凤香型白酒窖泥细菌群落结构分析.pdf

凤香型白酒窖泥细菌群落结构分析*白莉圆，赵帅，魏子怡，金成勇*(陕西西凤酒股份有限公司，陕西凤翔721406)摘要:窖池中的窖泥作为微生物的主要载体在白酒酿造过程中发挥着至关重要的作用。以凤香型白酒窖泥为研究对象，采用高通量测序技术结合荧光定量 PCR 法解析窖壁泥和窖底泥中细菌生物量、细菌群落结构及多样性。结果表明：窖泥中细菌的生物量在 1081010copies/g 窖泥之间，窖底泥中细菌的生物量高于窖壁泥。窖壁泥和窖底泥中细菌群落的丰富度差异不大，结构组成存在差异。窖壁泥、窖底泥中检测的细菌种群可分别归属于 34个、37 个细菌门，各有 4 个、6 个优势细菌门，其中厚壁菌门 Firmicutes 为绝对优势细菌门，相对丰度分别是 64%、65%；可分别归属于 719 个、627 个细菌属，各有 10 个、12 个优势细菌属，其中乳杆菌属为窖壁泥中绝对优势细菌属，相对丰度达 45%，为窖底泥中第一优势细菌属，相对丰度达 22%。关键词：凤香型白酒；窖泥；微生物群落；高通量测序中图分类号：TS262.3；TS261.13文献标识码：BAnalysis of Bacterial Community Structure in Pit Mud of Feng-flavorBaijiu*BAI Liyuan,ZHAO Shuai,WEI Ziyi,JIN Chengyong*(Xifeng Distillery Co.,Ltd.,Fengxiang 721406,Shaanxi,China)Abstract:Pit mud plays an important role in the fermentation process of baijiu.In this study,we used high-throughput sequencingtechnology and qPCR to analyze the difference in the bacterial biomass,microbial community structure,and diversity in the wall and bottompit mud.The results showed that the bacterial biomass was ranged from 108to 1010copies/g in pit mud,furthermore,the bacterial biomass inthe bottom pit mud was higher than that the wall pit mud.The abundance of bacterial communities has no significant difference between thewall and bottom pit mud,but there were differences in structural composition.The bacterial populations detected in the wall and bottom pitmud could be assigned to 34 and 37 bacterial phylum,with 4 and 6 dominant bacterial phylum each,respectively.Moreover,Firmicutes wasthe absolute dominant bacterial phyla with a relative abundance of 64%and 65%,respectively.And the bacterial populations detected in thewall and bottom pit mud could be ascribed to 719 and 627 bacterial genera,with 10 and 12 dominant bacterial genera each,respectively.Inaddition,was the absolute dominant bacterial genus in the well pit mud,with a relative abundance of 45%,andwas the first dominant bacterial genus in the bottom pit mud,with a relative abundance of 22%.Key words:Feng-flavor Baijiu;Pit mud;Bacterial community;High-throughput sequencing凤香型白酒酿造用的窖池中富集了大量的厌氧微生物1，窖池中的窖泥作为微生物的主要载体，在发酵过程中进行着复杂的能量与物质代谢，发挥着重要的作用2,3。