农用土壤颉颃放线菌的发酵及其活性产物_50页.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,农用土壤颉颃放线菌的发酵及其活性产物,与微生物发酵有关的参数,菌体浓度,培养基营养物质的组成,温度,pH,通气量（溶氧,）,芽孢杆菌发酵液的活性研究,供试菌：目标菌：苹果炭疽菌,(,Glomerella,cingulata,),、柑桔炭疽菌,(,Colletotrichum,gloesporioides,Penz,),、瓜类炭疽菌,(,Colletotrichum,orbiculare,),、棉花炭疽菌,(,Glomerella,gossypii,),。,方法,发酵液的制备：将供试菌接入培养液中，,30,下培养,48h,后离心，回收上清液，,15,磅压力下灭菌,20,分钟，置于,5,冰箱中备用。,发酵液与菌悬液抗菌活性比较：（滤纸碟法）取,0.1ml,炭疽菌的孢子悬浮液均匀涂于,PDA,平板上，再将分别浸蘸菌悬液和发酵液的灭菌滤纸碟（直径,4mm,）等距贴于,PDA,平板上，待炭疽菌菌丝长满培养皿时，测定每纸碟的抑菌圈直径，每处理,5,个重复。,发酵液的滴加培养试验：将,PDA,平板上培养的四种炭疽菌打成直径,4mm,的菌饼，置于,PDA,平板上。然后，将发酵液配成原液、,1/2,、,1/4,浓度，对照为无菌水。各取,50l,点滴于菌丝块上，置,30,温箱中培养,72,小时后测定菌丝生长直径，各个重复。,不除菌发酵液的抑菌活性测定,供试菌：三个菌系。目标菌：番茄灰霉菌,(Botrytis,cinerea,),。,方法,发酵液的制备：将三株供试菌接于,NYDA,培养液中，,30,下摇床振荡培养,48,小时后，直接置于,5,冰箱中保存备用。,发酵液处理条件下孢子萌发率的测定：将灰霉菌孢子悬浮液加到上述发酵液中，,16,小时后测孢子萌发率。对照用,NYDA,培养液。,抑菌作用的测定,环腐病菌,CMS-1,（中国农科院植保所分离，于真空冷冻干燥条件下保存的菌株）。,养基为,BPA,。,方法 以环腐病菌作为指示菌，利用平板扩散法，进行测定。具体方法是,:,在超静工作台上，将约,109cfu/ml,的环腐病菌悬液,0.2 ml,加入灭菌培养皿中，然后倒入已冷却至,40,左右的培养基,20 ml,，充分摇匀，冷却后点上待测菌，放在,22,25,温箱中培养,3,4d,，检查抑菌圈的有、无及大、小情况。,抗生素的分离提取,发酵液的预处理,溶媒萃取法,离子交换法,吸附法,沉淀法,膜过滤技术,现代高压液相色谱技术,3,、,培养基,放线菌分离培养用培养基,:,高氏一号培养基,真菌培养及颉抗试验用培养基,：,PDA,液体发酵培养基,：,黄豆饼粉,20g,，,玉米粉,4g,，,葡萄糖,20g,，,碳酸钙,5g,，,1000ml,细菌培养基,:,牛肉膏蛋白胨培养基,4,、仪器设备,超净工作台 生物显微镜、保湿盒、载玻片、凹玻片、恒温培养箱、恒温振荡培养箱、微波炉、旋转薄膜蒸发器、真空泵、层析柱、离心机、冰箱、电子天平、,PH,计、移液枪、磁力搅拌器、旋涡混合器、电热恒温水浴锅、薄层色谱展开缸、高压灭菌锅、鼓风干燥箱。,ZAB-HS,和,HP-5988A,质谱仪、,AM-400 NMR,核磁共振仪、,Nicolet,AUATAR 360FT-IR,红外光谱仪、岛津,UV,240,紫外光谱仪、,Vario,EL,元素分析仪、,X-4,型熔点仪、,PE-341,Polarimeter,旋光度仪均是由兰州大学化学系实验室提供。