色谱分析法_中山大学_117页.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第,12,章 色谱分析法,12.1,概述,历史、色谱分离过程、分类、相关术语,12.2,气相色谱基本原理,塔板理论及速率理论、,分离方程,12.3,气相色谱法,12.4,高效液相色谱法,12.5,色谱分离方式的选择,12.1,概述,20,世纪中期，大量采用一些经典的分离方法：沉淀、蒸馏和萃取,现代分析中，大量采用色谱和电泳分离方法。迄今为止，色谱方法是最为有效的分离手段！其应用涉及每个科学领域。,历史：,1903,年，俄国植物学家,Mikhail,Tswett,最先发明。他采用填充有固,体,CaCO,3,细粒子的玻璃柱，将植物色素的混合物,(,叶绿素和叶黄素,chlorophylls&xanthophylls),加于柱顶端，然后以溶剂淋洗，被分,离的组份在柱中显示了不同的色带，他称之为色谱,(,希腊语中,“,chroma,”=color;“,graphein,”=write,),。,50,年代，色谱发展最快（一些新型色谱技术的发展；复杂组分分析发展的要求。,1937-1972,年，,15,年中有,12,个,Nobel,奖是有关色谱研究的！,色谱分离基本原理,：,使用外力使含有样品的,流动相,（气体、液体或超临界流体）通过一固定于柱或平板上、与流动相互不相溶的,固定相,表面。样品中各组份在两相中进行不同程度的作用。与固定相,作用强,的组份随流动相流出的,速度慢,，反之，与固定相,作用弱,的组份随流动相流出的,速度快,。由于流出的速度的差异，使得混合组份最终形成各个单组份的“带,(band),”,或“区,(zone),”,，对依次流出的各个单组份物质可分别进行定性、定量分析。,色谱分类方法：,1.,按固定相外形分：,柱色谱（填充柱、空心柱）、平板色谱（薄层色谱和纸色谱。,2.,按组份在固定相上的分离机理分：,吸附色谱：不同组份在固定相的吸附作用不同；,分配色谱：不同组份在固定相上的溶解能力不同；,离子交换色谱：不同组份在固定相（离子交换剂）上的亲和力不同；,凝胶色谱（尺寸排阻色谱）不同尺寸分子在固定相上的渗透作用。,色谱分离过程（色谱图）,混合组分的分离过程及检测器对各组份在不同阶段的响应,色谱术语：,1,）,基线,：在实验条件下，色谱柱后仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线称为基线，,S/N,大的、稳定的基线为水平直线。,2,）,峰高,：色谱峰顶点与基线的距离。,3,）,保留值,(Retention value,R),a.,死时间,(Dead time,t,0,),：不与固定相作用的物质从进样到出现峰极大值时的时间，它与色谱柱的空隙体积成正比。由于该物质不与固定相作用，因此，其流速与流动相的流速相近。据,t,0,可求出流动相平均流速,b.,保留时间,t,r,：试样从进样到出现峰极大值时的时间。它包括组份随流动相通过柱子的时间,t,0,和组份在固定相中滞留的时间。,c.,调整保留时间,：某组份的保留时间扣除死时间后的保留时间，它是组份在固定相中的滞留时间。即,由于时间为色谱定性依据。但同一组份的保留时间与流速有关，因此有时需用保留体积来表示保留值。,d.,死体积,V,0,：色谱柱管内固定相颗粒间空隙、色谱仪管路和连接头间空隙和检测器间隙的总和。勿略后两项可得到：,其中，,F,co,为柱出口的载气流速,（,mL,/min),，其值为：,F,0,-,检测器出口流速；,T,r,-,室温；,T,c,-,柱温；,p,0,-,大气压；,p,w,-,室温时水蒸汽压。,e.,保留体积,V,r,：指从进样到待测物在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。,f.,调整保留体积,：某组份的保留体积扣除死体积后的体积。,g.,相对保留值,r,2,1,：组份,2,的调整保留值与组份,1,的调整保留值之比。,注意：,r,2,1,只与,柱温,和,固定相,性质有关，而与柱内径、柱长,L,、填充情况及流动相流速无关，因此，在色谱分析中，尤其是,GC,中广泛用于定性的依据！