GB 4789.4-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验.pdf

中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B4 7 8 9 .42 0 1 6食品安全国家标准食品微生物学检验 沙门氏菌检验2 0 1 6 - 1 2 - 2 3发布2 0 1 7 - 0 6 - 2 3实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局发 布G B4 7 8 9.42 0 1 6 前 言 本标准代替G B4 7 8 9. 42 0 1 0 食品安全国 家标准 食品微生物 学检验 沙门氏菌 检验 、S N0 1 7 01 9 9 2 出口食品沙门氏菌属( 包括亚利桑那菌) 检验方法 、S N/T2 5 5 2 .52 0 1 0 乳及乳制品卫生微生物学检验方法 第5部分: 沙门氏菌检验 。整合后的标准与G B4 7 8 9.42 0 1 0相比, 主要变化如下: 修改了检测流程和血清学检测操作程序; 修改了附录A和附录B。G B4 7 8 9.42 0 1 61 食品安全国家标准食品微生物学检验 沙门氏菌检验1 范围本标准规定了食品中沙门氏菌(S a l m o n e l l a) 的检验方法。本标准适用于食品中沙门氏菌的检验。2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外, 其他设备和材料如下:2.1 冰箱:25。2.2 恒温培养箱:3 61,4 21。2.3 均质器。2.4 振荡器。2.5 电子天平: 感量0.1g。2.6 无菌锥形瓶: 容量5 0 0m L,2 5 0m L。2.7 无菌吸管:1m L( 具0.0 1m L刻度) 、1 0m L( 具0.1m L刻度) 或微量移液器及吸头。2.8 无菌培养皿: 直径6 0mm,9 0mm。2.9 无菌试管:3mm5 0mm、1 0mm7 5mm。2.1 0 p H计或p H比色管或精密p H试纸。2.1 1 全自动微生物生化鉴定系统。2.1 2 无菌毛细管。3 培养基和试剂3.1 缓冲蛋白胨水(B PW) : 见A.1。3.2 四硫磺酸钠煌绿(T T B) 增菌液: 见A.2。3.3 亚硒酸盐胱氨酸(S C) 增菌液: 见A.3。3.4 亚硫酸铋(B S) 琼脂: 见A.4。3.5 HE琼脂: 见A.5。3.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐(X L D) 琼脂: 见A.6。3.7 沙门氏菌属显色培养基。3.8 三糖铁(T S I) 琼脂: 见A.7。3.9 蛋白胨水、 靛基质试剂: 见A.8。3.1 0 尿素琼脂(p H7.2) : 见A.9。3.1 1 氰化钾 (K C N)培养基: 见A.1 0。3.1 2 赖氨酸脱羧酶试验培养基: 见A.1 1。3.1 3 糖发酵管: 见A.1 2。3.1 4 邻硝基酚- D半乳糖苷(ON P G) 培养基: 见A.1 3。3.1 5 半固体琼脂: 见A.1 4。G B4 7 8 9.42 0 1 62 3.1 6 丙二酸钠培养基: 见A.1 5。3.1 7 沙门氏菌O、H和V i诊断血清。3.1 8 生化鉴定试剂盒。4 检验程序沙门氏菌检验程序见图1。图1 沙门氏菌检验程序G B4 7 8 9.42 0 1 63 5 操作步骤5.1 预增菌无菌操作称取2 5g(m L) 样品, 置于盛有2 2 5m LB P W的无菌均质杯或合适容器内, 以80 0 0r/m i n 1 00 0 0r/m i n均质1m i n2m i n, 或置于盛有2 2 5m LB PW的无菌均质袋中, 用拍击式均质器拍打1m i n 2m i n。若样品为液态, 不需要均质, 振荡混匀。如需调整p H, 用1m o l/m L无菌N a OH或HC l调p H至6.80.2。无菌操作将样品转至5 0 0m L锥形瓶或其他合适容器内( 如均质杯本身具有无孔盖, 可不转移样品) , 如使用均质袋, 可直接进行培养, 于3 61培养8h1 8h。如为冷冻产品, 应在4 5以下不超过1 5m i n, 或25不超过1 8h解冻。5.2 增菌轻轻摇动培养过的样品混合物, 移取1m L, 转种于1 0m LT T B内, 于4 21培养1 8h2 4h。同时, 另取1m L, 转种于1 0m LS C内, 于3 61培养1 8h2 4h。5.3 分离分别用直径3mm的接种环取增菌液1环, 划线接种于一个B S琼脂平板和一个X L D琼脂平板( 或H E琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板) , 于3 6 1分别培养4 0h 4 8h(B S琼脂平板) 或1 8h 2 4h(X L D琼脂平板、HE琼脂平板、 沙门氏菌属显色培养基平板) , 观察各个平板上生长的菌落, 各个平板上的菌落特征见表1。