,5,、试剂,琼脂 葡萄糖 淀粉 糊精 玉米浆,玉米油 黄豆饼粉 蛋白胨,酵母粉 玉米浆 麦麸,K,2,HPO,4,CaCO,3,FeSO,4,7H,2,O ZnSO,4,CuSO,4,(NH,4,),2,SO,4,NaCl,KNO,3,NaOH,FeCl,3,石油醚 乙醚 三氯甲烷 丙酮 苯 乙醇 甲醇 乙酸乙酯 草酸,乙酸丁脂 茚三酮 品红 双缩脲试剂 邻苯二甲酸苯胺等,硅胶,D101,大孔树脂,732,阳离子交换树脂,5,颉抗菌发酵条件的优化,5.1,发酵培养基的选择,（,1,）有机氮源的选择,碳源不变改变氮源的组成,蛋白胨、酵母粉、黄豆饼粉、黄豆饼粉,+,玉米浆、黄豆饼粉,+KNO,3,、,蛋白胨,+,玉米浆、酵母粉,+NH,4,SO,4,、,麦麸,+,酵母粉,+,黄豆饼粉,（,2,）有机碳源的选择,氮源不变改变碳源的组成,淀粉、糊精、葡萄糖、蔗糖、葡萄糖,+,糊精、葡萄糖,+,淀粉、淀粉,+,蔗糖、,葡萄糖,+,玉米油,5.1,发酵培养基的选择,（,4,）最优培养基正交实验,表,2.2 L,9,(3,4,),正交实验因素水平表,因素,水平,1,（,%,）,0,0,0,0,水平,2,（,%,）,0.05,0.05,0.05,0.05,水平,3,（,%,）,0.1,0.1,0.1,0.1,表,2.3 L,9,(3,4,),正交实验因素水平表,因素,A,B,C,D,水平,1,（,%,）,1.5,0.5,0.5,0,水平,2,（,%,）,2.0,1.0,1.0,0.25,水平,3,（,%,）,2.5,1.5,1.5,0.5,A,黄豆饼粉、,B,葡萄糖、,C,淀粉、,D,碳酸钙,（,3,）无机离子的选择,磷酸氢二钾、,硫酸铜、,硫酸亚铁、,硫酸锌,(1),发酵培养基起始,p,H,的选择,PH:5.0,、,6.0,、,7.0,、,8.0,、,9.0,(2),发酵时间的选择,24,、,36,、,48,、,60,、,72,、,84,、,96,、,120,小时,(3),发酵温度的选择,26,、,28,、,30,、,32,、,34,、,36,、,38,(4),摇床转速的选择,100r/min,、,150r/min,、,200r/min,、,250r/min,5.2,其它发酵条件的优化,6.,高效菌株活性产物的提取路线,发酵液预处理,滤液,过滤,减压浓缩,丙酮沉淀,沉淀物,732,阳离子交换树脂,大孔树脂,反相制备液相色谱,粗提物,精提物,纯化合物,7.1,活性产物对病原菌菌丝生长的抑制作用,采用生长速率法，测定不同浓度的活性产物粗提物对小麦根腐病原菌菌丝 生长 的抑制情况，并观察对菌丝的形态的影响。,7.,高效菌株活性产物的作用机理,7.2,活性产物对病原菌孢子萌发的影响,采用孢子萌发法测定不同浓度粗提物 对病原菌孢子萌发及芽管生长的抑制情况，观察孢子萌发的形态。,8,、,活性产物对温室病害的预防和治疗作用测定,测定,0.125,、,0.8,、,4,、,20,、,100mg/l,不同浓度粗提物药液对番茄灰霉病的预防效果和治疗效果。清水和,2.5ml/l,农抗,120,（,4%,水剂）作对照。,预防效果（,%,）,=,对照病情指数,处理病情指数,对照病情指数,100,治疗效果（,%,）,=,对照病指增长率,处理病指增长率,对照病指增长率,100,1,放线菌分离中抑制剂的应用,1.1,不同抑制剂对土壤微生物的抑制效果比较,序,号,放线菌酮,制霉素,重铬酸钾,50%,多菌灵,空白,5,10,-6,g,/,l,4,10,-6,g,/,l,5,10,-6,g,/,l,100g,/,l,放线菌 细菌 真菌,放线菌 细菌 真菌,放线菌 细菌 真菌,放线菌 细菌 真菌,放线菌 细菌 真菌,1,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,2,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,3,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,4,+,+,+,+,+,+,+,+,+,5,+,+,+,+,+,+,+,+,+,6,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,7,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,8,+,+,+,+,+,+,+,