survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,survivin,反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡研究,The effect of survivin antisense oligonucleotide on apoptosis of HL-60 cells,研 究 生,:,陈艳萍,导师,:,毕富勇 副教授,汪萌芽 教 授,学科专业,:,生理学,研究方向,:,肿瘤生化,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第1页,前 言,1997,年耶鲁大学,Altieri,博士用,EPR-1,cDNA,在人类基因组库杂交筛选试验中发觉了一段,15kb,大小基因片段，它编码了,142,个氨基酸组成,Survivin,蛋白；,Survivin,编码基因位于染色体,17q25,，是凋亡抑制蛋白（,IAP,）家族新组员,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第2页,Structure of human,IAP protein family,17q25,BIR:baculoviral IAP repeat,RZF:ring zinc-fingle,CARD:caspase recruitment domain,Inhibitor of Apoptosis,Location in human chromosome,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第3页,Survivin,分子结构,长,螺旋,BIR,区,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第4页,Survivin,分子结构,长,螺旋,BIR,区,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第5页,Survivin,分子结构,Survivin,形成二聚体,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第6页,Survivin,表示,肺癌,肝癌,膀胱癌,皮肤癌,神经母细胞瘤,乳腺癌,食管癌,胃癌,白血病,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第7页,Survivin,表示,SURVIVIN,选择性表示于绝大多数肿瘤组织,在正常成人分化组织中不表示（包含癌旁组织）,普遍性,独特征,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第8页,Survivin,作用,!,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第9页,Survivin,作用,Survivin,抗凋亡,肿瘤细胞,分裂增加凋亡降低,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第10页,研究内容,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第11页,反义,Survivin,survivin,表示受抑,活化,细胞凋亡,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第12页,技术路线,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第13页,HL-60,细胞,体外悬浮培养,掺入反义寡核苷酸,48 h,后,分别于,24h,、,48 h,形态学观察,、死活细胞计数,收获细胞、检测,指标,RT-PCR,TUNEL,FCM,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第14页,材料,细胞株,HL-60,细胞株（急性早幼粒细胞系）由中国科学院上海细胞所提供,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第15页,RNAgents Total RNA Isolation System,Promega,企业,AccessQuick,TM,RT-PCR System,Promega,企业,Propidum Iodide(PI,碘化丙啶,),Sigma,企业,主要药品与试剂,材料,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第16页,研究方法,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第17页,反义寡核苷酸序列,survivin,反义硫代寡聚脱氧核苷酸,(Aspo),序列,5GGCAACGTCGGGGCACCCAT3,9,非特异性对照硫代寡聚脱氧核苷酸,(Nspo),序列,5GCCATCGTAGGGGATCGCTT3,9,上海,SANGON,企业合成与纯化,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第18页,培养箱,20%,新生小牛血清,RPMI-1640,液,100U/ml,青霉素,100 ug/ml,链霉素,37,o,C 5%CO,2,饱和湿度,倒置显微镜观察,23,天传代一次,细胞系培养和传代,HL-60,细胞,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第19页,Photo1.HL-60 cells,（,100,）,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第20页,Tab1.The experiment grouping,group factor concentration,Control RPMI-1640 mixture,Nspo Nspo 