表1 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征选择性琼脂平板沙门氏菌B S琼脂菌落为黑色有金属光泽、 棕褐色或灰色, 菌落周围培养基可呈黑色或棕色; 有些菌株形成灰绿色的菌落, 周围培养基不变HE琼脂蓝绿色或蓝色, 多数菌落中心黑色或几乎全黑色; 有些菌株为黄色, 中心黑色或几乎全黑色X L D琼脂菌落呈粉红色, 带或不带黑色中心, 有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心, 或呈现全部黑色的菌落; 有些菌株为黄色菌落, 带或不带黑色中心沙门 氏 菌 属 显 色 培养基按照显色培养基的说明进行判定5.4 生化试验5.4.1 自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落, 接种三糖铁琼脂, 先在斜面划线, 再于底层穿刺; 接种针不要灭菌, 直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板, 于3 6 1 培养1 8h2 4h, 必要时可延长至4 8h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内, 沙门氏菌属的反应结果见表2。G B4 7 8 9.42 0 1 64 表2 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果三糖铁琼脂斜面底层产气硫化氢赖氨酸脱羧酶试验培养基初步判断KA+(-)+(-)+可疑沙门氏菌属KA+(-)+(-)-可疑沙门氏菌属AA+(-)+(-)+可疑沙门氏菌属AA+/-+/-非沙门氏菌KK+/-+/-+/-非沙门氏菌 注:K: 产碱,A: 产酸;+: 阳性,-: 阴性;+(-) : 多数阳性, 少数阴性;+/-: 阳性或阴性。5.4.2 接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时, 可直接接种蛋白胨水( 供做靛基质试验) 、尿素琼脂(p H7.2) 、 氰化钾(K C N) 培养基, 也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于3 61培养1 8h2 4h, 必要时可延长至4 8h, 按表3判定结果。将已挑菌落的平板储存于25或室温至少保留2 4h, 以备必要时复查。表3 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表反应序号硫化氢 (H2S)靛基质p H7.2尿素氰化钾(K C N)赖氨酸脱羧酶A 1+-+A 2+-+A 3-+/- 注:+阳性;-阴性;+/-阳性或阴性。5.4.2.1 反应序号A 1: 典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、K C N和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常, 按表4可判定为沙门氏菌。如有2项异常为非沙门氏菌。表4 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表p H7.2尿素氰化钾(K C N)赖氨酸脱羧酶判定结果-甲型副伤寒沙门氏菌( 要求血清学鉴定结果)-+沙门氏菌或( 要求符合本群生化特性)+-+沙门氏菌个别变体( 要求血清学鉴定结果) 注:+表示阳性;-表示阴性。5.4.2.2 反应序号A 2: 补做甘露醇和山梨醇试验, 沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性, 但需要结合血清学鉴定结果进行判定。5.4.2.3 反应序号A 3: 补做ON P G。ON P G阴性为沙门氏菌, 同时赖氨酸脱羧酶阳性, 甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。5.4.2.4 必要时按表5进行沙门氏菌生化群的鉴别。G B4 7 8 9.42 0 1 65 表5 沙门氏菌属各生化群的鉴别项目卫矛醇+山梨醇+水杨苷+ON P G+丙二酸盐+K C N+ 注:+表示阳性; 表示阴性。