复合杂合突变导致遗传性蛋白C缺陷症一家系调查.pdf

：调查研究复合杂合突变导致遗传性蛋白 缺陷症一家系调查孙维杰，徐琦煜，王峰，徐全军，周伟，陈慧敏，牧启田（宁波大学附属第一医院检验科，浙江宁波；温州医科大学附属第一医院医学检验中心，浙江温州）摘要：目的 调查复合杂合突变导致遗传性蛋白 缺陷症家系的临床特征与基因突变情况，并分析其基因型与临床表型的关系。方法 采集先证者及其家系成员（代 人）外周静脉血，检测蛋白 活性、蛋白 活性和抗凝血酶活性等指标以明确表型诊断。采用 对先证者 基因所有外显子及侧翼序列进行扩增，产物纯化后进行直接测序。运用 软件分析突变的保守性；使用在线生物信息学软件预测突变的致病性。结果 家系中有 人存在遗传性蛋白 缺陷症，先证者临床表现为肺栓塞和下肢深静脉血栓栓塞，其他家系成员无明显的血栓形成事件表现。基因测序发现先证者 基因第 号外显子存在 杂合错义突变（）和 杂合缺失突变（），其父亲为突变杂合子，母亲和妹妹为 突变杂合子。保守性分析显示 和 在同源物种间均高度保守，生物信息学软件预测该 个突变位点均为有害突变。结论 该遗传性蛋白 缺陷症家系存在 杂合错义突变和 杂合缺失突变，该复合杂合突变可能引起先证者蛋白 活性明显降低，从而导致反复深静脉血栓栓塞和肺栓塞。关键词：遗传性蛋白 缺陷症；基因突变；易栓症；肺栓塞中图分类号：文献标志码：，（，；，）：，（）（），：；蛋白（，）作为机体内重要的生理性抗凝物质，是一种维生素 依赖性丝氨酸蛋白酶原，主要由肝细胞合成并以一种无活性酶原的形式释放至血浆中。缺陷症的诊断主要依靠实验室检查，如 活性（：）和 抗原（：）的测定。包括、蛋白（，）以及抗凝血酶（，）在内的生理性抗凝蛋白缺陷是遗传性易栓症的主要病因。缺陷症导致的家临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，基金项目：浙江省自然科学基金（）。作者简介：孙维杰，年生，男，主管技师，大学本科，主要从事临床血液学检验研究。通信作者：牧启田，主任技师，：。族性易栓症由 等于 年首次报道，之后越来越多的研究证实 缺陷症是易栓症的高危因素。这类疾病的临床表现主要以静脉血栓栓塞为主，其中深静脉血栓栓塞和肺栓塞最常见。本研究旨在观察并分析复合杂合突变导致遗传性 缺陷症家系的临床特征以及 基因的突变情况。资料与方法 病历资料先证者男，岁，年 月因“肩肋部疼痛，咳嗽伴痰中带血”就诊于温州医科大学附属第一医院。追问有无出血史或血栓史，得知先证者 年前曾因肠系膜静脉血栓形成在宁波大学附属第一医院血管外科保守治疗好转后出院，出院后间断口服利伐沙班进行抗凝治疗。常规凝血检查示先证者：降至（参考区间），初步诊断为 缺陷症。其父母和妹妹肺动脉造影及双下肢深静脉 超检查均未发现异常。本次住院时先证者及其家系成员均进行血浆 水平及 基因检测。选择温州医科大学附属第一医院 年 月至 月就诊且无肝肾功能异常，无出血及血栓史的体检健康者 例作为健康人对照，其中男 例，女 例，年龄 岁（中位年龄 岁）。所有受试者均签署知情同意书，并经宁波大学附属第一医院医学伦理委员会批准（伦审）。该先证者家系图谱见图。图 遗传性 缺陷症家系图主要仪器及试剂 全自动血凝仪（法国 公司），超微量分光光度计（美国 公司），扩增仪、测序仪（美国 公司）。、和：凝血试剂（法国 公司），提取试剂盒（北京天根生化科技公司）。样本采集和处理 采集先证者及家系成员就诊时的空腹外周静脉血 ，枸橼酸钠 抗凝，、离心 ，离心后上层乏血小板血浆立即用于检测各项凝血指标；其余部分按照 提取试剂盒说明书提取外周血单个核细胞的基因，并置于 保存。实验室表型检测 按照 全自动血凝仪说明书，采用凝固法检测血浆凝血酶原时间（，）、活化部分凝血活酶时间（，）、纤维蛋白原（，）和 活性（：），发色底物法检测：和 活性（：）。提取及基因测序分析 提取先证者及家系成员基因组，使用 超微量分光光度计检测基因组 的纯度和浓度，取纯度（）约为，浓度为 的 样本，置于 保存。扩增先证者 基因（：）所有外显子及侧翼序列，利用（：）设计引物，并由上海桑尼生物技术有限公司合成，引物序列见表。反应体系为，包括 ，双蒸水，模板 ，上、下游引物各 。扩增反应条件：预变性；变性 ，根据不同引物的退火温度相应退火 ，延伸 ，共 个循环；延伸 。扩增产物经 琼脂糖凝胶电泳进行特异性鉴定，紫外光下观察为单一明亮条带。