15.0umol/L,Aspo5.0 Aspo 5.0umol/L,Aspo10.0 Aspo 10.0umol/L,Aspo15.0 Aspo 15.0umol/L,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第21页,试验分组及寡核苷酸掺入,1000r/min,离心,5min,RPMI-1640,洗,1,次,细胞起始浓度,410,6,/ml,取细胞悬液,1000ul,接种至,24,孔板,核酸,100 ul,置,CO,2,培养箱中孵育,HL-60,细胞,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第22页,细胞增殖能力及活力观察,HL-60,细胞,于,24,、,48h,取,50 ul,细胞悬液,0.4%,台盼蓝染色,计数死活细胞,着色为死细胞拒染为活细胞,计算细胞存活率,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第23页,细胞增殖能力及活力观察,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第24页,HL-60,细胞,survivin mRNA,表示,总,RNA,提取,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第25页,细胞,沉淀,加入,300,ul D,液,加入,30 ul Sodium Acetate,加入苯酚,:,氯仿,:,异戊醇,300 ul,冰浴,15min 10000g4,离心,20min,转移上清,加入等量异丙醇,20,放置,10min,10000g4,离心,10min,75%,冷乙醇洗涤,RNA,10000g4,离心,10min,以无,RNase,纯水溶解沉淀,RNA,纯度检验和定量,RNA,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第26页,HL-60,细胞,survivin mRNA,表示,RT-PCR,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第27页,反应体系,50,l,48,延伸,45,min,95,预变性,2 min,PCR,循环,95,45sec 61,1 min 72,1min,共,30,个循环,72,延伸,5min,模板,RNA 1 ul,AMV,逆转录酶,1 ul,上游引物,3 ul,下游引物,3 ul AccessQuick,TM,Master Mix 25 ul,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第28页,Tdt,酶介导缺口末端标识法,详细操作按试剂盒说明书进行,结果与判定：细胞核为棕褐色者为阳性细胞，即凋亡细胞,凋亡细胞,指数,=,凋亡细胞数,细胞总数,100%,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第29页,DNA,倍体分析及凋亡率检测,试验流程,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第30页,单细胞悬液,不含,Ca,2+,或,Mg,2+,PBS,洗细胞,2,次,1000,g,离心,5,min,弃上清,计数细胞总数,500,l PBS,重悬,5,ml,冷乙醇,4,过夜,离心洗细胞,2,次,含,1%,小牛血,清,8,00,l,PBS,重悬,避光孵育,1h,100,l,煮沸过,RNA,酶,A,37,30,分钟,FCM,分析,加入100,l PI,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第31页,统计分析,结果均以“均数,标准差”表示，组间比较用单原因方差分析，以,P,0.05,确定有显著性意义。,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第32页,结果,(1),细胞增殖能力及活力观察,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第33页,Tab2.Effect of Aspo on HL-60 cells survival rate(x,s,n=3),*,p0.05,*,p0.01,vs,Ccontrol,p0.05,p0.01,vs,Nspo,Group Survival rate(%),24 h 48h,Control 98.70 0.70 98.28 0.45,Nspo 98.59 0.60 97.47 0.47,Aspo5.0 96.77 0.47,*,95.05 0.24,*,Aspo10.0 92.63 1.16,*,89.08 1.20,*,Aspo15.0 82.61,0.85,*,77.71,0.77,*,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第34页,Fig1.Effect of Aspo on HL-60 cells survival rate,(x,s,),survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第35页,结果,(2),TUNEL,法检测,HL-60,凋亡细胞及其凋亡指数,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第36页,Photo2.control group(DAB400),survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第37页,Photo3.Nspo group(DAB400),survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第38页,Photo4.Aspo5.0 group(DAB400),survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第39页,Photo5.Aspo10.0 