+,+,9,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,10,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,11,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,12,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,13,+,+,+,+,+,+,+,+,+,14,+,+,+,+,+,+,+,+,+,15,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,16,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,17,+,+,+,+,+,+,+,+,18,+,+,+,+,+,+,+,+,+,19,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,20,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,21,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,表,3.1,各种抑制剂对土壤微生物菌落的影响,+:,表示,1,10,个菌落,;+:10,20,个菌落,;+:20,个以上菌落,;-:,无菌落,图,2,放线菌对烟草赤星的颉颃作用,烟草赤星,2.2,颉颃菌的复筛结果,表,3.4,生长素率法测定发酵滤液（,100ml/l,）,对病原菌的抑制率（,%,）,菌株号,供 试 病 原 菌,水稻稻瘟,小麦根腐,棉花枯萎,番茄灰霉,小麦赤霉,烟草赤星,1,40,0,67,51,36,52,2,77,50,39,61,47,43,3,61,50,4,44,82,61,4,94,90,76,67,51,84,5,98,67,48,64,63,51,表,3.5,不同浓度的发酵滤液,对,6,种病原菌菌丝生长的抑制效果,供试菌种,100,ml/l,10,ml/l,1,ml/l,0.1,ml/l,0.01,ml/l,毒力回归曲线,X,2,(,卡方,),EC,50,ml/l,小麦赤霉,53.80,42.60,31.20,19.34,9.40,Y=0.3504x+3.3958,0.4246,37.86,水稻稻瘟,93.71,75.30,52.68,42.50,26.70,Y=0.6485x+3.2106,15.4392,0.5745,番茄灰霉,89.40,58.60,40.90,28.50,14.40,Y=0.5407x+3.2990,2.3846,1.3992,小麦根腐,87.18,75.18,58.40,39.85,16.06,Y=0.4366x+3.9381,7.1153,0.2705,棉花枯萎,75.00,62.31,50.49,38.45,26.75,Y=0.3193x+4.06,0.0061,0.8788,烟草赤星,85.20,72.70,60.40,47.30,25.65,Y=0.4067x+4.0184,2.2392,0.2591,图,8,不同浓度发酵液对水稻稻瘟的抑制效果,CK,100ml/l,发酵液,1ml/l,发酵液,10ml/l,发酵液,图,7,不同颉颃菌株的发酵液,图,9 159,号放线菌的,5,个,单孢菌落,2.3,单孢分离结果,2.3,单孢菌的筛选结果,表,3.6 24h,、,48h,单孢菌发酵液（,50 ml/l,）,对病原菌的抑制率,（,%,）,单孢菌株,供 试 病 原 菌,水稻稻瘟,24h 48h,小麦根腐,24h 48h,棉花枯萎,24h 48h,番茄灰霉,24h 48h,小麦赤霉,24h 48h,烟草赤星,24h 48h,159-01,100 81,85 53,65 62,37 61,39 19,84 