头孢他啶,/,克拉维酸、头孢噻肟和头孢噻肟,/,克拉维酸。,任何一组酶抑制剂复方制剂,MIC,值比对应单药,MIC,降低,3,个稀释度者即可判定该菌为产,ESBL,菌株。,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第33页,AmpC,酶特征,AmpC,酶是在革兰阴性菌中发觉由染色体或质粒介导水解头孢菌素,型,内酰胺酶，可分为诱导酶和非诱导酶。,与,ESBLs,不一样是，,AmpC,酶对三代头孢菌素耐药但对四代头孢菌素敏感且不被酶抑制剂克拉维酸所抑制，但其酶活性可被氯唑西林和硼酸抑制。,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第34页,AmpC,酶检测方法,头孢西丁三维试验是检测,AmpC,酶经典方法；,除此之外，还有以硼酸化合物为抑制剂检测肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌,AmpC,酶、,AmpC Disk,、头孢西丁琼脂基础法等。,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第35页,碳青霉烯酶,碳青霉烯酶能够定义为含有水解碳青霉烯类抗生素活性,-,内酰胺酶，主要分布于,-,内酰胺酶,A,、,B,、,D,类中。,依据水解机制中作用位点不一样能够将碳青霉烯酶分为两大类：,一类称为金属碳青霉烯酶，这类酶以金属锌离子为活性作用位点，能够被,EDTA,抑制，属于,B,类,-,内酰胺酶；,另一类以丝氨酸（,Ser,）为酶活性作用位点，能够被酶抑制剂克拉维酸和他唑巴坦所抑制，属于,A,、,D,类,-,内酰胺酶。,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第36页,碳青霉烯酶,A,类酶,B,类酶,D,类酶,染色体编码：,SME NMC,IMI,质粒编码：,KPC,GES,质粒编码,OXA-23 OXA-24 OXA-51 OXA-58 OXA-55 OXA-48 OXA-50 OXA-60 OXA-62,金属酶，位于,GMEs,上，包含,VIM,，,IMP,，,GIM,，,SPM,，,SIM,等,能够被酶抑制剂抑制,能够被,EDTA,抑制,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第37页,碳青霉烯酶表型检测方法,-,改良,hodge,试验,ATCC25922,，,0.5,麦氏，,1:10,稀释涂,MH,平板,平皿中心贴,10g,厄他培南或亚胺培南纸片,10,l,环挑取,3,5,个菌落从平板中心纸片边缘向平板边缘划线,被测菌株与大肠埃希菌,ATCC25922,抑菌环交汇处大肠埃希菌生长增强，即产碳青霉烯酶。,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第38页,改良,hodge,试验结果判读,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第39页,金属酶表型检测方法：,EDTA,协同试验,用,0.5,麦氏单位待测菌悬液涂布,M H,平板。,贴,IMP(10g),纸片距其,1cm,处贴,EDTA,纸片（,0.5mol/L 4l,）。,35,过夜培养。,亚胺培南抑菌圈在靠近加,EDTA,纸片侧显著扩大者为产金属酶菌株。,亚胺培南,EDTA,10mm,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第40页,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（,MRSA,）携带,SCCmec,基因盒。,SCCmec,基因盒中,MecA,基因编码修饰青霉素结合蛋白,PBP2a,，这种蛋白对甲氧西林和其它,-,内酰胺类抗生素亲和力下降，从而造成对这些抗生素耐药。,耐甲氧西林葡萄球菌,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第41页,耐甲氧西林葡萄球菌检测,MRSA,检测方法有头孢西丁纸片扩散法、苯唑西林琼脂稀释法、乳胶凝胶试验检测,PBP2a,、,mecA,基因测定及,MRSA,显色培养基。,头孢西丁纸片法、苯唑西林琼脂稀释法是当前检测耐甲氧西林葡萄球菌最惯用筛选方法。,对于金黄色葡萄球菌，,MRSA,检测能够使用苯唑西林纸片，但对于凝固酶阴性葡萄球菌则不能使用苯唑西林纸片。