5.4.3 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统, 可根据5.4.1的初步判断结果, 从营养琼脂平板上挑取可疑菌落, 用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液, 使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。5.5 血清学鉴定5.5.1 检查培养物有无自凝性一般采用1.2%1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。首先排除自凝集反应, 在洁净的玻片上滴加一滴生理盐水, 将待试培养物混合于生理盐水滴内, 使成为均一性的混浊悬液, 将玻片轻轻摇动3 0s 6 0s, 在黑色背景下观察反应( 必要时用放大镜观察) , 若出现可见的菌体凝集, 即认为有自凝性, 反之无自凝性。对无自凝的培养物参照下面方法进行血清学鉴定。5.5.2 多价菌体抗原(O) 鉴定在玻片上划出2个约1c m2c m的区域, 挑取1环待测菌, 各放1/2环于玻片上的每一区域上部,在其中一个区域下部加1滴多价菌体(O) 抗血清, 在另一区域下部加入1滴生理盐水, 作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌苔研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1m i n, 并对着黑暗背景进行观察, 任何程度的凝集现象皆为阳性反应。O血清不凝集时, 将菌株接种在琼脂量较高的( 如2%3%) 培养基上再检查; 如果是由于V i抗原的存在而阻止了O凝集反应时, 可挑取菌苔于1m L生理盐水中做成浓菌液, 于酒精灯火焰上煮沸后再检查。5.5.3 多价鞭毛抗原(H) 鉴定操作同5.5.2。H抗原发育不良时, 将菌株接种在0.5 5%0.6 5%半固体琼脂平板的中央, 待菌落蔓延生长时, 在其边缘部分取菌检查; 或将菌株通过接种装有0.3%0.4%半固体琼脂的小玻管1次2次, 自远端取菌培养后再检查。5.6 血清学分型( 选做项目)5.6.1 O抗原的鉴定用AF多价O血清做玻片凝集试验, 同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙型菌株, 不能分型。被AF多价O血清凝集者, 依次用O 4;O 3、O 1 0;O 7;O 8;O 9;O 2和O 1 1因子血清做凝集试验。根据试验结果, 判定O群。被O 3、O 1 0血清凝集的菌株, 再用O 1 0、O 1 5、O 3 4、O 1 9单因子血清做凝集G B4 7 8 9.42 0 1 66 试验, 判定E 1、E 4各亚群, 每一个O抗原成分的最后确定均应根据O单因子血清的检查结果, 没有O单因子血清的要用两个O复合因子血清进行核对。不被AF多价O血清凝集者, 先用9种多价O血清检查, 如有其中一种血清凝集, 则用这种血清所包括的O群血清逐一检查, 以确定O群。每种多价O血清所包括的O因子如下:O多价1 A,B,C,D,E,F群 ( 并包括6,1 4群)O多价2 1 3,1 6,1 7,1 8,2 1群O多价3 2 8,3 0,3 5,3 8,3 9群O多价4 4 0,4 1,4 2,4 3群O多价5 4 4,4 5,4 7,4 8群O多价6 5 0,5 1,5 2,5 3群O多价7 5 5,5 6,5 7,5 8群O多价8 5 9,6 0,6 1,6 2群O多价9 6 3,6 5,6 6,6 7群5.6.2 H抗原的鉴定属于AF各O群的常见菌型, 依次用表6所述H因子血清检查第1相和第2相的H抗原。表6 AF群常见菌型 H抗原表O群第1相第2相ABBC 1C 2D( 不产气的)D( 产气的)E 1E 4E 4ag,f,si,b,dk,v,r,cb,d,rdg,m,p,qh,vg,s,ti无无25,z 1 52,5无无6,w,x无 不常见的菌型, 先用8种多价H血清检查, 如有其中一种或两种血清凝集, 则再用这一种或两种血清所包括的各种H因子血清逐一检查, 以第1相和第2项的H抗原。8种多价H血清所包括的H因子如下:H多价1 a,b,c,d,iH多价2 e h,e n x,e n z1 5,f g,g m s,g p u,g p,g q,m t,g z5 1H多价3 k,r,y,z,z1 0,l v,l w,l z1 3,l z2 8,l z4 0H多价4 1,2;1,5;1,6;1,7;z6H多价5 z4z2 3,z4z2 4,z4z3 2,z2 9,z3 5,z3 6,z3 8H多价6 z3 9,z4 1,z4 2,z4 4H多价7 z5 2,z5 3,z5 4,z5 5H多价8 z5 6,z5 7,z6 0,z6 1,z6 2每一个H抗原成分的最后确定均应根据H单因子血清的检查结果, 没有H单因子血清的要用两个H复合因子血清进行核对。