负载脱落乳牙干细胞外泌体的透明质酸可注射水凝胶的制备及其对小鼠牙周炎抗炎成骨的研究.pdf

口腔颌面外科杂志 2023 年 10 月 第 33 卷 第 5 期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.33 No.5 October,2023 292 负载脱落乳牙干细胞外泌体的透明质酸可注射水凝胶的 制备及其对小鼠牙周炎抗炎成骨的研究应乔，俞懿强，苏俭生（同济大学口腔医学院，同济大学附属口腔医院口腔修复科，上海牙组织修复与再生工程技术研究中心，上海200072）摘要 目的：制备负载人脱落乳牙干细胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED）外泌体（exosomes，EXO）的可注射透明质酸（hyaluronic acid，HA）水凝胶，探究其在牙周炎中的抗炎及成骨作用。方法：提取 SHED 外泌体，以高分子量 HA 为基质，在其中负载 SHED 外泌体以合成可注射 HA 水凝胶（SHED-HA），并测定其降解率。采用CCK-8 法分析 SHED-HA 的生物相容性，应用实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）研究 SHED-HA 的成骨诱导作用及炎症抑制作用。随后，通过 micro-CT 来分析 SHED-HA 对小鼠牙槽骨缺损的挽救作用。结果：6%w/v 透明质酸水凝胶具有较合适的降解性。CCK-8 结果显示，SHED-HA 具有较好的生物相容性能。RT-qPCR 结果显示，SHED-HA 组炎症基因 IL-1、IL-6 的表达水平下调，而成骨分化相关基因 Runx2、OPN、OCN 的表达水平上调。体内实验显示，SHED-HA 能减轻小鼠牙槽骨破坏。结论：成功构建负载了 SHED 外泌体的HA 水凝胶 SHED-HA，同时证实了其对小鼠牙周炎具有抗炎、成骨的作用。关键词透明质酸；脱落乳牙干细胞；外泌体；成骨分化中图分类号 R782 文献标志码 ADOI：10.12439/kqhm.1005-4979.2023.05.003Preparation of hyaluronic acid injectable hydrogel with SHED-derived exosomes and its anti-inflammatory and osteogenic effects on periodontitis:An experimental study in the ratYING Qiao,YU Yiqiang,SU Jiansheng(Department of Prosthodontics,Stomatological Hospital and Dental School of Tongji University,Shanghai Engineering Research Center of Tooth Restoration and Regeneration,Shanghai 200072,China)Abstract Objective:Preparation of injectable hyaluronic acid(HA)hydrogels loaded with exosomes(EXO)of stem cells from human exfoliated deciduous teeth(SHED)to investigate its anti-inflammatory and osteogenic effects in periodontitis.Methods:SHED EXO was extracted and loaded with high molecular weight HA as matrix to synthesize injectable HA hydrogel(SHED-HA)and its degradation rate was determined.The biocompatibility of SHED-HA was analyzed by CCK-8 method,and the osteogenic induction and inflammatory inhibition of SHED-HA were studied by real-time quantitative polymerase chain reaction(RT-qPCR).Subsequently,the effect of SHED-HA on alveolar bone defect in mice was analyzed by micro-CT.Results:SHED-HA had a suitable degradability at the concentration of 6%w/v HA.CCK-8 results showed that SHED-HA had good biocompatibility.RT-qPCR