,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第42页,凝固酶阴性葡萄球菌中苯唑西林,MIC,结果汇报策略,*,苯唑西林,MIC(,g/ml),进行,mec,A,或,PBP2a,或,头孢西丁纸片扩散,0.25,4.0,0.5-2.0,汇报苯唑西林敏感,汇报苯唑西林耐药,阴性,阳性,汇报苯唑西林敏感,汇报苯唑西林耐药,*检测无菌部位感染,非表皮葡萄球菌菌株,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第43页,克林霉素诱导耐药试验,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第44页,克林霉素诱导耐药葡萄球菌,红霉素,*,耐药金葡菌或凝固酶阴性葡萄球菌可对克林霉素,结构性或诱导性,耐药或仅对红霉素耐药。,*,或其它大环内酯类,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第45页,机制,耐药基因,红霉素,克林霉素,核糖体修饰-药品不能结合于靶位,erm,R,S*,R,R,结构性,泵-药品被泵出,msr,A,R,S,erm,=erythromycin ribosome methylase,msrA,=macrolide streptogramin resistance,*,需要诱导来显示耐药性,红霉素,/,克林霉素耐药葡萄球菌耐药机制,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第46页,诱导性克林霉素耐药（,erm,介导）,葡萄球菌,-“D,试验”,患者不会对克林霉素有反应,-,汇报克林霉素耐药,无克林霉素诱导（,msrA,介导）,真克林霉素敏感,-,汇报克林霉素敏感,“,D”,阳性,阴性,15,26 mm,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第47页,葡萄球菌诱导性克林霉素耐药,MIC,检测方法,4.0g/ml,红霉素,0.5g/ml,克林霉素,No growth,=,无诱导性克林霉素耐药,生长,=,诱导性克林霉素耐药,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第48页,对于红霉素耐药，克林霉素敏感葡萄球菌，需检测诱导性克林霉素耐药,注意,试验,适合用于金葡菌和凝固酶阴性葡萄球菌,(,苯唑西林敏感和耐药株,),；,对于,CoNS,，,该试验无须常规开展因为克林霉素极少用于治疗凝固酶阴性葡萄球菌；,大多数医院相关,MRSA,是克林霉素耐药；,大多数小区相关,MRSA,是克林霉素敏感,(,msr,A,基因型,),；,克林霉素能够口服给药。,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第49页,万古霉素耐药金黄色葡萄球菌（,VRSA,）,耐药是因为,从万古霉素耐药肠球菌（VRE）中取得vanA基因,美国报道例数,9,个患者,检测,大多数标准方法均可检测,菌落形态,经典金葡菌,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第50页,vanA,从,VRE,转至金葡菌,van,A,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第51页,纸片扩散法折点葡萄球菌,-,万古霉素,CLSI,文件,Susceptible,敏感,Intermediate,中介,Resistant,耐药,M100-S18,15,-,-,-,-,-,CLSI M100-S19.Table 2C.,对于金黄色葡萄球菌,必须用,MIC,法检测万古霉素,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第52页,肠球菌,高水平氨基糖苷类耐药筛查,纸片扩散法,120 g,庆大霉素,;300 g,链霉素,10 mm=,无,高水平氨基糖苷类耐药,MIC,筛查,庆大霉素,:500 g/ml,链霉素,:1000 g/ml(,肉汤,),g/ml(,琼脂,),细菌药敏试验及其耐药表型检测,第53页,万古霉素耐药肠球菌（,VRE,）表型,VRE,屎肠球菌中居多,van,A,-,高水平耐药,(MIC,256 g/ml),van,B,-,中等水平耐药,(MIC 16-,256 g/ml),低水平万古霉素耐药,van,C-(MIC 2-16 g/ml),vanC,天然存在于鹑鸡肠球菌和铅黄肠球菌,菌株不引发院内暴发，,vanC,基因不易于传输,纸片扩散法试验可能检测不出,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第54页,谢谢大家！,细菌药敏试验及其耐药表型检测,第55页,