检出第1相H抗原而未检出第2相H抗原的或检出第2相H抗原而未检出第1相H抗原的, 可G B4 7 8 9.42 0 1 67 在琼脂斜面上移种1代2代后再检查。如仍只检出一个相的H抗原, 要用位相变异的方法检查其另一个相。单相菌不必做位相变异检查。位相变异试验方法如下:简易平板法: 将0.3 5%0.4%半固体琼脂平板烘干表面水分, 挑取因子血清1环, 滴在半固体平板表面, 放置片刻, 待血清吸收到琼脂内, 在血清部位的中央点种待检菌株, 培养后, 在形成蔓延生长的菌苔边缘取菌检查。小玻管法: 将半固体管( 每管约1m L2m L) 在酒精灯上溶化并冷至5 0, 取已知相的H因子血清0.0 5m L0.1m L, 加入于溶化的半固体内, 混匀后, 用毛细吸管吸取分装于供位相变异试验的小玻管内, 待凝固后, 用接种针挑取待检菌, 接种于一端。将小玻管平放在平皿内, 并在其旁放一团湿棉花,以防琼脂中水分蒸发而干缩, 每天检查结果, 待另一相细菌解离后, 可以从另一端挑取细菌进行检查。培养基内血清的浓度应有适当的比例, 过高时细菌不能生长, 过低时同一相细菌的动力不能抑制。一般按原血清12 0 018 0 0的量加入。小倒管法: 将两端开口的小玻管( 下端开口要留一个缺口, 不要平齐) 放在半固体管内, 小玻管的上端应高出于培养基的表面, 灭菌后备用。临用时在酒精灯上加热溶化, 冷至5 0, 挑取因子血清1环,加入小套管中的半固体内, 略加搅动, 使其混匀, 待凝固后, 将待检菌株接种于小套管中的半固体表层内, 每天检查结果, 待另一相细菌解离后, 可从套管外的半固体表面取菌检查, 或转种1%软琼脂斜面,于3 6培养后再做凝集试验。5.6.3 V i抗原的鉴定用V i因子血清检查。已知具有V i抗原的菌型有: 伤寒沙门氏菌, 丙型副伤寒沙门氏菌, 都柏林沙门氏菌。5.6.4 菌型的判定根据血清学分型鉴定的结果, 按照附录B或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型。6 结果与报告综合以上生化试验和血清学鉴定的结果, 报告2 5g(m L) 样品中检出或未检出沙门氏菌。G B4 7 8 9.42 0 1 68 附 录 A培养基和试剂A.1 缓冲蛋白胨水(B PW)A.1.1 成分蛋白胨 1 0.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钠( 含1 2个结晶水)9.0g磷酸二氢钾1.5g蒸馏水10 0 0m LA.1.2 制法将各成分加入蒸馏水中, 搅混均匀, 静置约1 0m i n, 煮沸溶解, 调节p H至7 .20 .2, 高压灭菌1 2 1,1 5m i n。A.2 四硫磺酸钠煌绿(T T B) 增菌液A.2.1 基础液蛋白胨 1 0.0g牛肉膏5.0g氯化钠3.0g碳酸钙4 5.0g蒸馏水10 0 0m L除碳酸钙外, 将各成分加入蒸馏水中, 煮沸溶解, 再加入碳酸钙, 调节p H至7 .0 0 .2, 高压灭菌1 2 1,2 0m i n。A.2.2 硫代硫酸钠溶液硫代硫酸钠( 含5个结晶水) 5 0.0g蒸馏水加至1 0 0m L高压灭菌1 2 1,2 0m i n。A.2.3 碘溶液碘 片2 0.0g碘化钾2 5.0g蒸馏水加至1 0 0m L将碘化钾充分溶解于少量的蒸馏水中, 再投入碘片, 振摇玻瓶至碘片全部溶解为止, 然后加蒸馏水至规定的总量, 贮存于棕色瓶内, 塞紧瓶盖备用。A.2.4 0.5%煌绿水溶液煌绿0.5gG B4 7 8 9.42 0 1 69 蒸馏水1 0 0m L溶解后, 存放暗处, 不少于1d, 使其自然灭菌。A.2.5 牛胆盐溶液牛胆盐 1 0.0g蒸馏水1 0 0m L加热煮沸至完全溶解, 高压灭菌1 2 1,2 0m i n。A.2.6 制法基础液 9 0 0m L硫代硫酸钠溶液1 0 0m L碘溶液2 0.0m L煌绿水溶液2.0m L牛胆盐溶液5 0.0m L临用前, 按上列顺序, 以无菌操作依次加入基础液中, 每加入一种成分, 均应摇匀后再加入另一种成分。A.3 亚硒酸盐胱氨酸(S C) 增菌液A.3.1 成分蛋白胨 5.0g乳糖4.0g磷酸氢二钠1 0.0g亚硒酸氢钠4.0gL -胱氨酸0.0 1g蒸馏水10 0 0m LA.3.2 制法除亚硒酸氢钠和L -胱氨酸外, 将各成分加入蒸馏水中, 煮沸溶解, 冷至5 5以下, 以无菌操作加入亚硒酸氢钠和1g/LL -胱氨酸溶液1 0m L( 称取0.1g L -胱氨酸, 加1m o l/L氢氧化钠溶液1 5m L, 使溶解, 再加无菌蒸馏水至1 0 0m L即成, 如为D L -胱氨酸, 用量应加倍) 。摇匀, 调节p H至7.00.2。