results showed that the expression levels of inflammatory genes IL-1 and IL-6 were down-regulated in the SHED-HA group,while the expression levels of osteogenic differentiation related genes Runx2,OPN and OCN were up-regulated.In vivo experiments showed that SHED-HA reduced alveolar bone destruction in mice.Conclusion:The HA hydrogel SHED-HA of SHED exosome was successfully constructed,and it was found that SHED-HA has 收稿日期：2022-01-21接受日期：2022-05-04基金项目：国家自然科学基金（81873715）；上海市科学技术委员会项目（18441902100）作者简介：应乔，住院医师.E-mail：通信作者：苏俭生，教授.E-mail：基础研究口腔颌面外科杂志 2023 年 10 月 第 33 卷 第 5 期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.33 No.5 October,2023 293 anti-inflammatory and osteogenic effects on mouse periodontitis.Keywordshyaluronic acid;deciduous tooth stem cells;exosome;osteogenic differentiation牙周炎是口内支持组织被广泛的炎症破坏而产生的疾病，能破坏牙龈、骨、牙周膜，进而导致牙齿的丢失，还可能导致全身的炎症1。牙周病的致病因素主要是微生物，由它们形成的生物膜会导致牙周组织的高度损伤2。现最常用的治疗方法为外部机械治疗，但由于口腔结构与环境的复杂，如根分叉处等，器械常难以探及，使炎症控制存在一定的局限性3。除此之外，牙龈等软组织的损伤可以再生，然而牙周膜和牙槽骨的损伤在许多情况下却是不可逆的3-4。所以，牙周再生一直是牙周炎治疗的关键5。目前的临床治疗难以同时达到抗炎和再生的效果。近年来，透明质酸（HA）由于其特有的抗炎性和良好的流动性，被人们广泛用于关节炎的治疗。但在牙周炎的治疗方面，HA 及其复合材料用于牙周炎的体内实验相对较少6，HA 也缺乏足够的成骨性能。近年来的研究7表明，外泌体(EXO)在生命活动中扮演着重要的角色，如血管生成、抗原表达、细胞凋亡、凝固、细胞内稳态、炎症和细胞间信号的传递。大量研究8-9证实，许多种类的外泌体具有成骨、组织分化和骨形成的作用。有学者10发现，脱落乳牙干细胞（SHED）来源的外泌体在口腔疾病中显示出潜在的治疗作用，而且 SHED 外泌体对于小鼠的牙周炎愈合也具有促进作用11。然而，外泌体溶液存在难以在口内长时间停留等问题，使其暂时还无法应用于临床。HA 作为载体与外泌体的联合应用，可以将外泌体长时间存在于局部位置，进而同时发挥成骨与抗炎作用。本研究利用 HA 水凝胶为药物缓释载体，联合SHED 外泌体制备一种可注射型水凝胶类复合材料，用于牙周炎的治疗。向 HA 水凝胶中加入 SHED 外泌体并将其应用于动物细胞和个体，通过 CCK-8 法分析其对人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）的生物相容性，采用实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）研究其对 RAW264.7的 抗 炎 作 用 和 对 hPDLSCs 的 成 骨 分 化 诱 导 作用。最后，本研究建立小鼠牙周炎动物模型，运用micro-CT 技术，研究在体内 SHED-HA 水凝胶对牙周炎骨组织再生的促进作用。1材料和方法1.1hPDLSCs 和 SHED 的培养与 SHED 外泌体的提取hPDLSCs 取自同济大学附属口腔医院拔除的恒牙，将牙齿置于超净台中，用无菌镊剥下牙齿根尖部残余附带组织，反复用磷酸盐缓冲液（phos-phate buffered saline，PBS）（Hyclone 公司，美国）冲洗，去除组织块表面血污，待组织块颜色微微发白时，将组织块平铺于培养瓶底部，培养瓶组织块面 向上，将充足的含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、2%双抗的 DMEM（Hyclone 公司，美国）完全培养液置于培养瓶底部，5%CO2、37 培养箱内培养 6 h，取出培养瓶翻转，使 DMEM 完全培养液与组织块完全接触，于 5%CO2、37 培养箱内培养，隔天换液。10 d 后显微镜下观察到有 hPDLSCs 爬出，继续培养。