,具体做法：固定一个色谱峰为标准,s,，然后再求其它峰,i,对标准峰的相对保留值，此时以,表示：,1,又称选择因子,(Selectivity factor),。,h.,区域宽度,：用于衡量柱效及反映色谱操作条件下的动力学因素。通常有三种表示方法：,标准偏差,：,0.607,倍峰宽处的一半。,半峰宽,W,1/2,：峰高一半处的峰宽。,W,1/2,=2.354,峰底宽,W,：色谱峰两侧拐点上切线与基线的交点间的距离。,W=4,色谱曲线的意义：,色谱峰数,=,样品中单组份的最少个数；,色谱保留值,定性依据；,色谱峰高或面积,定量依据；,色谱保留值或区域宽度,色谱柱分离效能评价指标；,色谱峰间距,固定相或流动相选择是否合适的依据。,12.2,色谱法基本原理,两组份峰间距足够远：由各组份在两相间的分配系数决定，即由色谱过程的,热力学,性质决定。,每个组份峰宽足够小：由组份在色谱柱中的传质和扩散决定，即由色谱过程,动力学,性质决定。,因此，研究、解释色谱分离行为应从热力学和动力学两方面进行。,一、塔板理论,分配系数,(Distribution constant,K),：,一定温度、压力下，组份在固定相和流动相间的分配达到平衡时的浓度比，称为分配系数。,K,只与固定相和温度有关，与两相体积、柱管特性和所用仪器无关。,2.,分配比,(Retention factor or capacity factor,k),：,在一定温度和压力下，组份在两相间的分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的,质量,比，称为分配比。它反映了组分在柱中的迁移速率。又称保留因子。,3.,K,与,k,的关系：,称为相比率，它也是反映色谱柱柱型特点的参数。对填充柱，,=635,；对毛细管柱，,=60600,。,4.,选择因子,：色谱柱对,A,、,B,两组分的选择因子,定义如下：,A,为先流出的组分，,B,为后流出的组分。,注意：,K,或,k,反映的是某一组分在两相间的分配；而,是反映两组分间的分离情况！当两组分,K,或,k,相同时，,=1,时，两组分不能分开；当两组分,K,或,k,相差越大时，,越大，分离得越好。也就是说，两组分在两相间的分配系数不同，是色谱分离的先决条件。,和,k,是计算色谱柱分离效能的重要参数！,色谱基本保留方程（第,213,页）,（二）塔板理论,（,Plate theory),1952,年，,Martin,等人提出的塔板理论将一根色谱柱当作一个由许多塔板组成的,精馏塔，,用塔板概念来描述组分在柱中的分配行为。塔板是从精馏中借用的，是一种,半经验理论,，但它,成功地解释了色谱流出曲线呈正态分布,。,塔板理论假定：,1,）塔板之间不连续；,2,）塔板之间无分子扩散；,3,）组分在各塔板内两相间的分配瞬间达至平衡，达一次平衡所需柱长为理论,塔板高度,H,；,4,）某组分在所有塔板上的分配系数相同；,5,）流动相以不连续方式加入，即以一个一个的塔板体积加入。,当塔板数,n,较少时，组分在柱内达分配平衡的次数较少，流出曲线呈峰形，但不对称；当塔板数,n50,时，峰形接近正态分布。,根据呈正态分布的色谱流出曲线可以导出计算塔板数,n,的公式，用以评价一根柱子的柱效。由于色谱柱并无真正的塔板，故塔板数又称,理论塔板数,：,可见理论塔板数由组分保留值和峰宽决定。,若柱长为,L,，则每块理论塔板高度,H,为,由上述两式知道，理论塔板数,n,越多、理论塔板高度,H,越小、色谱峰越窄，则柱效越高。,但上述两式包含死时间,t,0,，它与组分在柱内的分配无关，因此不能真正反映色谱柱的柱效。通常以有效塔板数,n,eff,和有效塔板高度,H,eff,表示：,有关塔板理论的说明：,1,）说明柱效时，必须注明该柱效是针对何种物质、固定液种类及其含量、流动相种类及流速、操作条件等；,2,）应定期对柱效进行评价，以防柱效下降、延长柱寿命。,3,）塔板理论描述了组分在柱内的分配平衡和分离过程、导出流出曲线的数学模型、解释了流出曲线形状和位置、提出了计算和评价柱效的参数。