A.4 亚硫酸铋(B S) 琼脂A.4.1 成分蛋白胨 1 0.0g牛肉膏5.0g葡萄糖5.0g硫酸亚铁0.3g磷酸氢二钠4.0g煌绿0.0 2 5g或5.0g/L水溶液5.0m L柠檬酸铋铵2.0gG B4 7 8 9.42 0 1 61 0 亚硫酸钠6.0g琼脂1 8.0g 2 0.0g蒸馏水10 0 0m LA.4.2 制法将前三种成分加入3 0 0m L蒸馏水( 制作基础液) , 硫酸亚铁和磷酸氢二钠分别加入2 0m L和3 0m L蒸馏水中, 柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入另一2 0m L和3 0m L蒸馏水中, 琼脂加入6 0 0m L蒸馏水中。然后分别搅拌均匀, 煮沸溶解。冷至8 0左右时, 先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀, 倒入基础液中, 混匀。将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混匀, 倒入基础液中, 再混匀。调节p H至7.50.2, 随即倾入琼脂液中, 混合均匀, 冷至5 05 5。加入煌绿溶液, 充分混匀后立即倾注平皿。注:本培养基不需要高压灭菌, 在制备过程中不宜过分加热, 避免降低其选择性, 贮于室温暗处, 超过4 8h会降低其选择性, 本培养基宜于当天制备, 第二天使用。A.5 H E 琼脂(H e k t o e nE n t e r i cA g a r)A.5.1 成分蛋白胨 1 2.0g牛肉膏3.0g乳糖1 2.0g蔗糖1 2.0g水杨素2.0g胆盐2 0.0g氯化钠5.0g琼脂1 8.0g 2 0.0g蒸馏水10 0 0m L0.4%溴麝香草酚蓝溶液1 6.0m LA n d r a d e指示剂2 0.0m L甲液2 0.0m L乙液2 0.0m LA.5.2 制法将前面七种成分溶解于4 0 0m L蒸馏水内作为基础液; 将琼脂加入于6 0 0m L蒸馏水内。然后分别搅拌均匀, 煮沸溶解。加入甲液和乙液于基础液内, 调节p H至7.50.2。再加入指示剂, 并与琼脂液合并, 待冷至5 05 5倾注平皿。注:本培养基不需要高压灭菌, 在制备过程中不宜过分加热, 避免降低其选择性。甲液的配制 硫代硫酸钠 3 4.0g 柠檬酸铁铵4.0g 蒸馏水1 0 0m L 乙液的配制 去氧胆酸钠 1 0.0g 蒸馏水1 0 0m L A n d r a d e 指示剂 酸性复红 0.5gG B4 7 8 9.42 0 1 61 1 1m o l/L氢氧化钠溶液1 6.0m L 蒸馏水1 0 0m L将复红溶解于蒸馏水中, 加入氢氧化钠溶液。数小时后如复红褪色不全, 再加氢氧化钠溶液1m L2m L。A.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐(X L D) 琼脂A.6.1 成分酵母膏 3.0gL -赖氨酸5.0g木糖3.7 5g乳糖7.5g蔗糖7.5g去氧胆酸钠2.5g柠檬酸铁铵0.8g硫代硫酸钠6.8g氯化钠5.0g琼脂1 5.0g酚红0.0 8g蒸馏水10 0 0m LA.6.2 制法除酚红和琼脂外, 将其他成分加入4 0 0m L蒸馏水中, 煮沸溶解, 调节p H至7.40.2。另将琼脂加入6 0 0m L蒸馏水中, 煮沸溶解。将上述两溶液混合均匀后, 再加入指示剂, 待冷至5 05 5倾注平皿。注:本培养基不需要高压灭菌, 在制备过程中不宜过分加热, 避免降低其选择性, 贮于室温暗处。本培养基宜于当天制备, 第二天使用。A.7 三糖铁(T S I) 琼脂A.7.1 成分蛋白胨 2 0.0g牛肉膏5.0g乳 糖1 0.0g蔗 糖1 0.0g葡萄糖1.0g硫酸亚铁铵( 含6个结晶水)0.2g酚红0.0 2 5g或5.0g/L溶液5.0m L氯化钠5.0g硫代硫酸钠0.2g琼脂1 2.0g蒸馏水10 0 0m LG B4 7 8 9.42 0 1 61 2 A.7.2 制法除酚红和琼脂外, 将其他成分加入4 0 0m L蒸馏水中, 煮沸溶解, 调节p H至7.40.2。另将琼脂加入6 0 0m L蒸馏水中, 煮沸溶解。将上述两溶液混合均匀后, 再加入指示剂, 混匀, 分装试管, 每管约2m L4m L, 高压灭菌1 2 11 0m i n或1 1 51 5m i n, 灭菌后制成高层斜面, 呈桔红色。A.8 蛋白胨水、 靛基质试剂A.8.1 蛋白胨水蛋白胨( 或胰蛋白胨) 2 0.0g氯化钠5.0g蒸馏水10 0 0m L将上述成分加入蒸馏水中, 煮沸溶解, 调节p H至7.40.2, 分装小试管,1 2 1高压灭菌1 5m i n。A.8.2 靛基质试剂A.8.2.1 柯凡克试剂: 将5g对二甲氨基甲醛溶解于7 5m L戊醇中, 然后缓慢加入浓盐酸2 5m L。A.8.2.2 欧-波试剂: 将1g对二甲氨基苯甲醛溶解于9 5 m L9 5%乙醇内。