细菌菌群可代谢多种酶类并积累一些香味物质达到增香效果4-6，因此，对窖泥中细菌群落结构组成的分析是了解凤香型白酒酿造微生物菌群代谢特征，解析凤香型白酒发酵机理的重要前提和基础。传统的微生物计数方法局限性大，无法真实有效地反映出白酒发酵体系中微生物的复杂多样性7。荧光定量 PCR 法具有特异性强、重复性好、定量准确等优点，蔚慧欣等8研究采用实时荧光定量聚合*基金项目：陕西省科协企业创新争先青年人才托举计划项目收稿日期：2023-01-30作者简介：白莉圆（1995-），女，硕士研究生，中级工程师，研究方向为白酒酿造微生物。*通信作者：金成勇（1985-），男，研究生，中级工程师，研究方向为白酒微生物应用。邮箱：。文章编号:1002-8110（2023）05-0089-07第 50 卷 第 5 期2 0 2 3 年 9 月酿酒LIQUORMAKINGVol.50.5Sep.，202389酶链式反应对发酵过程中酒醅样品进行总细菌、总真菌、耐酸乳杆菌、芽孢杆菌和酵母菌的定量分析，发现汾酒发酵过程中耐酸乳杆菌和酵母为酒醅中的主体微生物，占总细菌和总真菌总和的 80%以上。高通量测序技术具有高通量、高分辨率的优势，能更可靠、更直接地反映出微生物的群落结构及多样性9,10，在窖泥微生物中的研究中被广泛应用。翟磊等11利用高通量测序技术全面解析宜宾产区浓香型白酒酿造生境中的微生物菌群结构；TAO Y 等12利用宏基因组和高通量测序技术研究了 25 年和 50年窖泥中活跃微生物，发现原核微生物为主占95.3%，而真核微生物丰度仅为 1.8%；蔡雪梅等10比较 4 种不同区域人工窖底泥的细菌多样性，结果表明不同区域的窖底泥理化性质及细菌群落结构存在一定差异，且距离越远差异越大；张会敏等13分析了新老窖池的池底泥和池壁泥的原核菌群结构，发现新窖池池壁泥中的菌群结构最单一，主要为乳酸杆菌属和产己酸菌属，其次为新窖池的池底泥、老窖池的池壁泥和老窖池的池底泥。为探索凤香型白酒一个生产周期内不同生产阶段窖泥中细菌的组成，本研究运用高通量测序技术结合荧光定量 PCR法分析窖壁泥和窖底泥中细菌的多样性及群落结构，以期阐明凤香型白酒窖泥细菌菌群组成，为提高凤香型白酒基酒品质提供理论依据。1材料与方法1.1材料1.1.1样品取样地点：陕西西凤酒股份有限公司 903 制酒车间重点窖。取样时间：一个生产周期，即“立窖、破窖、顶窖、圆窖、插窖、挑窖”六个阶段，每个阶段取入池时的窖壁泥和窖底泥，标记为 LJBN、LJDN、PJBN、PJDN、DJBN、DJDN、Y1JBN、Y1JDN、Y2JBN、Y2JDN、Y3JBN、Y3JDN、Y4JBN、Y4JDN、Y5JBN、Y5JDN、CJBN、CJDN、TJBN、TJDN，共计 20 个窖泥样本。取样方法：窖壁泥取样时选择窖池壁四个方位中层分别取样，然后将四周样品混合均匀后贮存备用；窖底泥取样时选择窖池底部四角及对角线交点处取样，然后将样品混合均匀后贮存备用。1.1.2仪器设备PTX-JA1000 型电子天平，福州华志科学仪器有限公司；QL-861 旋涡震荡器，江苏省海门市麒麟医用仪器厂；SW-CJ-2D 洁净工作台，苏州净化设备有限公司；EDC-810 型普通 PCR 仪，北京东胜创新生物科技有限公司。1.2试验方法1.2.1荧光定量 PCR 分析绝对定量 PCR 技术是利用已知拷贝数的标准品作出标准曲线，通过测定样本的 Ct 值，从标准曲线上计算出该样本的拷贝数。拷贝数（X0）计算方法：Ct=-K logX0+b注：K 表示标准曲线斜率，b 表示标准曲线截距每克样品拷贝数=X050L（洗脱体积）/称重1.2.2微生物多样性检测将窖泥样本送至上海派森诺科技生物有限公司，利用 Illumina 平台进行高通量测序分析。