,但该理论是在理想情况下导出的，未考虑分子扩散因素、其它动力学因素对柱内传质的影响。因此它不能解释：,峰形为什么会扩张？,影响柱效的动力学因素是什么？,三、,速率理论,（,Rate theory,）,1956,年，荷兰化学工程师,van,Deemter,提出了色谱过程动力学速率理论：吸收了塔板理论中的板高,H,概念，考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而给出了,van,Deemter,方程：,u,为流动相线速度；,A,，,B,，,C,为常数，其中,A,分别表示涡流扩散系数；,B,分子扩散系数；,C,传质阻力系数（包括液相和固相传质阻力系数）。,该式从动力学角度很好地解释了影响板高（柱效）的各种因素！任何减少方程右边三项数值的方法，都可降低,H,，从而提高柱效。,1,）,涡流扩散项,(,Multipath,term,A),在填充柱中，由于受到固定相颗粒的阻碍，组份在迁移过程中随流动相不断改变方向，形成紊乱的“涡流”：从图中可见，因填充物颗粒大小及填充的不均匀性,同一组分运行路线长短不同,流出时间不同,峰形展宽,。,展宽程度以,A,表示：,A=2d,p,其中,d,p,填充物平均直径；,填充不规则因子。,可见，使用细粒的固定相并填充均匀可减小,A,，提高柱效。对于空心毛细管柱，无涡流扩散，即,A=0,。,流动方向,2,）分子扩散项,(Longitudinal diffusion term,B/u),纵向分子扩散,是由于,浓度梯度,引起的。当样品被注入色谱柱时，它呈“塞子”状分布。随着流动相的推进，“塞子”因浓度梯度而向前后自发地扩散，使谱峰展宽。其大小为,B=2D,称为弯曲因子，它表示固定相几何形状对自由分子扩散的阻碍情况；,D,组分在流动相中的扩散系数。组份为气体或液体时，分别以,D,g,或,D,m,表示；,讨论：,分子量大的组分，,D,g,小，即,B,小,D,g,随柱温升高而增加，随柱压降低而减小；,流动相分子量大，,D,g,小，即,B,小；,u,增加，组份停留时间短，纵向扩散小；,（,B/u,）,对于液相色谱，因,D,m,较小，,B,项可勿略。,球状颗粒；,大分子量流动相；,适当增加流速；,短柱；,低温。,3,）传质阻力项,(Mass-transfer term,Cu),因传质阻力的存在，使分配不能“瞬间”达至平衡，因此产生峰形展宽。气相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为流动相，二者传质过程不完全相同。下面分别作讨论。,气液色谱：,传质阻力项,C,包括,气相,传质阻力系数,C,s,和,液相,传质阻力系数,C,l,。,流动相,固液界面,固定液,组分分子,C,l,C,g,讨论：,减小填充颗粒直径,d,p,；,采用分子量小的流动相，使,D,g,增加；,减小液膜厚度,d,f,，,C,l,下降。,但此时,k,又减小。,因此，当保持固定液含量不变时，可通过,增加固定液载体的比表面来降低,d,f,。但比,表面过大又会因吸附过强使峰拖尾。,增加柱温，可增加,D,l,，但,k,值也减小，为保,持合适,C,l,值，应控制柱温。,4,）流速,u,由,van,Deemter,方程,H=A+B/u+Cu,知道：,当,u,一定时，仅在,A,、,B,、,C,较小时，,H,较小，柱效较高；反之则柱效较低，色谱峰将展宽。,以,u,对,H,作图，可得,H-u,曲线（如图），从该曲线得到：,涡流扩散项,A,与流速,u,无关；,低流速区,(,u,小,),，,B/u,大，分子扩散项占主导，此时选择分子量大的气体如,N,2,和,Ar,为载气，可 减小扩散，提高柱效；,高流速区,(,u,大,),，,Cu,大，传质阻力项占主导，此时选择分子量小的气体如,H,2,和,He,为载气，可增加扩散系数，提高柱效；,曲线的最低点对应最佳线速,u,opt,(),下的 最小板高,H,min,(),；,板高，,H(cm,),H,min,A+B/,u+Cu,C,m,u,C,s,u,A,B/u,四、分离度及色谱分离方程,（一）、分离度,(Resolution,R),同时反映,色谱柱效能,和,选择性,的一个综合指标。