然后缓慢加入浓盐酸2 0m L。A.8.3 试验方法挑取小量培养物接种, 在3 61培养1d2d, 必要时可培养4d5d。加入柯凡克试剂约0.5m L, 轻摇试管, 阳性者于试剂层呈深红色; 或加入欧-波试剂约0.5m L, 沿管壁流下, 覆盖于培养液表面, 阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。注:蛋白胨中应含有丰富的色氯酸。每批蛋白胨买来后, 应先用已知菌种鉴定后方可使用。A.9 尿素琼脂(p H7.2)A.9.1 成分蛋白胨 1.0g氯化钠5.0g葡萄糖1.0g磷酸二氢钾2.0g0.4%酚红3.0m L琼脂2 0.0g蒸馏水10 0 0m L2 0%尿素溶液1 0 0m LA.9.2 制法除尿素、 琼脂和酚红外, 将其他成分加入4 0 0m L蒸馏水中, 煮沸溶解, 调节p H至7.20.2。另将琼脂加入6 0 0m L蒸馏水中, 煮沸溶解。将上述两溶液混合均匀后, 再加入指示剂后分装,1 2 1 高压灭菌1 5m i n。冷至5 05 5, 加G B4 7 8 9.42 0 1 61 3 入经除菌过滤的尿素溶液。尿素的最终浓度为2%。分装于无菌试管内, 放成斜面备用。A.9.3 试验方法挑取琼脂培养物接种, 在3 61培养2 4h, 观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。A.1 0 氰化钾(K C N) 培养基A.1 0.1 成分蛋白胨 1 0.0g氯化钠5.0g磷酸二氢钾0.2 2 5g磷酸氢二钠5.6 4g蒸馏水10 0 0m L0.5%氰化钾2 0.0m LA.1 0.2 制法将除氰化钾以外的成分加入蒸馏水中, 煮沸溶解, 分装后1 2 1高压灭菌1 5m i n。放在冰箱内使其充分冷却。每1 0 0m L培养基加入0.5%氰化钾溶液2.0m L( 最后浓度为11 00 0 0) , 分装于无菌试管内, 每管约4m L, 立刻用无菌橡皮塞塞紧, 放在4冰箱内, 至少可保存两个月。同时, 将不加氰化钾的培养基作为对照培养基, 分装试管备用。A.1 0.3 试验方法将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成为稀释菌液, 挑取1环接种于氰化钾(K C N) 培养基。并另挑取1环接种于对照培养基。在3 61培养1d 2d, 观察结果。如有细菌生长即为阳性( 不抑制) , 经2d细菌不生长为阴性( 抑制) 。注:氰化钾是剧毒药, 使用时应小心, 切勿沾染, 以免中毒。夏天分装培养基应在冰箱内进行。试验失败的主要原因是封口不严, 氰化钾逐渐分解, 产生氢氰酸气体逸出, 以致药物浓度降低, 细菌生长, 因而造成假阳性反应。试验时对每一环节都要特别注意。A.1 1 赖氨酸脱羧酶试验培养基A.1 1.1 成分蛋白胨 5.0g酵母浸膏3.0g葡萄糖1.0g蒸馏水10 0 0m L1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液1.0m LL -赖氨酸或D L -赖氨酸0.5g/1 0 0m L或1.0g/1 0 0m LA.1 1.2 制法除赖氨酸以外的成分加热溶解后, 分装每瓶1 0 0m L, 分别加入赖氨酸。L -赖氨酸按0.5%加入,G B4 7 8 9.42 0 1 61 4 D L -赖氨酸按1%加入。调节p H至6.80.2。对照培养基不加赖氨酸。分装于无菌的小试管内, 每管0.5m L, 上面滴加一层液体石蜡,1 1 5高压灭菌1 0m i n。A.1 1.3 试验方法从琼脂斜面上挑取培养物接种, 于3 61培养1 8h2 4h, 观察结果。氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱, 培养基应呈紫色。阴性者无碱性产物, 但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管应为黄色。A.1 2 糖发酵管A.1 2.1 成分牛肉膏 5.0g蛋白胨1 0.0g氯化钠3.0g磷酸氢二钠( 含1 2个结晶水)2.0g0.2%溴麝香草酚蓝溶液1 2.0m L蒸馏水10 0 0m LA.1 2.2 制法A.1 2.2.1 葡萄糖发酵管按上述成分配好后, 调节p H至7.40.2。按0.5%加入葡萄糖, 分装于有一个倒置小管的小试管内,1 2 1高压灭菌1 5m i n。A.1 2.2.2 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后, 分装每瓶1 0 0m L,1 2 1高压灭菌1 5m i n。另将各种糖类分别配好1 0%溶液, 同时高压灭菌。