待细胞汇合度达到 70%时，胰蛋白酶（Hyclone 公司，美国）消化传代于 10 cm10 cm培养皿中，置于 5%CO2、37 培养箱内培养，隔天换液。待细胞汇合度达到 85%时消化传代。本实验采用第 2、3 代 hPDLSCs 进行试验。将 SHED（北京泰盛生物科技有限公司，中国）培养于含10%FBS、2%双抗的DMEM完全培养液中，置于 5%CO2、37 培养箱内培养，隔天换液。当细胞密度达 80%时行胰蛋白酶消化传代。当细胞量达 32 皿 10 cm10 cm 培养皿时，用不含血清的培养液进行换液，36 h 时取上清液。上清液在 300g 下离心 10 min，取上清液，2 000g 离心 10 min。去除非贴壁细胞和碎片后收取上清液，上清液在 10 000g 下离心 60 min。取上清液，在 100 000g 下离心 70 min。缓慢倒去上清液，用 0.8 mL PBS 反复吹打重悬制成含 SHED 外泌体的 PBS 液，并用BCA 蛋白浓度测定盒（碧云天生物技术有限公司，中国）测定蛋白浓度。1.2复合材料 SHED-HA 水凝胶的制备及降解性实验将含 SHED 外泌体的 PBS 悬液加入去离子水中，配成 50 g/mL 的外泌体溶液。将 220 kDa 的HA 粉末（华熙生物科技有限公司，中国）按 1、2、口腔颌面外科杂志 2023 年 10 月 第 33 卷 第 5 期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.33 No.5 October,2023 294 3 g/50 mL 溶于上述复合液中，于液相中缓缓倒入固相，同时反复搅拌，于 37 摇床内振荡过夜，形成含 SHED 外泌体的 2%、4%、6%w/v 的 HA 水凝胶，即 SHED-HA。分别取 2%、4%、6%w/v 的 HA 水凝胶 2 g，置于 15 mL 离心管中，于 1、2、3 d 后倒去管内液体并称质量。1.3细胞增殖的 CCK-8 实验选择 hPDLSCs 为实验细胞，将试样分为 2 组：control 组与 SHED-HA 材料组。将液相替换为正常培养液的材料，与正常培养液分别置于 24 孔板内，每孔设计 2 个副孔。将 hPDLSCs 按照 2104个/孔 接种于孔内，培养于 37 恒温培养箱中 1、3、7 d，隔天换液。于培养 1、3、7 d 时换液冲洗，加入含 10%CCK-8（碧云天生物技术有限公司，中国）溶液的DMEM基础培养液，于37 避光环境内孵育1 h，取上清液 100 L 加入 96 孔板内，每个样本设置 3 个 副孔，用酶标仪于 450 nm 波长处测量吸光度值。1.4RT-qPCR 检测1.4.1炎症相关基因的 RT-qPCR 分析实验分组为 control 组、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激 组与SHED-HA材料组。将RAW264.7细胞按105个/板 铺于六孔板中，37 下培养 5 d。control 组于 DMEM完全培养液中培养 5 d，LPS 刺激组与 SHED-HA 材料组先用 0.01 LPS 刺激 1 d，然后 LPS 刺激组于DMEM 完全培养液中培养 4 d，SHED-HA 材料组以 2 mL/孔培养 4 d。5 d 后收集细胞，提取 mRNA，检测炎症因子白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）及白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）基因的表达。1.4.2hPDLSCs 成骨分化相关基因的 RT-qPCR分 析实 验 分 组 为 control 组 和 SHED-HA 材 料组。将 hPDLSCs 按 4104个/孔铺于六孔板中，于 37 下培养 5 d。control 组用 DMEM 完全培养液培养 5 d，SHED-HA 材料组以 2 mL/孔培养 5 d。5 d 后收集细胞，提取 mRNA，检测成骨分化相关基因 Runx2、OPN、OCN 基因的表达。所选基因的引物序列见表 1。1.5动物实验动物实验程序经过同济大学附属口腔医院伦理委员会的批准 批准号：（2020）-DW-017。随机 选取 10 只 c57 雄性小鼠（雷根生物科技有限公司，中国），分为牙周炎组与材料组。参考相关研究9，采用丝线结扎法建立牙周炎小鼠模型。用 7%水合氯醛（2 mL/只）麻醉动物后，选取型号 3-0 的外科缝线从小鼠右侧上颌第二磨牙近中和远中牙缝处进入，并绑于磨牙牙颈部，采用外科打结法紧密结扎，7 d 后拆除结扎线。实验样本分组如下：10 只小鼠的左上颌第二磨牙均未进行丝线结扎，为标准组；10 只小鼠的右上第二磨牙均采用丝线结扎处理，成功建立了牙周炎模型。丝线拆除后，其中5 只小鼠的右上第二磨牙没有给药，为牙周炎组；另外 5 只小鼠的右上第二磨牙隔天注射 SHED-HA水凝胶，为材料组。具体方法：小鼠麻醉后，将水凝胶注射于右上第二磨牙近远中牙颈部的牙周袋中。