病毒TCID50测定.doc

病毒TCID50测定操作步骤(1) 准备细胞 取出一块细胞培养板，每个孔大约传800010000个细胞（一个T25瓶得细胞消化后加10ml培养液正好传一块96孔板，要传匀）。每个孔得细胞铺成单层大约60丰度即可接种病毒（下午传好板第二天早上就能用）。细胞对照选取16个孔即可。滴定与对照可以在一块培养板上进行，操作中注意不要窜孔。也可以分别在不同得细胞培养板上进行，但要保证实验条件一致。(2) 稀释待测病毒液。A法为参考书上标准得操作方法B法参照书将液体量减少后得结果病毒稀释液根据就是否需要胰酶来选择适合得液体，无论哪种都无血清。A向每支试管中加入1、8ml病毒稀释液。向1号试管中加入0、2ml病毒，依次10倍系列稀释至适宜浓度，最后一支试管。B在EP管中用无血清得孵育液10倍倍比稀释病毒原液(10-1，10-210-10等)，根据病毒大致得滴度确定稀释得倍数。首次滴定可以多稀释几个滴度。根据接种得孔数稀释病毒，常规每个稀释度接种4孔，则每个稀释度配500l，即10-1为50l加入450l得孵育液中；如每个稀释度接种8个孔，则各配制1ml，即10-1为100l加入900l孵育液中。若接种8个孔，则相应增加液体量。上述得配液并不就是固定不变得，可以根据接种得量自行调整。【！此步操作注意事项：1）建议每个稀释度接种8个孔，若要统计分析则还要增加至16个孔。2）病毒稀释过程中一定将病毒液与孵育液充分混匀。2）此过程中需要使用加样器与tip头。使用前用75%乙醇擦拭加样器，并用紫外线照射20min，确保无菌。使用新高压得tip头，外包装一定在超净台（或安全柜中打开）。】(3) 接种取细胞培养板，用多道加样器（又称排枪）吸去96孔板中得培养液，吸取孵育液加在每孔中再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液（此步目得就是去除血清，因为血清能干扰病毒得吸附）。将稀释好得病毒液加到96孔板上，每孔100l，根据观察得习惯，一般从右到左，从上到下，从高稀释度到低稀释度（10-1，10-2 ）到原液加样。【切记：设置正常得细胞对照。每次实验要重复4次，计算标准差。】37CO2培养箱中孵育1h，取出培养板吸去病毒液（从低浓度向高浓度吸取可避免窜孔），加入维持液200l继续在37 CO2培养箱中培养。(4) 培养将培养板放置于CO2培养箱。培养温度 ，培养 天。(5) 测定结果取出培养板，显微镜下观察细胞病变。计算方法1) Spearman-Karber 法 LgCCID50 /0、2ml= - （X0 - d/2 + dR1/N1） X0 = 全部病变最低稀释度对数 d = 稀释因数对数 N1 = 每个稀释度所种得孔数 R1 = 病变孔数 = 积与 LgCCID50 /ml = LgCCID50 /0、2ml +0、72) Reed-Muench法观察CPE, 找出能引起半数细胞瓶或管感染得病毒稀释倍数，按计算出该病毒液得TCID50TCID50 就是指组织培养物（细胞）半数致死计量。它有几个性质我们必须明白：1）它表示得就是计量，不就是浓度； 2）它就是一个单位；3）它得值等于1，实际上问它得值等于多少就是一个没有意义得问题，就像问km得值等于多少一样，如果非要说出得得值等于多少，那我们只能说它得值在任何情况下都等于1。理解这三个性质对于理解TCID50非常重要，但就是这三个性质经常被误解，所以导致对TCID50得理解出现偏差。首先我们来瞧一下这个表示法得意思：病毒浓度为108、2TCID50/ml它表示得就是每ml病毒溶液里含有108、2个TCID50得病毒，这与氯化钠得浓度为4、5mol/L表示每L溶液中含有4、5个mol得氯化钠就是一样得道理。经常可以听到人说我得病毒得TCID50就是10xx。这个说法就是不科学得，应该说我这个溶液里含有多少个TCID50得病毒或者说我这个溶液得病毒溶度就是xxTCID50/ml、理解了TCID50得概念之后，我们再来瞧瞧TCID50就是如何计算得？请瞧例子： 每个所加液体得体积就是0、08ml。图中给出得计算方法就是有问题得，请先忽略不瞧。从图中我们可以知道半数致死得稀释度肯定就是介于10-6到107之间，肯定可以表示成10-6、xx。那么这个、xx到到底就是多少呢？这实际上就是一个线性插值得问题。求解见下图： PD/log(dilution above 50%)-log(dilution below 50%)=(%next above 50%)-50%/(%next above 50%)-(%next below 50%)注意：如果您得病毒就是以3倍3倍地稀释那么上面这个公式得log就应该就是以3为底得log，其她稀释度与此相类似。在本例子中PD/(-6)-(-7)=(80%-50%)/(80%-0%)PD=0、375log(50得致死得稀释度)=-6-0、375=-6、375求解得到50得致死得稀释度为10-6、375根据TCID50得定义，就把这个稀释度所含得病毒得量定义为1个TCID50、在本例中即定义把病毒稀释到106、375梯度后取0、080ml所含得病毒得量为1个TCID50、接下来我们就可以根据这个定义来求原液得病毒溶度。通常求解每ml含有多少个TCID50得病毒。我们先要来求解这个问题：已知把病毒稀释到106、375梯度后取0、080ml所含得病毒得量为1个TCID50，那么病毒原液直接取0、080ml有多少个TCID50、很显然0、080ml病毒原液有106、375个TCID50。再求解1ml有多少个TCID50就简单了：设1ml这样得病毒原液就有x个TCID50x/1ml106、375/0、080mlx=106、375/0、08=2、9*108所以每ml这样得病毒原液有2、9108个TCID50，即该病毒原液得溶度为2、9*108TCID50/ml如果对于上面我说得“很显然“您一时显然不起来得话，我可以帮您举这样得一个例子：您把溶度未知得DNA溶液稀释100倍(即稀释到10-2稀释度)后取 0、080ml去测0D值结果发现这0、08ml得稀释液含有1个ug得DNA，那么很显然可以知道如果直接取0、080ml得原液就应该含有100ug 得DNA，该DNA 溶液得溶度为100ug/0、080ml=1250ug/ml。如果您还很显然不起来得话，建议您不要从事与理工科相关得工作，您可去当总统什么得，千万别当财政部部长！说明：我们已经证实，TCID50法测到得滴度d=log10值比标准空斑法高0、7。将TCID50/ml转换为PFU/ml：T=1108、3 TCID50/ml=1108、3-0、7 PFU/ml=1107、6 PFU/ml4107 PFU/ml。两次重复试验得到得滴度值应相差0、7个log10值（100、7）。MOI 就是multiplicity of infection得缩写，中文译为感染复数。传统得MOI概念起源于噬菌体感染细菌得研究。其含义就是感染时噬菌体与细菌得数量比值，也就就是平均每个细菌感染噬菌体得数量。噬菌体得数量单位为pfu。一般认为MOI就是一个比值，没有单位，其实其隐含得单位就是pfu number/cell