将5m L糖溶液加入于1 0 0m L培养基内, 以无菌操作分装小试管。注:蔗糖不纯, 加热后会自行水解者, 应采用过滤法除菌。A.1 2.3 试验方法从琼脂斜面上挑取小量培养物接种, 于3 61培养, 一般2d3d。迟缓反应需观察1 4d3 0d。A.1 3 邻硝基酚- D半乳糖苷(O N P G) 培养基A.1 3.1 成分邻硝基酚- D半乳糖苷(ON P G)(O - N i t r o p h e n y l - D - g a l a c t o p y r a n o s i d e)6 0.0m g0.0 1 m o l/L磷酸钠缓冲液(p H7.5)1 0.0m L1%蛋白胨水(p H7.5)3 0.0m LA.1 3.2 制法将ON P G溶于缓冲液内, 加入蛋白胨水, 以过滤法除菌, 分装于无菌的小试管内, 每管0.5m L, 用橡皮塞塞紧。G B4 7 8 9.42 0 1 61 5 A.1 3.3 试验方法自琼脂斜面上挑取培养物1满环接种于3 61培养1h3h和2 4h观察结果。如果-半乳糖苷酶产生, 则于1h3h变黄色, 如无此酶则2 4h不变色。A.1 4 半固体琼脂A.1 4.1 成分牛肉膏 0.3g蛋白胨1.0g氯化钠0.5g琼脂0.3 5g 0.4g蒸馏水1 0 0m LA.1 4.2 制法按以上成分配好, 煮沸溶解, 调节p H至7.40.2。分装小试管。1 2 1高压灭菌1 5m i n。直立凝固备用。注:供动力观察、 菌种保存、H抗原位相变异试验等用。A.1 5 丙二酸钠培养基A.1 5.1 成分酵母浸膏 1.0g硫酸铵2.0g磷酸氢二钾0.6g磷酸二氢钾0.4g氯化钠2.0g丙二酸钠3.0g0.2%溴麝香草酚蓝溶液1 2.0m L蒸馏水10 0 0m LA.1 5.2 制法除指示剂以外的成分溶解于水, 调节p H至6.80.2, 再加入指示剂, 分装试管,1 2 1 高压灭菌1 5m i n。A.1 5.3 试验方法用新鲜的琼脂培养物接种, 于3 61培养4 8h, 观察结果。阳性者由绿色变为蓝色。G B4 7 8 9.42 0 1 61 6 附 录 B常见沙门氏菌抗原 常见沙门氏菌抗原见表B.1。表B.1 常见沙门氏菌抗原表菌名拉丁菌名O抗原H抗原第1相第2相A 群甲型副伤寒沙门氏菌S.P a r a t y p h i A1,2,1 2a1,5B 群基桑加尼沙门氏菌S. K i s a n g a n i1,4, 5 ,1 2a1,2阿雷查瓦莱塔沙门氏菌S. A r e c h a v a l e t a4, 5 ,1 2a1,7马流产沙门氏菌S. A b o r t u s e q u i4,1 2e,n,x乙型副伤寒沙门氏菌S.P a r a t y p h iB1,4, 5 ,1 2b1,2利密特沙门氏菌S.L i m e t e1,4,1 2, 2 7b1,5阿邦尼沙门氏菌S. A b o n y1,4, 5 ,1 2,2 7be,n,x维也纳沙门氏菌S. W i e n1,4,1 2, 2 7bl,w伯里沙门氏菌S.B u r y4,1 2, 2 7cz 6斯坦利沙门氏菌S.S t a n l e y1,4, 5 ,1 2, 2 7d1,2圣保罗沙门氏菌S.S a i n t p a u l1,4, 5 ,1 2e,h1,2里定沙门氏菌S.R e a d i n g1,4, 5 ,1 2e,h1,5彻斯特沙门氏菌S.C h e s t e r1,4, 5 ,1 2e,he,n,x德尔卑沙门氏菌S.D e r b y1,4, 5 ,1 2f,g1,2阿贡纳沙门氏菌S. A g o n a1,4, 5 ,1 2f,g,s1,2埃森沙门氏菌S.E s s e n4,1 2g,m加利福尼亚沙门氏菌S.C a l i f o r n i a4,1 2g,m,tz6 7金斯敦沙门氏菌S. K i n g s t o n1,4, 5 ,1 2, 2 7g,s,t1,2布达佩斯沙门氏菌S.B u d a p e s t1,4,1 2, 2 7g,t鼠伤寒沙门氏菌S.T y p h i m u r i u m1,4, 5 ,1 2i1,2拉古什沙门氏菌S.L a g o s1,4, 5 ,1 2i1,5布雷登尼沙门氏菌S.B r e d e n e y1,4,1 2, 2 7l,v1,7基尔瓦沙门氏菌S. K i l w a4,1 2l,we,n,x海德尔堡沙门氏菌S. H e i d e l b e r g1,4, 1 5 ,1 2r1,2印地安纳沙门氏菌S.I n d i a n a1,4,1 2z1,7G B4 7 8 9.42 0 1 61 7 表B.1( 续)菌名拉丁菌名O抗原H抗原第1相第2相斯坦利维尔沙门氏菌S.S t a n l e y v i l l e1,4, 5 ,1 2, 2 7z4,z2 