也称总分离效能指标或分辨率。其定义为：,利用此式，可直接从色谱流出曲线上求出分离度,R,。,R,越大，相邻组分分离越好。当,R=1.5,时，分离程度可达,99.7%,，因此,R=1.5,通常用作是否分开的判据,。,R=1.5,R=0.75,R=1.0,响应信号,保留时间,t,min,(,二,),、色谱分离方程,R,的定义并未反映影响分离度的各种因素。也就是说，,R,未与影响其大小的因素：柱效,n,、选择因子,和保留因子,k,联系起来。,对于相邻的难分离组分，由于它们的分配系数,K,相差小，可合理假设,k,1,k,2,=k,，,W,1,W,2,=W,。因此可导出,R,与,n,（,n,eff,）、,和,k,的关系：,217,页,70%CH,3,OH,+30H,2,O,60%CH,3,OH,+40H,2,O,50%CH,3,OH,+50H,2,O,40%CH,3,OH,+60H,2,O,溶剂,(,流动相,),组成对色谱分离的影响,1,：,9,10-,蒽醌；,2,：,2-,甲基,-9,10-,蒽醌；,3,：,2-,乙基,-9,10-,蒽醌,4,：,1,4-,二甲基,-9,10-,蒽醌；,5,：,2-,特丁基甲基,-9,10-,蒽醌；,改变组成 使,k,最佳,色谱分离中的问题,由于分析物组成复杂，以某组成的流动相可能使部分待测物得到好的分离，但同时出使其它待测物的分离不令人满意！实际工作中采用程序升温,（,GC,）,和梯度淋洗,（,LC,）,来解决这个问题。,概念、表示方法及计算公式汇总,表,-1,表,-2,第三节 气相色谱法,一,、,气相,色谱的,过程,及,特点,二、,气相,色谱仪,三、,气相,色谱的,固定相,四、,定性,分析与,定量,分析,一、气相色谱的,过程,及,特点,过程：,待测样品,被蒸发为,气体,以惰性气体为载气将其带入柱内进行分离。其分离原理是基于待测物在气相和固定相之间的吸附,-,脱附或分配来实现的。,一、气相色谱的,过程,及,特点,特点,:,选择性好,柱效高,灵敏度高,H,2,N,2,或,Ar,气路系统,进样,系统,检测系统,分离系统,温控系统,二、气相色谱仪,气相色谱仪的,组成部分,气路系统,进样系统,分离系统,温度控制系统,检测记录系统,（一）气路系统,(Carrier gas supply),功能,：获得纯净、流速稳定的载气。,组成,：包括载气、流量计、压力计及气体净化装置。,载气,：要求化学惰性，不与有关物质反应。载气的选择除了要求考虑对柱效的影响外，还要与分析对象和所用的检测器相配。,流量计,：,在柱前使用,转子流量计，在柱后以皂膜流量计测流速。许多现代仪器装置有电子流量计，并以计算机控制其流速保持不变。,（二）进样系统,(Sample injection system),mL,-1,常以微量注射器穿过隔膜垫或六通阀将液体样品注入气化室,(,汽化室温度比样品中最易蒸的物质的沸点高约,50,o,C,),，,进样量、进样速度、试样的气化速度,影响测定的精密度和准确度,（三）分离系统,柱分离系统是色谱分析的心脏部分。分离柱包括,填充柱,和,毛细管柱,。,柱材料,：金属、玻璃、融熔石英、,Teflon,等,填充柱,：多为,U,形或螺旋形，内径,24 mm,，长,16m,，由柱管和,固定相,组成。,毛细管柱,：又叫开管柱。通常将,固定液,均匀地涂渍或交联到内径,0.10.5mm,的毛细管内壁，长达几十至,100m,。通常弯成直径,1030cm,的螺旋状。,毛细管柱,的特点,毛细管柱因没有涡流扩散、传质快，气体在柱中的阻力小，因而分离效率高,(,n,可达,10,6,),、分析速度快、样品用量小。,毛细管柱由于固定液的厚度小，分配比小，允许进样量小，柱容量低。,柱温：,是影响,分离,的最重要的因素（,why?,）。其变化应小,0.x,o,C,。,选择柱温,主要是考虑样品待测物沸点和对分离的要求。,柱温通常要,等于或略高于,样品的平均沸点,(,分析时间,20-30min,),；对宽沸程的样品，应使用程序升温方法。