2结果与分析2.1窖泥定量分析细菌的标准曲线为：y=-3.32x+36.36，相关系数R2=0.9983，扩增效率 E 为 100%，说明标准曲线线性良好，可以用于荧光定量分析14,15。依据标准曲线计算各窖泥样本的细菌 16S rRNA 基因拷贝数，结果如图 1 所示。在整个生产周期内，窖泥细菌的生物量在1081010copies/g 窖泥之间。窖壁泥细菌的生物量在立窖时较高，达到了 108.83copies/g 窖泥；破窖、顶窖时较少，分别是 108.16、108.2copies/g 窖泥；圆窖 1 排、圆窖2 排、圆窖 3 排在 108.6copies/g 窖泥左右；圆窖 4 排、圆窖 5 排、插窖、挑窖时较高，均大于 108.7copies/g 窖泥。窖底泥细菌的生物量在前期（立窖、破窖、顶窖、圆窖 1 排、圆窖 2 排、圆窖 3 排）较低，除破窖时达到 109.09copies/g 窖泥外均小于 109copies/g 窖泥；后期（圆窖 4 排、圆窖 5 排、插窖、挑窖）较高，在109.5copies/g 窖泥左右。整体来看，经过一轮生产，图 1窖泥中细菌的荧光定量 PCR 结果第五期2023酿酒90白莉圆，等：凤香型白酒窖泥细菌群落结构分析*第五期2023窖泥中细菌的生物量呈上升趋势，窖底泥中细菌的生物量高于窖壁泥，均在挑窖时达到最大值（109.66、109.13copies/g 窖泥）。2.2窖泥细菌群落结构分析经细菌 16SrRNA 基因测序，20 个窖泥样本共获得 1210586 条高质量序列，平均每个样本 60529条序列，其中最少 44056 条，最多 80816 条序列，所有细菌序列可归类为 25457 个 ASV。2.2.1Alpha 多样性分析通过 Illumina 高通量测序对 20 个窖泥样本进行细菌 Alpha 多样性分析，结果如下。表 1 中 Good scoverage 指 数 的 数 值 在0.9712180.995864 之间，表明样本中未被检测出的物种所占的比例较少，本次测序结果能完整反映窖泥中细菌种群的真实情况16,17。Chao1 和 Observedspecies 指数数值越大，表明群落的丰富度越高。LJBN 的 Chao1 和 Observed species 指数数值最大，表明 LJBN 中包含物种的数目最多，细菌种群丰富度最高；圆窖期窖泥的 Chao1 和 Observed species指数数值较小，表明圆窖期窖泥样本丰富度较低。Shannon 和 Simpson 指数数值越大，表明群落的多样性越高。LJBN 的 Shannon 和 Simpson 指数数值最大，说明 LJBN 中细菌多样性最高；圆窖期窖泥的Chao1 和 Observed species 指数数值较小，表明圆窖期窖泥样本多样性较低。Alpha 多样性分析结果表明：窖壁泥和窖底泥中细菌的丰富度、多样性差异不大。LJBN 包含的细菌物种的数目最多、多样性最高。圆窖期窖泥样本中细菌的丰富度和多样性较低，这可能是因为圆窖期窖壁泥中乳杆菌属 Lactobacillus、窖底泥中己酸菌属 Caproiciproducens 大量繁殖，导致其丰富度和多样性降低。2.2.2Beta 多样性分析图 2 是窖泥细菌种群 PCA 主成分分析图，两个主成分坐标轴 PC1 和 PC2 的累计贡献率为 87.9%，包含了原始数据 87.9%以上的信息，可以代表原始变量对其进行分析，达到了降维的目的18。表 1窖泥中细菌种群 Alpha 多样性指数Sample IDLJBNLJDNPJBNPJDNDJBNDJDNY1JBNY1JDNY2JBNY2JDNY3JBNY3JDNY4JBNY4JDNY5JBNY5JDNCJBNCJDNTJBNTJDNChao13910.292268.962346.712252.361961.342420.242329.31953.781066.711298.161693.97972.9531251.7829.318633.8861027.131395.172738.923014.762667.96Faith_pd202.625157.48158.591169.011126.126154.548137.052145.4779.5808105.46134.06285.194984.876673.214653.005379.521195.3513