从拆线后开始注射药物算起，14 d 后对实验动物实施安乐死，经灌流处理后采集上颌骨样本，运用micro-CT 分析实验动物的牙周骨组织再生情况。1.6统计学分析使用 Gragh Pad Prism 7.0 软件处理数据，通过非配对 t 检验对数据进行统计学分析，以 P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1 复合材料的降解性能降解性实验结果显示，6%的 HA 水凝胶相较于 4%和 2%，其降解需要更长的时间（图 1）。2.2SHED 外泌体的提取与检验SHED 细胞生长良好，呈梭形均匀分布于培养皿中，将 30 皿细胞饥饿处理后取其培养液，高速离表 1RT-qPCR 引物序列Table 1Primer sequence of RT-qPCR基因正向引物(5-3)反向引物(5-3)IL-6CTGCAAGAGACTTCCATCCAGAGTGGTATAGACAGGTCTGTTGGIL-1GAAATGCCACCTTTTGACAGTGTGGATGCTCTCATCAGGACAGGAPDHAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGGGGTCGTTGATGGCAACARunx2TGGTTACTGTCATGGCGGGTATCTCAGATCGTTGAACCTTGCTAOPNCTCCATTGACTCGAACGACTCCAGGTCTGCGAAACTTCTTAGATOCNCACTCCTCGCCCTATTGGCCCCTCCTGCTTGGACACAAAG-actinCATGTACGTTGCTATCCAGGCCTCCTTAATGTCACGCACGAT口腔颌面外科杂志 2023 年 10 月 第 33 卷 第 5 期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.33 No.5 October,2023 295 心法提取外泌体后于电镜下观察。结果显示为囊泡状结构，可确认其为 SHED 外泌体（图 2）。2.3细胞增殖实验CCK-8法测定SHED-HA水凝胶对hPDLSCs增殖 活力的影响。CCK-8 结果显示，在细胞培养第 1 天时，SHED-HA 材料组与 control 组的 hPDLSCs 细胞活力差异无统计学意义。在培养第 3 天及第 7 天时，SHED-HA 材料组 hPDLSCs 的细胞活力显著高于control 组，差异有统计学意义。这表明材料组细胞相较于对照组的细胞有更好的增殖活性，提示 SHED-HA 水凝胶能有效促进 hPDLSCs 的细胞增殖（图 3）。2.4材料抗炎实验RT-qPCR 结果显示，相对于 LPS 刺激组，SHED-HA 材料组中 RAW264.7 细胞的炎症因子 IL-1、IL-6 的 mRNA 表达明显下调，这些结果表明材料对于炎症状态下的 RAW264.7 细胞有明显的抑炎作用（图 4）。A.放大 1 000 倍；B.放大 500 倍。图 2扫描电镜下 SHED 外泌体呈现出囊泡样结构Figure 2 The SHED exosomes showed vesicle-like structure under scanning electron microscope*表示 P0.05，与 control 组比较。图 3培养 SHED-HA 表面 1、3、7 d 的 hPDLCs 细胞活性Figure 3 Cell activity of hPDLCs cultured on SHED-HA surface for 1,3,7 dA.IL-1；B.IL-6。*表示 P0.05，与 LPS 刺激组比较。图 4RAW264.7 细胞炎症相关基因的表达水平Figure 4 Expression levels of inflammation-related genes in RAW264.7 cells图 1不同浓度 HA 水凝胶随时间降解的质量变化Figure 1 Degradation quality of HA hydrogels with time in differ-ent concentrations2.5复合材料对成骨的影响RT-qPCR 结果显示，SHED-HA 材料组相对于control 组，Runx2、OPN、OCN 成骨基因的表达均有所上升，差异具有统计学意义（图 5）。2.6Micro-CT 结果分析Micro-CT 影像清晰显示，以标准组为正常对照可发现牙周炎组第二磨牙周围牙槽骨存在明显吸收，吸收至根中 1/2 处，根分叉处明显吸收。而相对于牙周炎组，材料组根分叉处的骨组织吸收明显缓解，呈现出一定程度的骨组织再生趋势（图 6A）。口腔颌面外科杂志 2023 年 10 月 第 33 卷 第 5 期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.33 No.5 October,2023 296 本研究进一步采用 micro-CT 对第二磨牙牙槽嵴顶至釉牙骨质界（cement-to-enamel junction-alveolar bone crest，CEJ-ABC）的距离进行了定量分析，结果显示，牙周炎组的 CEJ-ABC 值显著高于标准组及材料组（图 6B）。