31,2伊图里沙门氏菌S.I t u r i1,4,1 2z1 01,5C 1 群奥斯陆沙门氏菌S. O s l o6,7,1 4ae,n,x爱丁保沙门氏菌S.E d i n b u r g6,7,1 4b1,5布隆方丹沙门氏菌S.B l o e m f o n t e i n 6,7be,n,x :z4 2丙型副伤寒沙门氏菌S.P a r a t y p h iC6,7, V ic1,5猪霍乱沙门氏菌S.C h o l e r a e s u i s6,7c1,5猪伤寒沙门氏菌S.T y p h i s u i s6,7c1,5罗米他沙门氏菌S.L o m i t a6,7e,h1,5布伦登卢普沙门氏菌S.B r a e n d e r u p6,7,1 4e,he,n,z1 5里森沙门氏菌S.R i s s e n6,7,1 4f,g蒙得维的亚沙门氏菌S. M o n t e v i d e o6,7,1 4g,m, p ,s1,2,7里吉尔沙门氏菌S. R i g g i l6,7g, t奥雷宁堡沙门氏菌S. O r a n i e b u r g6,7,1 4m,t2,5,7奥里塔蔓林沙门氏菌S. O r i t a m e r i n6,7i1,5汤卜逊沙门氏菌S. T h o m p s o n6,7,1 4k1,5康科德沙门氏菌S.C o n c o r d6,7l,v1,2伊鲁木沙门氏菌S.I r u m u6,7l,v1,5姆卡巴沙门氏菌S. M k a m b a6,7l,v1,6波恩沙门氏菌S.B o n n6,7l,ve,n,x波茨坦沙门氏菌S.P o t s d a m6,7,1 4l,ve,n,z1 5格但斯克沙门氏菌S. G d a n s k6,7,1 4l,vz6维尔肖沙门氏菌S. V i r c h o w6,7,1 4r1,2婴儿沙门氏菌S.I n f a n t i s6,7,1 4r1,5巴布亚沙门氏菌S.P a p u a n a6,7re,n,z1 5巴累利沙门氏菌S.B a r e i l l y6,7,1 4y1,5哈特福德沙门氏菌S. H a r t f o r d6,7ye,n,x三河岛沙门氏菌S. M i k a w a s i m a6,7,1 4ye,n,z1 5姆班达卡沙门氏菌S. M b a n d a k a6,7,1 4z1 0e,n,z1 5田纳西沙门氏菌S. T e n n e s s e e6,7,1 4z2 91,2,7布伦登卢普沙门氏菌S.B r a e n d e r u p6,7,1 4e,he,n,z1 5耶路撒冷沙门氏菌S.J e r u s a l e m6,7,1 4z1 0l,wG B4 7 8 9.42 0 1 61 8 表B.1( 续)菌名拉丁菌名O抗原H抗原第1相第2相C 2 群习志野沙门氏菌S. N a r a s h i n o6.8ae,n,x名古屋沙门氏菌S. N a g o y a6,8b1,5加瓦尼沙门氏菌S. G a t u n i6,8be,n,x慕尼黑沙门氏菌S. M u e n c h e n6,8d1,2曼哈顿沙门氏菌S. M a n h a t t a n6,8d1,5纽波特沙门氏菌S. N e w p o r t6,8,2 0e,h1,2科特布斯沙门氏菌S. K o t t b u s6,8e,h1,5茨昂威沙门氏菌S.T s h i o n g w e6,8e,he,n,z1 5林登堡沙门氏菌S.L i n d e n b u r g6,8i1,2塔科拉迪沙门氏菌S. T a k o r a d i6,8i1,5波那雷恩沙门氏菌S.B o n a r i e n s i s6,8ie,n,x利齐菲尔德沙门氏菌S.L i t c h f i e l d6,8l,v1,2病牛沙门氏菌S.B o v i s m o r b i f i c a n s6,8,2 0r, i1,5查理沙门氏菌S.C h a i l e y6,8z4,z2 3e,n,z1 5C 3 群巴尔多沙门氏菌S.B a r d o8e,h1,2依麦克沙门氏菌S.E m e k8,2 0g,m,s肯塔基沙门氏菌S. K e n t u c k y8,2 0iz6D 群仙台沙门氏菌S.S e n d a i1,9,1 2a1,5伤寒沙门氏菌S. T y p h i9,1 2, V id塔西沙门氏菌S. T a r s h y n e9,1 2d1,6伊斯特本沙门氏菌S.E a s t b o u r n e1,9,1 2e,h1,5以色列沙门氏菌S.I s r a e l9,1 2e,he,n,z1 5肠炎沙门氏菌S.E n t e r i t i d i s1,9,1 2g,m1,7布利丹沙门氏菌S.B l e g d a m9,1 2g,m,q沙门氏菌Sa l