150.349163.613154.445Goods_coverage0.9712180.9860840.9849710.9852850.987640.9846590.9838690.9880150.9933490.9928710.9904510.994190.993240.9958640.9950920.9932890.9898940.9877420.9837940.98436Observed_species3437.61992.52005.32001.11711.32143.42000.41703.9918.61166.71511.18591154775.1514.8890.81157.62634.52843.52493.2Pielou_e0.8030230.7473890.7510320.7406170.6894980.7418530.6752530.6493630.3370840.6192470.7318450.4630140.5805070.5108910.1343380.424490.5165540.7086320.7320360.716619Shannon9.433258.191628.238478.122037.405788.209097.404826.970643.318016.308997.729284.512755.905144.903641.210094.159555.256898.05248.398988.08616Simpson0.9944450.9830190.984890.9847090.9673820.9822420.9483490.9510190.5113510.942140.9781950.8390140.9114260.8603650.1858730.7676780.8768780.9650670.9750740.97578图 2窖泥细菌种群 PCA 分析91图中蓝圈覆盖的为窖壁泥样本，其中 PJBN、DJBN、TJBN 样本分布比较集中，PJBN 位于主成分坐标轴的第三象限，DJBN 和 TJBN 位于第二象限；Y1JBN 和 Y3JBN 样本分布集中，位于主成分坐标轴的 第 四 象 限 距 离 原 点 较 近 处；Y2JBN、Y4JBN、Y5JBN、CJBN 样本集中分布于坐标轴一、四象限的正半轴上。红圈覆盖的为窖底泥样本，其中 LJDN、PJDN、CJDN、TJDN 样本集中分布于坐标轴的第三象限，DJDN 和 Y4JDN 样本分别位于第四和第一象限，而 Y1JDN、Y2JDN、Y3JDN、Y5JDN 样本集中分布于第二象限。整体来看，窖壁泥样本大部分位于坐标轴右侧，而窖底泥样本主要分布于坐标轴左侧，除 LJBN 和 LJDN 样本最为接近，细菌结构相似性较高外，其余阶段窖壁泥和窖底泥细菌结构组成差异较大，这与罗杰19等研究结果一致。2.2.3物种组成分析2.2.3.1基于门水平经 OTU 注释，10 个窖壁泥样本检测到的细菌种群可归属于 34 个门，其中 4 个细菌门较为丰富，平均相对丰度大于 1%，分别是厚壁菌门、变形菌门、放线菌门和拟杆菌门。由图 3 可知，在 9 个窖壁泥样本中均为第一优势菌门，相对丰度在 46%97%之间，是窖壁泥中绝对优势细菌门。其次是，在 LJBN 中为第一优势菌门，相对丰度达 57%，除 TJBN 外的其余 8 个窖壁泥样本中均是第二优势菌门。在 LJBN和 TJBN 中为第二优势菌门，相对丰度分别是 17%和 15%。经 OTU 注释，10 个窖底泥样本检测到的细菌种群可归属于 37 个门，其中 6 个细菌门较为丰富，分别是厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、放线菌门、绿弯菌门和。由图 4 可知，为窖底泥中绝对优势细菌门，在生产前期迅速增长，相对丰度由 36%增大至 97%，占据绝对优势，随后在插窖期和挑窖期下降，在 TJDN 中成为第二优势菌门。其次是，在生产前期减少，相对丰度由 32%减少至 10%，圆窖 3 排之后相对丰度很低，小于 1%。在 CJDN 中相对丰度达 43%，为第二优势菌门，在 TJDN 中相对丰度达 41%，为第一优势菌门。经 OTU 注释，20 个窖泥样本检测到的细菌种群可归属于 37 个门，其中 6 个细菌门较为丰富，分别是厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、放线菌门、绿弯菌门和。