电泳阳性产物经纯化后送上海桑尼生物技术有限公司测序。表 基因引物序列外显子引物序列（）扩增长度（）退火温度（）：、：临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，生物信息学分析应用多序列比对软件 对多种同源性物种氨基酸突变位点的保守水平进行研究。同源性物种的氨基酸序列来源网址：；使用在线生物信息学软件 （：）预测突变的致病性。结果 凝血指标检测结果 先证者常规凝血指标检查、：及：均在参考区间内，二聚体（）为 ，：降至。先证者的父亲、母亲和妹妹的：分别降低至、和。先证者及其家系成员实验室表型检测结果见表。表 遗传性 缺陷症家系成员表型和基因型检测结果家系成员年龄（岁）（）（）（）（）：（）：（）：（）先证者（）外祖父（）父亲（）母亲（）妹妹（）参考区间 基因测序结果先证者 基因第 号外显子 存 在 杂 合 错 义 突 变 导 致和 杂合缺失突变为，其父亲为 突变杂合子，母亲和妹妹为 突变杂合子，外祖父为野生型，见图。生物信息学预测结果保守性分析显示，和 在同源物种间高度保守（图）；软件预测 杂合错义突变和 杂合缺失突变均为有害突变，得分分别为 分和 分（得分 分为有害突变；分为中性突变）。注：，野生型；，先证者 杂合缺失突变正向测序结果；，先证者 杂合缺失突变克隆测序结果；，野生型；，先证者 杂合错义突变正向测序结果；，先证者 杂合错义突变反向测序结果；箭头所指位置为突变位点。图 基因第 号外显子测序结果图 （）和（）位点保守性分析结果 讨论 近年来，随着检验技术和手段的进步，缺陷症的发病率逐年升高，杂合子型携带者在人群中的发病率为，而纯合子型在人群中的发病率约为 万 万。截止至 年 月，人类基因突变数据库（，）记录了 多个 基因突变，其中错义 无义突变占主要部分。本例先证者基因测序发现 基因第 号外显子存在 错义突变和 缺失突变。错义突变在 数据库中的编号为，数据库、数据库以及 数据库显示此错义突变在人群中的突变频率分别为、及 。缺临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，失突变在 公开版数据库中已有收录该位点 缺陷症的致病性报道（：）。临床上根据 活性和抗原降低水平的不同，缺陷症分为两种类型：型指 合成减少，即血浆 活性和抗原含量同步降低；型指合成了异常的 分子，即 活性水平降低，但抗原含量正常或增高。型又可以进一步分为 型和 型；其中 型指抗原含量正常，抗凝活性及酰胺水解活性降低；型指抗原含量正常，抗凝活性下降。约 的 缺陷症患者属于 型，是静脉血栓形成公认的危险因素；型 缺陷症约占，其中 型 缺陷症十分罕见。多项文献报道，错义突变引起 型 缺陷症；缺失突变引起 型 缺陷症。本例先证者既往有血栓史，胸部 肺动脉造影显示肺栓塞，下肢静脉造影提示下腔静脉及右髂总静脉、两侧髂内静脉血栓形成，：降至，基因第 号外显子存在复合杂合突变，保守性分析结果显示 和 位点在同源物种间均高度保守，表明该 个位点氨基酸是 蛋白发挥正常作用的重要功能位点；生物信息学软件预测 错义突变和 缺失突变均为有害突变，推测该复合杂合突变可能导致蛋白质合成减少、稳定性下降或分泌障碍，引起血浆 水平降低，是导致患者发生肺栓塞的重要原因之一。其他家系成员为单杂合突变且：略有降低，目前尚无血栓形成事件发生。结合本案例，先证者有肠系膜静脉血栓史，应引起临床医生的高度重视，对于无明显诱因反复发作或发病年龄较低的静脉血栓栓塞患者，应进行：、：和：的普查以及血栓相关基因检测（基因、基因及 基因）。确定存在生理性抗凝蛋白缺陷，则需进一步对家系其他成员进行相关基因筛查。和 都属于维生素 依赖的蛋白质，对于遗传性 缺陷症患者推荐使用利伐沙班等新型抗凝药物进行治疗，对于确诊易栓症的患者，建议终生抗凝治疗以预防血栓性疾病的发生，对于未发生血栓形成事件的遗传性 缺陷症携带者，是否进行抗凝治疗来预防血栓栓塞，目前尚无定论。参考文献刘斯奇，余芳，罗莎莎，等 一个杂合缺失变异致遗传性蛋白 缺陷症家系的表型和基因型分析 中华医学遗传学杂志，（）：，（）：，（）：，（）：赵晓宇，郑锐 遗传性易栓症危险因素的研究进展 中国全科医学，（）：，（）：，（）：（收稿日期：）（本文编辑：许晓蒙）临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，