group(DAB400),survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第40页,Photo6.Aspo15.0 group(DAB400),survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第41页,GroupApoptotic index(%)P,C N,Control 2.16 0.29,Nspo 2.21 0.25,Aspo 5.0 4.77 0.42,*,Aspo10.0 10.63 0.99,*,Aspo15.0 21.67 1.95,*,*,p0.05,*,p0.01,vs,Ccontrol,；,p0.05,p0.01,vs,Nspo,Tab3,.,Apoptosis,index of HL-60cells(x,s,n=3,),survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第42页,结果,(3),Aspo,处理,HL-60,细胞,survivinmRNA,表示改变,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第43页,Fig2.survivin mRNA expression of HL-60 cells treated by Aspo for 48 hours detected by RT-PCR,1:100 bp DNA ladder;2:Control;3:Nspo group;4:Aspo5.0 group;5:Aspo 10.0 group;6:Aspo 15.0 group.,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第44页,Tab4.effect of Aspo on survivin mRNA expression of HL-60 cells,(,x,s,n=3,),*,p0.05,*,*,p0.01,vs,Ccontrol,；,p0.05,p0.01,vs,Nspo,Group,survivin/,-actin,P,C N,C,Nspo,Aspo5.0,Aspo10.0,Aspo15.0,0.8120.006,0.8180.005,0.7800.005,0.5980.008,0.4960.012,*,*,*,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第45页,结果,(4),流式细胞仪凋亡率检测,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第46页,Tab.5 Effect of different doses of Aspo on HL-60 cells apoptosis,(x,s,n=3,),*,p0.05,*,p0.01,vs,Ccontrol,；,p0.05,p0.01,vs,Nspo,Group,Apoptosis rate(%),P,C N,C,Nspo,Aspo5.0,Aspo10.0,Aspo15.0,1.090.49,1.620.34,2.670.56,5.750.90,19.800.30,*,*,*,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第47页,Fig.5 Apoptosis peak measured by flow cytometry of HL-60 treated with survivin Aspo,A:control B:survivin Nspo C:survivin Aspo,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第48页,讨 论,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第49页,细胞凋亡机制研究进展,：,细胞凋亡,:,又称程序性细胞死亡（,programmed cell death,PCD,）,由,Caspases,（即含半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶）家族组员介导蛋白酶级联反应过程,凋亡机制,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第50页,凋亡提呈,:,驱动性,Caspases,凋亡实施,:,效应性,Caspases,凋亡机制,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第51页,Survivin,与白血病关系,Survivin,在各种白血病中都有表示，伴随病情缓解,survivin,表示也降低。且有研究发觉,survivin,低表示白血病患者，其完全缓解率及存活率高，而,survivin,高表示患者不易缓解，且易复发,survivin mRNA,表示与白血病诊疗、治疗转归及预后判断亲密相关,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第52页,急性早幼粒细胞,白血病介绍,白血病是常见恶性肿瘤之一，发病率,2.76,10,万。,在恶性肿瘤死亡率中，白血病居第,6,位（男性）和第,8,位（女性），在儿童及,35,岁以下成人中则居第,1,位,26,急性早幼粒细胞白血病（,APL,）组成比约占急性白血病,1015%,其临床特征之一是严重出血，所以早期病死率高。,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第53页,急性早幼粒细胞,白血病治疗现实状况,联合化疗：,缓解率可达,6080%,非特异性细胞毒性，抑制患者造血功效和免疫功效,其毒副作用不但造成患者治疗相关性死亡，而且影响其,“,治愈,”,剂量临床应用。另外，因为白血病细胞对化疗药品耐药，多数病人最终复发。