由图 5 可知，窖壁泥中优势菌门由高到低的顺序为：，其 中为绝对优势菌门，相对丰度达 64%。窖底泥中优势菌门由高到低的顺序为：，其 中为绝对优势菌门，相对丰度达 65%。综合来看，窖壁泥中检测的细菌种群可归属于34 个门，其中优势菌门 4 个；窖底泥中检测的细菌种群可归属于 37 个门，其中优势菌门 6 个；窖泥中检测到的细菌种群可归属于 37 个门，其中优势菌门 6 个。能产孢子休眠体，可抵抗极端条件，为窖泥中绝对优势细菌门。2.2.3.2基于属水平图 3基于门水平窖壁泥细菌群落结构分析图 4基于门水平窖底泥细菌群落结构分析图 5基于门水平窖泥细菌群落结构分析图 6基于属水平窖壁泥细菌群落结构分析第五期2023酿酒92经 OTU 注释，10 个窖壁泥样本检测到的细菌种群可归属于 719 个属，其中 10 个细菌属较为丰富，占相对丰度的 63%，分别是乳杆菌属、己 酸 菌 属、梭 菌 属_12、奇异菌属、魏斯氏菌属、片球菌属、固氮菌属、藤黄单胞菌属、放线菌属和芽孢杆菌属，属于厚壁菌门、变形菌门和放线菌门。由图 6 可知，不同阶段窖壁泥优势菌属不尽相同。LJBN 中细菌种类丰富，为优势菌属，相对丰度达 5%。TJBN 中为第一优势菌属，相对丰度达21%；其次是，相对丰度达 14%。其余 8个窖壁泥中为第一优势菌属，相对丰度在 12%96%之间，且在 Y2JBN、Y4JBN、Y5JBN、CJBN 中占绝对优势，相对丰度大于 75%。经 OTU 注释，10 个窖底泥样本检测到的细菌种群可归属于 627 个属，其中 12 个细菌属较为丰富，占 相 对 丰 度 的 55%，分 别 是 己 酸 菌 属、乳 杆 菌 属、WS6_()、假 单 胞 菌 属、梭菌属_12、互营单胞菌属、魏斯氏菌属、芽孢杆菌属和Christensenellaceae_R-7_group，属于厚壁菌门、拟杆菌门和。由图 7 可知，不同阶段窖底泥优势菌属差异较大。LJDN 中细菌种类丰富，和为优势菌属，相对丰度分别为 7%和 6%。Y1JDN、Y2JDN、Y3JDN 和 Y5JDN 中为第一优势菌属，相对丰度分别是 28%、40%、51%和 37%，其次是。PJDN、DJDN 和 Y4JDN 中为第一优势菌属，相对丰度分别是 15%、31%和 37%。CJDN、TJDN 中为第一优势菌属，相对丰度分别是 31%和 25%.经 OTU 注释，20 个窖泥样本检测到的细菌种群可归属于 845 个属，其中 10 个细菌属较为丰富，分 别 是 乳 杆 菌 属、己 酸 菌 属、梭 菌 属_12、魏斯氏菌属、奇异菌属、假单胞菌属、片球菌属、芽孢杆菌属、WS6_()。由图 8 可知，窖壁泥中优势细菌属由高到低的顺序为：_12，其中为绝对优势菌属，相对丰度达 45%。窖底泥中优势细菌属由高到低的顺序为：WS6_()，其中为第一优势菌属，相对丰度达 22%。综合来看，窖壁泥中检测的细菌种群可归属于719 个属，其中优势菌属 10 个；窖底泥中检测的细菌种群可归属于 627 个属，其中优势菌属 12 个；窖泥中检测到的细菌种群可归属于 845 个属，其中优势菌属 10 个。为窖壁泥中绝对优势细菌属，为窖底泥中第一优势细菌属。乳杆菌属、己酸菌属、梭菌属、魏斯氏菌属、芽孢杆菌属在窖壁泥和窖底泥中均是优势菌属（平均相对丰度大于 1%），然而这 5 类菌在窖壁泥和窖底泥中的丰度有一定的差异，其中乳杆菌属是窖壁泥中绝对优势菌属，己酸菌属是窖底泥中第一优势菌属。由图 9 可知，窖壁泥中乳杆菌属相对丰度由开始的 0.23%持续增长至 77.71%，在插窖时达到最大 值，随后 减少，成 为挑窖时 第 三 优 势 菌 属（10.99%）；己酸菌属无明显变化趋势，丰度在破图 7基于属水平窖底泥细菌群落结构分析图 8基于属水平窖泥细菌群落结构分析图 9属水平窖泥中细菌种群演替规律白莉圆，等：凤香型白酒窖泥细菌群落结构分析*第五期202393窖、顶窖和挑窖时较高，分别是 11.58%、14.02%和21.34%。窖底泥中乳杆菌属在生产前期（立窖、破窖、顶窖）时，相对丰度高于窖壁泥，且在顶窖时达到最大值（30.63%），随后减少，丰度低于窖壁泥；己酸菌属在圆窖时占主导地位，相对丰度达到38.13%，破窖、插窖时次之，分别是 13.59%和11.72%。