,恒温：,45,o,C,程序升温：,30180,o,C,恒温：,145,o,C,温度低，分离效果好，但分析时间长,程序升温，分离效果好，且分析时间短,温度高，但分析时间短，但分离效果差,程,序,升,温,与,恒,温,对,分,离,的,影,响,比,较,程序升温,:,在分析周期内使柱温按预定的升温程序,由低向高,逐渐变化，使,不同沸点的组份,在各自最佳的温度流出，改善分离效果。,（四）温控系统,温度控制是否准确，升降温速度是否快速是市售色谱仪器的最,重要指标,之一。,控温系统包括对,三个部分的控温,，即气化室、柱箱和检测器。,控温方式,：恒温和程序升温。,（五）检测器,气相色谱检测器种类繁多，最为常用的几种检测器是：,1.,热导检测器,(Thermal conductivity detector,TCD);,2.,氢火焰离子化检测器,(Flame ionized detector,FID);,3.,电子捕获检测器,(Electron capture detector,ECD);,4.,火焰光度检测器,(Flame photometric detector,FPD);,5.,氮磷检测器（,NPD,）,也称热离子检测器,(,Thermionic,detector,TID);,6.,原子发射检测器,(Atomic emission Detector,AED),7.,硫荧光检测器（,Sulfur,chemiluminescence,Detector,SCD,）,1.,热导检测器,(TCD),原理：,由于不同气态物质所具有的热传导系数不同，当它们到达处于恒温下的热敏元件时，其电阻将发生变化，通过某种方式将其转化为可以记录的电压信号，从而实现其检测功能。,构成：,由池体和热敏元件构成。通常将参比臂和样品臂组成,Wheatstone,电桥。,特点：,对任何气体均可产生响应，因而通用性好，而且线性范围宽、价格便宜、应用范围广。但灵敏度较低。,TCD,工作原理示意图,单臂,四臂,柱前,柱前,柱后,柱后,A,B,2.,氢,火焰电离检测器,（,FID,）,结构：,主体为离子室，内有火焰喷嘴、极化电极（阴极）和信号收集极（阳极）。,原理：,含,碳有机物,在,H,2,-Air,火焰中燃烧产生碎片离子，在电场作用下形成离子流，根据离子流产生的电信号强度，检测被色谱柱分离的组分。,FID,检测结构示意图,FID,特点：,1,）灵敏度高,(10,-13,g/s),；,2,）线性范围宽,(,10,7,数量级,),；,3,）噪声低；,4,）耐用且易于使用；,5,）用峰高定量时，应控制流速恒定！,6,）对无机物、永久性气体和水基本无响应,7,）对含羰基、羟基、卤代基和胺基的有机物灵敏度很低或根本无响应。,8,）样品受到破坏。,3.,电子捕获检测器,(ECD),应用范围：,ECD,主要对含有较大电负性原子的化合物响应。它特别适合于环境样品中卤代农药和多氯联苯等微量污染物的分析。,原理及工作过程：,从色谱柱流出的载气,(,N,2,或,Ar,),被,ECD,内腔中的,放射源电离，形成次级离子和电子,(,此时,电子减速,),，在电场作用下，离子和电子发生迁移而形成电流,(,基流,),。当含较大电负性有机物被载气带入,ECD,内时，将捕获已形成的低速自由电子，生成负离子并与载气正离子复合成中性分子，此时，基流下降形成“倒峰”。,63,Ni,或,3,H,U,U,过高，电子速度快，不易捕获,通常为基流电压的,2/3,电子扑获检测器示意图,4.,火焰光度检测器（,FPD,）,原理：,FPD,是对含,S,、,P,化合物具有高选择性和高灵敏度的检测器。待测物在低温,H,2,-Air,焰中燃烧产生,S,、,P,化合物的分解产物并发射特征分子光谱。测量光谱的强度则可进行定量分析。,FPD,结构：,喷嘴,+,滤光片,+,光电管。,滤光片,放大器,记录仪,光电管,石英窗,H,2,Air,载气,+,组分,出口,FPD,特点：,1,）对含,S,、,P,化合物有较高灵敏度和一定的选择性；,2,）对卤素气,X,2,、,N,2,、,Sn,、,Cr,、,Se,和,Ge,等也有响应；,3,）相对其它检测器如,ECD,和,FID,，,FPD,价格较贵。