,伴随分子生物学技术发展和对白血病发生、发展分子机理认识深入，使白血病研究进入了基因治疗新阶段。,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第54页,Survivin,作为靶基因思索,作为白血病反义治疗理想靶基因必须具备以下两个条件：,在肿瘤发生过程中起关键作用；,只有在肿瘤中表示，而在正常组织中不表示。,survivin,基因治疗含有良好,靶向性、特异性及安全性,Survivin,作用于细胞凋亡中关键酶,-Caspase-3,Survivin,表示,普遍性,和,独特征,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第55页,细胞凋亡诱导物,病毒感染,射线,DNA,损伤,死亡信号,survivin,活化,Caspase-3,细胞凋亡,Caspase-3,是细胞凋亡蛋白酶级联反应必经之路，是细胞凋亡中关键酶，而本试验所选取,survivin,基因能直接或间接抑制,Caspase-3,活化，所以含有强大抗凋亡作用,因为,survivin,抑制细胞凋亡功效活性在肿瘤发生、发展中起关键性作用，,survivin,在,白血病细胞重新表示可能是促成白血病发生主要原因，,survivin,可能是一个新癌基因,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第56页,反义核酸序列选定,针对,survivin,基因翻译起始密码子和前几位编码序列设计并合成,磷酸二酯键受核酸酶作用,，轻易被,降解,，,虽能用病毒载体将其转入细胞内，但考虑到安全性和临床应用，采取,是对磷酸二酯键磷原子进行硫代修饰，,硫代磷酸寡核苷酸,有好溶解性、杂交性和稳定性，,并能诱导,RnaseH,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第57页,survivin,对,HL-60,细胞凋亡诱导作用,凋亡特征,TUNEL,法能在,3,，,-OH,末端经过产生很强颜色反应（棕褐色）准确定位凋亡细胞；特异性高，敏感性强，可量化凋亡细胞。,细胞凋亡时染色体断裂，,DNA,被裂解，细胞膜通透性增加，在细胞洗染过程中，,DNA,碎片逸出，胞内,DNA,含量显著降低，,DNA,组方图上在,G,1,/G,0,峰前出现了特征性亚二倍体峰，即凋亡峰。,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第58页,凋亡,DNA,断裂,特征性改变是内源性核酸酶激活将,DNA,双螺旋结构由核小体间连接区断裂，形成以,180210bp,或其多聚体组成寡核苷酸片断，从而产生,3,，,-OH,末端。,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第59页,经,Aspo,处理后,HL-60,细胞经,TUNEL,染色均可见到阳性,凋亡,细胞，,DNA,组方图上在,G,1,/G,0,峰前出现了特征性亚二倍体峰，表明,survivin,Aspo,能够特异性诱导,HL-60,细胞凋亡,RT-PCR,试验显示,本试验所选取这段反义核酸特异性抑制,survivin,基因表示，提醒可能因为降低了,H,L-60,细胞内,survivin mRNA,含量,，从而诱导,HL-60,细胞,凋亡,survivin,对,HL-60,细胞凋亡诱导作用,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第60页,survivin,对,HL-60,细胞凋亡诱导作用,台盼兰拒染试验、,TUNEL,凋亡指数分析与流式细胞术所检测出细胞凋亡率均提醒,Aspo,浓度不一样，所造成细胞凋亡程度亦有不一样,伴随,Aspo,浓度升高，细胞凋亡程度增高,其,Aspo,对,HL-60,细胞,survivin,基因表示抑制效果也呈递加趋势。,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第61页,反义,survivin,可能作用机制,激活核糖核酸酶,H,，,剪切靶,mRNA,；占领,抑制,survivin mRNA,翻译,妨碍前体,mRNA,成熟其向胞浆转运,妨碍,DNA,双链复制与转录,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第62页,本试验证实了,survivin,基因在急性早幼粒细胞系,HL-60,细胞再开放与重新表示，靶向,survivin,一段特定反义硫代寡聚脱氧核苷酸能够降低,HL-60,细胞中,survivin mRNA,表示，从而诱导,HL-60,细胞凋亡，其作用有浓度和时间依赖性特点。为临床应用靶向,survivin,反义核酸疗法提供了理论支持。,小结与展望,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第63页,小结与展望,动物试验,临床试验,靶向,Survivin,基因治疗,细胞试验,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第64页,致 谢,感激恩师,毕富勇,教授。感激您对我学业上指导和生活上关心。本论文从选题设计、科研实践到论文撰写全过程倾注了您大量心血；您严谨治学精神、正直为人将是我终生学习榜样，您循循善诱教诲、父亲般关心将使我永远难忘,感激导师汪萌芽教授，您在科研工作上一丝不苟认真态度将使我受益终生,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第65页,致 谢,感激吕俊、吴明彩、方基勇、陈祥攀等老师在试验中对我大力支持,感激陈文魁教授和唐小牛老师对试验给予热心指导,感激赵向中、刘正同学、齐世美师妹在试验完成过程中给予帮助,感激郭平实老师为我付出时间和精力,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第66页,致 谢,感激父母二十六年养育之恩！,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究专家讲座,第67页,