这些结果均提示 SHED-HA 水凝胶有效促进了牙周炎小鼠的牙周骨组织再生修复。3讨论牙周炎是由微生物产生的内毒素和其他炎症因子产生的多因素免疫炎症反应，进而导致了牙周膜的破坏和牙槽骨的进行性吸收3-4。然而，由于它病因的复杂性和口内环境的多变性，寻找一种同时抑制炎症，并产生组织修复的方法仍是该领域的一个难题。炎症的控制是牙周炎治疗中非常重要的一环，人们尝试局部使用不同的抗炎药物来缓解抑制牙周的炎症12。HA 是存在于结缔组织、滑膜液、皮肤等多种器官或者组织细胞外基质中的一种线状多糖，参与炎症反应、血管生成和组织再生过程13。IL-1、IL-6 等促炎因子通过调节巨噬细胞蔓延等方式加重炎症的进程。高分子量的 HA 被证明具有显著的抗炎效果14-15。复合材料的应用则显著降低了小鼠 RAW264.7 的促炎因子表达，对炎症的控制起促进作用，而水凝胶作为具有一定流动性的半固体，可对牙周组织长时间起作用。本研究结果显示，相较于 LPS 刺激组，SHED-HA 材料组内受 LPS刺激的 RAW264.7 细胞中，IL-1 与 IL-6 的表达明显下降，表明具有半固体性质的 SHED-HA 对于RAW264.7 细胞具有炎症抑制作用。近年来的研究8-9显示了外泌体的多种功能，包括成骨、成血管等。SHED 已被鉴定为一种独特类型的间充质干细胞，具有很强的增殖和多向分化能力，是再生医学理想的产后细胞来源11。它们已被证明能维持其神经源性、脂肪性、成骨性和牙源性分化潜能，甚至不受冻存的影响16。因此，由人体 SHED 而来的 SHED 外泌体对口腔疾病展现出潜在治疗价值10-11。本研究的实验结果表明，相对于 control 组，SHED-HA 材料组的 Runx2、OPN 等成骨分化相关基因的表达均有所上升，这表明 SHED-HA 水凝胶对 hPDLCs 具有成骨诱导作用。此外，A.Runx2；B.OCN；C.OPN。*表示 P0.05，与 control 组比较。图 5 在 SHED-HA 中培养 5 d 的 hPDLCs 成骨分化相关基因的表达水平Figure 5 Expression levels of osteogenic differentiation related genes of hPDLCs cultured in SHED-HA for 5 dA.micro-CT 影像（红色箭头指示骨缺损区域）；B.各组 CEJ-ABC（近中、中点、远中牙槽骨嵴）的距离比较（标准组：自然生长 14 d；牙周炎组：牙周炎建模拆线后自然生长 14 d；材料组：牙周炎建模拆线后隔天局部给药 14 d）。图 6SHED-HA 对牙周炎模型小鼠上颌第二磨牙牙槽骨促再生作用Figure 6Effect of SHED-HA on alveolar bone regeneration of maxillary second molar in periodontitis model mice?-?口腔颌面外科杂志 2023 年 10 月 第 33 卷 第 5 期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.33 No.5 October,2023 297 6%w/v 的 HA 水凝胶相较于 4%和 2%w/v 水凝胶表现出更优秀的抗降解性能，使得载有 SHED 外泌体的水凝胶可以更长时间存在于病灶区域，实现SHED 外泌体对组织细胞的持续作用。本研究动物实验的结果表明，材料组中小鼠第二磨牙根分叉处牙槽骨的吸收量明显少于牙周炎组，进一步证实SHED-HA 水凝胶对于牙周炎小鼠的牙周骨组织修复具有促进作用。综上所述，本研究采用 HA水凝胶为药物缓释载体，联合 SHED 外泌体制备了可注射型 SHED-HA 水凝胶用于牙周炎的治疗。该材料具有良好的生物相容性，并对 RAW264.7 细胞表现出良好的抗炎作用，对 hPDLCs 具有显著的成骨诱导活性。动物实验进一步证实 SHED-HA 水凝胶对牙周炎小鼠的牙槽骨缺损具有促修复再生作用。该材料为未来牙周炎的治疗提供了一种新思路和探索。参考文献：1 Minty M,Canceil T,Serino M,et al.Oral microbiota-in-duced periodontitis:A new risk factor of metabolic diseas-esJ.Rev Endocr Metab Disord,2019,20(4):449-459.2 Kinane DF,Stathopoulou PG,Papapanou PN.Periodontal diseasesJ.Nat Rev Dis Primers,2017,3:17038.3 Jepsen 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