,4,）对测,S,的灵敏度比硫荧光检测器,(SCD),低；,含,S,、,P,化合物在氢焰中的变化过程如下：,三、气相色谱固定相,分离柱中,固定相,组成与性质直接,影响分离效能,。固定相分为两类：,1,）固体固定,相,2,）液体固定,相,(,一,),、固体固定相,利用固体表面有一定,活性的基团,对不同物质的吸附能力差别进行分离。主要用于分离小分子量的永久气体及烃类。,(,二,),、液体固定相,载体,+,固定液,气液色谱固定相由载体和固定液构成。载体为固定液提供大的惰性表面，以承担固定液，使其形成薄而匀的液膜。,1.,载体,(,也称担体,),对载体的要求,：粒度均匀、高强度的球形小颗粒；至少,1m,2,/g,的比表面；高温下呈惰性；并可被固定液完全浸润。）,载体类型：,分为硅藻土型和非硅藻土型，前者又分为白色和红色担体。,载体的处理,：硅藻土含有硅醇基，不完全化学惰性，需进行化学处理。如与硅烷化试剂反应，生成硅醚。或进行酸洗、碱洗处理。,2.,固定液及其选择,对固定液的要求,：,a),热稳定性好、蒸汽压低,流失少；,b),化学稳定性好,不与其它物质反应；,c),对试样有合适的溶解能力,分配系数,K,适当；,d),对各组分具有良好的选择性。,固定液的分类：,固定液最常用的分类方法是,按极性,进行分类。,相对极性,P,：规定非极性固定液角鲨烷的极性为,0,，强极性固定液,-,氧二丙腈的极性为,100,，例如丁二烯和正已烷分别在,角鲨烷、,-,氧二丙腈及待测固定液柱上测定所选物质对的相对保留值，并取对数：,从下列公式求得待测固定液的相对极性,P,x,：,其中,q,1,q,2,q,x,分别表示物质对在,角鲨烷、,-,氧二丙腈和待测固定液的相对保留值。,P,x,在,0100,之间，每,20,单位为一级，即将极性分为,5,级：,0,+1,(,非极性,),；,+1,+2,(,弱极性,),；,+3,(,中等极性；,+4,+5,(,强极性,),固定液分类及选择：,固定液选择：,按,“相似相溶”,原理选择固定液。,非极性组分,非极性固定液,沸点低的物质先流出；,极性物质,极性固定液,极性小的物质先流出；,各类极性混合物,极性固定液,极性小的物质先流出；,氢键型物质,氢键型固定液,不易形成氢键的物质先流出；,复杂混合物,两种或以上混合固定液,四、定性与定量分析,试样的,预,处理,定性,分析,定量,分析,试样的预处理,化学衍生化,在气相色谱分析中，通过合适的化学反应,改变组分的色谱分离性质,，以及利用生成特殊衍生物改进组分的分离或,增强检测器响应,的方法称为,化学衍生化法,。,例,强极性的三乙醇胺在柱中保留时间过长，不适于气相色谱分析。若先让其转变为极性较小的三甲基硅烷基衍生物，则可减少保留时间，获得较好的分高效果。,金属离子一般不能直接用气相色谱分离，但用,一二酮类试剂与金属离子反应形成挥发性螫合物后，即可用气相色谱法分离。,试样的预处理,裂解色谱技术,在气相色谱法中，将一些,难挥发,的固体试样在裂解器中裂解成低分子碎片后，再由载气带入色谱仪进行分析的技术称为裂解色谱技术。,试样的预处理,分离与富集,在气相色谱分离前，有时还需预先把,不适于气相色谱直接分离,的物质如无机盐、高聚物等从试样中分离除去，或对低含量组分进行预富集。,例如,当试样中含有,大量的水、乙醇,或其它能被固定相强烈吸收的物质时，会使一些色谱柱损坏，需要预先分离除去。,对试样中某些,痕量,组分分析时，因检测器灵敏度不能满足要求，常需要预先进行富集。,（二）定性分析,1,、利用,保留值,与,已知物,对照,定性,当有待测组分的纯样品时，用对照法进行定性极为简单。实验时，可采用,单柱比较,法,，,双柱比较,法,或,峰高加入,法,。,单柱比较法,在相同的色谱条件下，分别对,已知纯样,及,待测试样,进行色谱分析，得到两张色谱图，然后比较其保留时间或保留体积，当两者的参数相同时，即可认为待测试样中有纯样品那种组分存在。,双柱比较法,在,两个极性完全不同,的色谱柱上，测定纯样品和待测组分在其上的保留参数，如果都相同，则可较准确地判断试样中有与此纯样相同的物质存在。双柱法比单柱法更为可靠，因为有些不同的化合物会在某一固定液上表现出相同的色谱性质。