80,159-02,100 81,85 75,78 72,16 27,58 41,84 82,159-03,68 65,50 24,70 60,72 65,8 9,53 61,159-04,63 59,80 48,75,75,69 86,28 24,86 84,159-05,100 90,9 2 72,78 75,86 71,56 27,85 83,3,发酵优化结果,3.1,发酵培养基的优化结果,表,3.7,不同氮源对发酵滤液（,50ml/l,）,抑菌效果的影响,氮源,蛋白胨,黄豆饼粉,酵母粉,黄豆饼粉,+,玉米浆,黄豆饼粉,+KNO,3,蛋白胨,+,玉米浆,酵母粉,+NH,4,SO,4,麦麸,+,酵母粉,+,黄豆饼粉,抑制率,(%),14,75,43,70,65,23,58,67,3.1.2,最佳碳源的选择,表,3.8,不同碳源对发酵滤液（,50ml/l,）,抑菌效果的影响,碳源,淀粉,糊精,葡萄糖,蔗糖,葡萄糖,+,糊精,葡萄糖,+,淀粉,淀粉,+,蔗糖,葡萄糖,+,玉米油,抑制率,(%),20,32,73,45,72,83,80,79,3.1.1,最佳氮源的选择,3.1.3,无机盐正交试验结果,表,3.9 L,9,(3,4,),正交试验结果分析,因素,抑制率,1,1,1,1,1,73.57,2,1,2,2,2,75.12,3,1,3,3,3,81.01,4,2,1,2,3,85.12,5,2,2,3,1,85.43,6,2,3,1,2,85.54,7,3,1,3,2,72.54,8,3,2,1,3,77.63,9,3,3,2,1,77.57,K1,229.70,231.23,236.74,236.57,K2,257.09,238.18,237.81,233.20,K3,227.74,244.12,238.98,243.76,K1,76.57,77.07,78.91,78.86,K2,85.33,79.39,79.27,77.73,K3,76.91,81.37,79.66,81.25,R,9.42,4.30,0.75,3.52,注：,磷酸氢二钾、,硫酸铜、,硫酸亚铁、,硫酸锌,筛选到对培养基效价影响较大的因子,磷酸氢二钾（,0.05%,）,3.1.4,培养基的优化,表,3.10 L,9,(3,4,),正交试验结果分析,因素,A,B,C,D,抑制率,(%),1,1,1,1,1,75.21,2,1,2,2,2,79.03,3,1,3,3,3,78.31,4,2,1,2,3,81.52,5,2,2,3,1,86.90,6,2,3,1,2,77.92,7,3,1,3,2,78.17,8,3,2,1,3,73.26,9,3,3,2,1,69.75,K1,232.55,234.9,226.39,231.86,K2,246.34,239.19,230.30,235.12,K3,221.18,225.98,243.38,233.09,K1,77.51,78.3,75.46,77.29,K2,82.11,79.73,76.77,78.37,K3,73.72,75.33,81.13,77.70,R,8.39,4.4,5.67,1.08,注：,A,黄豆饼粉、,B,葡萄糖、,C,淀粉、,D,碳酸钙,其最佳配比为,A,2,B,2,C,3,D,2,即黄豆饼粉,2%,、葡萄糖,1%,、淀粉,1.5%,、碳酸钙,0.25%,。,因此最终筛选到的优化培养基组成为：,黄豆饼粉,2%,葡萄糖,1%,淀粉,1.5%,碳酸钙,0.25%,磷酸氢二钾,0.05%,3.2.2,培养时间的优化,3.2,发酵条件的优化,10,3.2.3,培养基起始,pH,的优化,11,3.2.4,温度对发酵液抑菌作用的影响,3.2.5,摇床转速对发酵液抑菌作用的影响,转速（,r/min,）,100,150,200,250,抑制率（,%,）,85,91,87,90,表,3.14,摇床转速对发酵液抑菌作用的影响,3.3,放线菌代谢过程中,PH,的变化的测定,3.4,放线菌生长曲线的测定,3.5,菌丝生长与代谢之间的关系,图,16 