梭菌属、魏斯氏菌属、芽孢杆菌属在多种香型白酒发酵中都有报道，也是白酒发酵过程中主要的功能细菌种群20,21。2.2.4物种差异分析图 10 为不同生产阶段窖泥属水平细菌群落结构花瓣图，由图可知，LJBN 和 LJDN 样本中独有的OTU 数目相对较多，除 Y3JBN 中 OTU 数目较多外，其它时期整体较立窖期少，说明立窖期窖泥中微生物数量较多，后期因环境等因素的影响，窖泥中微生物多样性减少。各个样本间共有的细菌属微生物有 6 个，分别为、_12、和。3结论本研究对凤香型白酒一个生产周期内窖壁泥和窖底泥细菌的生物量进行分析，结果表明，窖泥细菌的生物量在 1081010copies/g 窖泥之间，且窖底泥中细菌的生物量高于窖壁泥。通过高通量测序技术解析窖泥细菌多样性，结果表明，窖壁泥和窖底泥中细菌群落的丰富度差异不大，结构组成存在差异。经 OTU 注释，窖壁泥中共检测到 34 个细菌门和 719 个细菌属，窖底泥中共检测到 37 个细菌门和 627 个细菌属。、在窖壁泥和窖底泥中均是优势细菌门，其中为窖壁泥和窖底泥中绝对优势细菌门；Lactobacillus、Caproiciproducens、Clostridium_sensu_stricto_12、Weissella、Bacillus 在 窖壁泥和窖底泥中均是优势菌细属，其中 Lactobacillus为窖壁泥中绝对优势细菌属，Caproiciproducens 为窖底泥中第一优势细菌属。本文通过探究不同生产阶段窖壁泥和窖底泥中细菌生物量以及群落结构多样性，解析凤香型白酒窖泥中细菌的群落结构，为窖泥中细菌菌群的研究及提高凤香型白酒基酒品质提供理论依据。参考文献1Hu X,Du H,Ren C,et al.Illuminating anaerobic microbialcommunity and cooccurrence patterns across a quality gradient inChineseliquorfermentationpitmudsJ.AppliedandEnvironmental Microbiology,2016,82(8):2506-2515.2高占争,吴正云,张文学.浓香型白酒窖泥微生物群落研究进展J.中国酿造,2020,39(06):1-7.3Wang X,Du H,Xu Y.Source tracking of prokaryotic communi-tiesinfermentedgrainofChinesestrong-flavorliquor J.International Journal of Food 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和铵态氮的测定方法5-7，为窖泥质量的分析提供系统科学的方法规范，加快窖泥质量评价体系的构建的进程8-10，对浓香型白酒窖泥质量的提升研究工作有重大指导性的意义，有利于浓香型白酒品质提升和品质创新11-12。1材料与仪器1.1试剂和材料1.1.1水应符合 GB/T 6682 规定的至少三级的规格，并应除去二氧化碳。无二氧化碳水的制备方法：将水注入烧瓶中(水量不超过烧瓶体积的 2/3)，煮沸 10 min，放置冷却，用装有碱石灰干燥管的橡皮塞塞进。如制备 10 L20 L 较大体积的不含二氧化碳的水，可插入一玻璃管到容器底部，通氮气到水中 1 h2 h，以除去被水吸收的二氧化碳。1.1.2氯化钾溶液C(KCl)=l mol/L。称取 74.6 g 氯化钾溶于水，并稀释至 1 L。1.1.3氯化钙溶液C(CaCl2)=0.01 mol/L。称取 1.47 g 氯化钙(CaCl22H2O)溶于水，并稀释至 1 L。1.1.4pH 标准缓冲溶液以下 pH 标准缓冲溶液应用 pH 基准试剂配制。如贮存于密闭的聚乙烯瓶中，则配制好的 pH 标准缓冲溶液至少可稳定一个月。不同温度下各标准缓冲溶液的 pH 见表 1。收稿日期：2023-03-27作者简介：沈小梅（1989-），女，硕士，高级工程师，安徽古井贡酒股份有限公司技术中心工作，主要从事于固态发酵、白酒分析研究工作。文章编号:1002-8110（2023）05-0095-04第 50 卷 第 5 期2 0 2 3 年 9 月酿酒LIQUORMAKINGVol.50.5Sep.，202395