,峰高加入法,将已知,纯样,加入,待测组分,后再进行一次分析，然后与原来的待测组分的色谱图进行比较，若,前者的色谱峰增高,，则可认为加入的已知纯物与样品中的某一组分为同一化合物。当进样量很低时，如果峰不重合，峰中出现转折，或者半峰宽变宽，则一般可以肯定试样中不含与所加已知纯物相同的化合物。,2,、利用保留值,经验规律,定性,碳数规律：,大量实验事实证明，在一定温度下，,同系物,的调整保留时间的对数与分子中碳原子数成线性关系：,lgt,R,=A,1,n+C,1,式中,A,1,和,C,1,是常数，,n,（,n3,）,为分子中的碳原子数。该式说明，如果知道某一同系物中两个或更多组分的调整保留值，则可根据上式推知同系物中其它组分的调整保留值。,2,、利用保留值经验规律定性,沸点规律：,同族具有相同碳数碳链的,异构体化合物,，其调整保留时间的对数和它们的沸点呈线性关系：,lgt,R,=A,2,T,b,+C,2,式中,A,2,和,C,2,均为常数，,T,b,为组分的沸点（,K,）。,由此可见，根据同族同数碳链异构体中几个已知组分的调整保留时间的对数值，就能求得同族中具有相同碳数的其它异构体的调整保留时间。,3,、根据,文献,保留数据定性,相对保留值,定性法,保留指数,定性法,相对保留值定性法,用组分,i,与基准物质,s,的相对保留值,i,s,作为定性指标对未知组分,i,定性的方法称为相对保留值法。,相对保留值定性法,相对保留值只与两组分的,分配系数,有关，不受其它操作条件影响，只要固定相性质与柱温确定，相对保留值就是一个定值。测定时，有关文献提供的组分,i,与某基准物,s,的相对保留值,i,s,可作为初步定性依据。,保留指数定性法,人为规定,正构烷烃的保留指数为其碳数乘,100,，被测物质的保留指数则可采用两个,相邻正构烷烃,的保留指数进行标定。测定时，将碳数为,n,和,n,1,的正构烷烃加到被测物质中进行色谱分析，,x,的保留指数,Ix,可按下式计算：,(,三,),定量分析,当操作条件一定时，被测组分的重量,W,i,或浓度与检测器的响应讯号（峰面积或峰高）成正比：,W,i,=,f,i,A,i,W,i,：,i,的重量；,f,i,：,校正因子；,A,i,：,峰面积。,对称,峰面积测量,这种方法简单、快捷，是常用的近似测量方法，但对窄峰测量的测量误差较大，一般误差为,2.5%,。,A=1.065 h W,1/2,不对称,峰面积的测量,在峰高,0.15,处和峰高,0.85,处分别测量其峰宽，然后取其平均值,A=0.5 h(W,0.15,+W,0.85,),自动积分法测峰面积,自动积分仪能直接测量真实色谱峰的面积，准确快速，并可对分离不完全的峰、不对称的峰进行自动处理，还可以自动打印出峰面积和保留时间，大大提高了自动化程度和定量的准确性。,校正因子,同一物质在不同类型检测器上有不同的响应，而同一量的不同物质在同一种检测器上所产生的讯号大小不同。为了使检测器产生的讯号能真实反映物质的浓度，在定量分析时就要引进校正因子。,绝对,校正因子,在一定操作条件下，进样量,W,i,与峰面积,A,i,成正比。,W,i,=,f,i,A,i,式中,f,i,为绝对校正因子，其,物理意义,是单位峰面积所代表物质的量。,相对,校正因子,相对校正因子，即某物质与标准物质的绝对校正因子的比值，对于,TCD,，,FID,，,ECD,常用的标准物质分别是苯、正庚烷和氯苯，使用时将“相对”二字去掉，随被测组分的计量单位不同。,f,i,=,f,i,/,f,s,定量分析方法,归一化法,内标法,工作曲线法,归一化法,条件,：当样品中各组分,均能流出色谱柱,，并在色谱图上显示色谱峰时，可以使用归一法定量。,计算公式,：,内标法,条件,：,当样品中各组分不能全部流出色谱柱，或检测器不能对组分均产生讯号，且只需要对样品中某几个出现色谱峰的组分进行定量。,具体,做法,：,准确称取样品，加入已知量的纯物质（内标物），根据被测组分和内标物的重量及其峰面积求出该组分含量。,工作曲线法,用合适的溶剂,配制,一系列不同浓度的标准样，在一定操作条件下定量进样，,测定峰面积,后绘出峰面积对浓度的标准曲线。