36h S-159-05,发酵液菌丝团的形态,图,17 48h,发酵液菌丝团的形态,图,18 75h,发酵液菌丝团的形态,4,粗提物的抑菌谱的测定,表,3.17 S-159-05,粗提物的抑菌谱,病原菌,抑制强度,100mg/l,10mg/l,1mg/l,水稻稻瘟病菌,Pyricularia,grisea,+,+,+,小麦,赤霉病菌,Fusarium,graminearum,+,+,小麦根腐病菌,Bipolaris,sorokiniana,+,+,+,小麦白粉病菌,Erysiphe,graminis,+,黄瓜霜霉病菌,Psudoperonospora,cubensis,+,+,+,辣椒疫霉病菌,Phytophthora,capsici,+,+,+,烟草赤星病菌,Alternaria,alternata,+,+,+,番茄灰霉病菌,Botrytis,cirerea,+,+,+,十字花科软腐病菌,Erwinia,carotovora,+,+,+,番茄青枯病菌,Pseudomanas,solanacearam,+,+,+,黄瓜炭疽病菌,Colletotrichum,oriculare,番茄早疫病菌,Alternaria,solani,+,+,：抑制率（防效）,=75%-100%,+,：,抑制率（防效）,=45%-75,%,+,：抑制率（防效）,=30%-45%,：抑制率（防效）,30,%,5.,活性产物的作用机制初探,5.1,活性产物对菌丝生长的影响,表,3.18,活性粗提物对,5,种病原菌菌丝生长的抑制效果,供试菌种,100,mg/l,10,mg/l,1,mg/l,0.1,mg/l,0.01,mg/l,毒力回归曲线,X,2,(,卡方,),EC,50,mg/l,小麦赤霉,52.67,46.64,37.20,21.38,11.47,Y=0.3244x+3.5597,1.6323,26.91,水稻稻瘟,89.71,74.48,62.68,42.50,31.67,Y=0.4329x+4.0176,0.5978,0.1897,番茄灰霉,86.27,56.67,50.46,35.53,25.47,Y=0.4046x+3.8351,9.2574,0.7585,小麦根腐,85.78,75.14,56.47,45.85,26.09,Y=0.3972x+4.0654,1.8907,0.2254,黄瓜枯萎,72.00,59.31,40.95,34.85,26.75,Y=0.3101x+3.9822,0.6972,1.9146,对照的菌丝,100mg/l S-159-05,活性产物处理的菌丝（已变形）,图,19,光学显微镜下受抑制的小麦根腐病菌的菌丝形态,5.2,活性产物对孢子萌发的影响,表,3.19,活性产物对小麦根腐（,12h,）、,烟草赤星（,8h,）,孢子萌发的影响,病原菌,浓度,(mg/l),萌发率,(%),抑制萌发率,(%),芽管长度,(,m),致畸率,(%),小麦根腐,Bipolaris,sorokiniana,100,10,1,CK,2,23,41,92,97,75,55,0,8,21,36,50,63,38,1,烟草赤星,Alternaria,alternata,100,10,1,CK,0,30,52,89,100,66,40,0,42,91,120,0,82,69,2,图,20,光学显微镜下的烟草赤星病菌孢子萌发形态,图,20-a,对照孢子的萌发情况,图,20-b 10mg/l,活性产物处理后孢子的萌发情况,图,20-c 100mg/l,活性产物处理后孢子萌发情况,图,21-a,对照孢子的萌发情况,图,21-b 1mg/l,活性产物处理后孢子萌发情况,图,21-d 100mg/l,活性产物处理后孢子萌发情况,图,21,光学显微镜下的小麦根腐孢子萌发形态,图,21-c 10mg/l,活性产物处理后孢子的萌发情况,抗生素的提取与分离,利用抗生制备新型农药，由于其具有无污染、无残留、可再生、难以使有害物产生抗药性，易于产业化，成本低等优点已成为无公害农药的发展方向。因而，农用抗生素的提取，分离纯化成为重点。用有机溶剂（丙酮,/,丁醇）先将抗生素从菌丝体中浸取出来，然后再提取。如果提取的是新的抗生素。在提取前必须初步了解抗生素的一些性质。例如，（,1,）通过纸电泳和纸层析的分析，了解该抗生素是属于哪一类型。是碱性、中性或两性物质，它的大致等电点，在各种溶剂中的溶解情况，以及是一种还是多种成分的混合物等。（,2,）通过稳定性实验。将抗生素发酵液调节成各种不同的,pH,值，用各种不同的温度进行处理，以观察有效成分的稳定情况。这样才能知道该抗生素在哪种适合条件下，采用哪种方法进行提取和保存而不致受到破坏。目前采用以下方法提取、分离纯化。,1.,抗生素的提取,1.1,溶媒萃取法,溶媒萃取法在工业中应用较广。它的基本原理是利用抗生素和杂质在溶媒中的溶解度不同，将抗生素选择性地从一种溶剂转移到另一种溶剂而达到浓缩去杂的目的。在实验室中最常用的萃取器皿是分液漏斗，将发酵滤液与另一种溶媒放在分液漏斗中，剧烈振荡时它们的接触面增加，以提高萃取效率，然后静止数分钟，使两液完全分开。从活塞放出萃余液（下层），从漏斗口倒出萃取液进行浓缩。,1.2,吸附法,吸附法是利用一种适当的吸附剂，把发酵液中的抗生素吸附，然后再以有机溶剂把抗生素从吸附剂上洗脱下来，再经浓缩后即可得到抗生素的粗制品；另一方面，也可以利用吸附剂先吸附发酵滤液中的杂质或色素物质等，而使抗生素有效成分仍留在滤液中，然后改变滤液的,pH,值，再把抗生素转入新的吸附剂上而达到浓缩的目的。吸附剂通常在中性情况下是吸附抗生素，在酸性条件下是吸附杂质。,1.3,离子交换法,离子交换树脂是一种具有离子交换能力的固态高分子化合物。通常是制成细小的球形或无定形的粒子，一般为,2060,目，它不溶于水，不溶于酸和碱，也不溶于普通的有机溶媒，化学稳定性良好，且具有离子交换能力。这种高分子化合物由两部分组成：一部分是不能移动的，多价的高分子基团，构成树脂的骨架，这种骨架分子由于交链作用使其上下左右互相联结，使树脂具有多孔性，如同海绵一般，并具有上述溶解度和化学稳定的性质；另一部分是可以移动的离子，称为活性离子，它是连接在树脂骨架上的有效交换基因。由于它在树脂骨架中的进进出出，就产生了离子交换现象。,在工业上广泛应用的离子交换提取抗生素的操作方法有分批法和固定床法。,1.3.1,分批法,即将树脂与滤液共置在一个容器内，或静置或搅拌、使交换达到平衡。这种方法操作简单，缺点是树脂的饱和度往往不高。如果多搅拌，树脂易于破碎而损耗大。,1.3.2,固定床法,交换是在动态条件下进行的，即将树脂放在交换柱或交换罐中。而使发酵液自上而下或自下而上地留经树脂,.,其中抗生素即被特定的树脂选择性地吸收交换,.,待通过一定量的发酵滤液，树脂交换达到饱和而不再继续吸收抗生素时，即停止通入发酵滤液，并用干净的水进行冲洗以除去未经交换的杂质，然后再用高浓度的适当洗脱剂通过树脂柱将抗生素从树脂上洗脱下来。使用这种方法树脂饱和度较高，而且离子交换的速度要比分批法来得快。,1.4,沉淀法,沉淀法利用了某些抗生素能和某些酸、碱或盐类形成不溶性的盐或复合物而沉淀，且此沉淀在改变条件后，又可以使沉淀物重新溶解的特性。,对于碱性和两性的抗生素可以用不同种类的酸性作为沉淀剂，使其沉淀下来；酸性抗生素可以和有机碱形成盐而沉淀出；多肽类抗生素则可用盐析法使溶解度降低而沉淀。沉淀下来的抗生素可用水或稀酸溶液溶解后，再用有机溶剂提取，然后经过浓缩或用另外的溶剂使抗生素结晶出来，即可得到较纯的抗生素成品。,1.5,超声波法,此法是利用超声波增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透力，提高药物溶出速度和溶出次数，缩短提取时间的浸取方法。超声波是一种高频机械波。频率范围在,1560kHz,的超声，常被用于过程强化和引发化学反应。超声场主要通过超声空化向体系提供能量，瞬间空化可实现,5000,的高温和,50Mpa,的局部高压。它在提取方面的应用主要是利用超声波的空化作用加速植物有效成分的浸出提取，另外超声波的次级效应也能加速欲提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合，利于提取。与常规提取法相比，具有时间短、产率高、无需加热等优点。,2.,抗生素的分离,抗生素发酵液经第一步提取后，得到的通常是浓缩液或粗制品，所以需进一步分离，分离方法可以用普通有机化合物常用的方法。但抗生素是一些不太稳定的物质，因而分离方法也受到一定限制，通常采用色谱法、分子筛法、脱色和去热原质法和沉淀、结晶和重结晶法等方法进行分离。,2.1,色谱法,它是一组相关分离方法的总称，它的机理是多种多样的，但不管哪种方法，色谱系统都包括两相：即固定相和移动相。当以流动相流过加有样品的固定相时，由于各组分在两相之间的浓度比例不同，就会以不同速度移动而相互分离开来。,根据分离的机理，色谱法可以分为：吸附色谱法，靠吸附力不同而分离；分配色谱法，靠物质在两液相间的分配系数不同而分离；离子交换色谱法，靠各物质对离子交换树脂的化学亲和力不同而分离；凝胶色谱法,分子筛法，靠物质的分子大小或形状不同而分离和电泳法（电色谱法），靠电泳速度不同而分离等。,2.2,分子筛去盐法,利用分子筛的方法可将无机杂质从抗生素溶液中分出。通常用高交联度的离子交换树脂，它能吸附无机离子，但不能吸附抗生素等大分子，因而可以得到分离。,2.3,脱色和去热原质法,利用活性炭可以将各种色素和热原质同时除去。活性炭处理在抗生素提炼中占有重要地位，很难以其它方法代替。热原质是磷脂类物质和蛋白质或多糖体等物质的结合体，是一种大分子物质，还可以用二乙胺基乙基葡聚糖凝胶除去。,在某些情况下，也可用离子交换树脂来脱色。如脱色树脂、酚醛型树脂和强碱性树脂等。,2.4,沉淀、结晶和重结晶,利用抗生素能形成某些不溶性盐类的性质，自溶液中沉淀析出，然后再将沉淀转化。经过这样一次转换后，抗生素的纯度就可大大提高，这种方法称为中间盐转移法。,结晶的方法很多，有的是利用盐类不溶于有机溶媒的特性，有的是利用游离酸或碱不溶于水的特性。前者如在青霉素醋酸丁酯,醋酸钾溶液，即生成难溶于醋酸丁酯的青霉素钾盐结晶析出；后者如在红霉素的缓冲液萃取液中，加,20%NaOH,碱化至,pH9.810.2,，并加热至,4550,，保温,1015,分钟后，即有红霉素游离碱沉淀析出。,重结晶，即在不同溶剂中反复结晶，使抗生素的纯度提高，原理为杂质和结晶物质在不同溶剂和不同温度下的溶解度是不同的,3.,讨论,3.1,在溶媒萃取中，对溶媒的选择有一定的要求。一种合适的溶媒必须具备的条件是：对被萃取的抗生素不发生化学反应；而且分配系数要大；选择性要强；萃取相和萃余相易分离等等。,3.2,在吸附法提取中，吸附剂的种类以及它们提取抗生素的方法和条件、洗脱剂的选择等等对提取的效果有很大的影响。总的来说，一般吸附剂的吸附选择性不是很高，许多杂质也会吸附上去，而且吸附容量有限，洗脱剂的用量也不能太少，从而使洗脱液中的抗生素浓度不高。,3.3,在离子交换法提取生产过程中，,pH,变化较大，对酸碱稳定性差，此外，有些抗生素也不一定能找到合适的树脂。,3.4,沉淀法的主要缺点是过滤困难，所提取物质的质量不高。但是它的浓缩倍数高，原材料易解决。,3.5,在超声波提取中，其优点是由于它的力学效应赋予溶剂对细胞膜的更大渗透力，并强化细胞内外的质量传输。它的另一个作用在于破坏细胞壁，使细胞内含物更易释放。超声波形成的微流效应也是其提高提取过程的一个重要因素。但它对容器壁的厚薄及容器放置位置要求较高，而且它对某些提取物质也有一定的破坏作用。,3.6,色谱法分离混合物中各组分的方法，其主要优点是分离效率高，不会使物质变性，特别适用于不稳定的大分子有机化合物。但它的处理量小，操作周期长，且不能连续操作。,3.7,在重结晶中，其关键是选择合适的溶剂，一般认为如溶质在某种溶剂中加热时能溶解，冷却时能析出较多的晶体，则这种溶剂可认为适用于重结晶。,