分析样品时，严格控制在与标准物相同的条件下的进样量，由所得峰面积，就可以从标准曲线上查出被测组分的含量。,工作曲线法,第四节 高效,液相,色谱法,特点,：,灵敏、高效、快速。,比气相色谱应用范围广、分离效果好。,易于收集流出组分，利用制备柱进行较大量的制备,。,高效液相色谱仪组成,高效液相色谱仪主要包括,高压输液,系统、,进样,系统、,分离,系统、,检测,系统、,数,据处理,系统及,梯度洗脱,等辅助装置。,高压输液系统,作用,：提供足够恒定的高压，使流动相以稳定的流量快速渗透通过固定相。,组成,：贮液器、高压泵、过滤器和梯度洗脱装置，其,核心部件是高压泵,，要求高压泵应具有输出压力高，输出流量恒定,，,流量设定范围可调。,梯度洗脱装置,作用,：是在分离过程中，按一定的程序连续改变流动相中多种不同性质溶剂的配比，以改变流动相的极性、离子强度或酸度等，从而,提高试样的分离效率,，,缩短分析时间,，使色谱峰形得到改善，提高测定的灵敏度和定量的准确度。,进样系统,在高效液相色谱中，一般采用旋转式六通阀于高压下进样。采用旋转式六通阀进样的优点是进样量可变范围大，耐高压，宜于进样自动化。,分离系统,液相色谱柱一般采用内壁抛光的优质不锈钢管或厚壁玻璃管。为使工作压力不致过高，柱长都比较短，一般在,530cm,，,柱径为,4,5mm,。,柱子的填充取决于柱填料的性能，对于生物胶或离子交换树脂等，因遇到溶剂会膨胀，所以必须采用,匀浆湿法,填充。为了防止颗粒大的填料先沉降而产生分层现象，可采用等密度溶剂,(,四溴乙烷和四氯乙烯混合物,),配成匀浆。用高压泵将其快速压人装有流动相的色谱柱中，经冲洗后，即可使用。,检测记录系统,检测器的,特点,：,灵敏度高、噪声低、线性范围宽、响应快、死体,积小、对温度和流量的变化不敏感。,常用检测器,种类,：,紫外光度检测器、示差折光检测器、荧光检测,器和电化学检测器,紫外光度检测器,紫外光度检测器,(UV),的作用,原理,是依据被分析组分对特定紫外光的选择性吸收，组分浓度与吸光度的关系服从比尔定律。,示差折光检测器,示差折光检测器是依据不同性质的,溶液对光具,有不同的折射率,，通过连续测量溶液折射率的变化，便可测知各组分的含量。,荧光检测器,根据某些物质受激后能产生一定强度荧光的性质，可制成,灵敏度极高的荧光检测器。,电化学检测器,电化学检测器是一薄层电解池。具有电化学氧化还原性质的化合物流进检测器即发生电解，产生的电流经放大而被检测。它适用于有电活性的硝基、氨基等还原基团的有机化合物的检测。,高效液相色谱的类型,液,固吸附色谱,液,液分配色谱,化学键合相色谱,离子交换色谱,离子色谱,凝胶色谱,液,固吸附色谱,原理,：,液,固吸附色谱是基于各组分在固体吸附剂表面上具有不同吸附能力而进行分离。当流动相携带试样组分通过吸附剂时，组分分子和流动相分子对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附。与吸附剂性质类似的组分易被吸附，与吸附剂表面活性中心的几何结构相适应的组分也易于吸附，呈现较高的保留值。,液,固,吸附,色谱,固体吸附剂,主要类型,：,极性的硅胶（,应用最广）,氧化铝,分子筛,非极性的,活性炭,液,固,吸附,色谱,应用：,分离极性不同的试样,分离,含极性基团相同但数目不同的试样,分离异构体,液,液分配色谱,原理,：液,液分配色谱法中常用硅胶作为载体，在其表面涂渍一薄层固定液作为固定相，被分离组分随流动相进入色谱柱在两相间经过反复多次分配，各组分间产生差速迁移，从而实现分离。,液,液分配色谱,固定液类型,：,氧二丙腈、聚乙二醇、角鲨烷等。,液,液色谱流动相应尽可能不与固定液互溶，两者的极性差别应很大。,固定液为极性、流动相为非极性的液,液色谱称为,正相色谱,，反之，则称为,反相色谱,。前者主要用来分离极性化合物，被分离组分按极性从小到大的顺序流出色谱柱；后者主要用来分离非极性化合物，被分离组分流出顺序与前者正好相反。,液,液分配色谱,应用,：,烷烃、烯烃、芳烃、染料、甾族化合物等的分离。,液,液分配色谱,液,液色谱能分离多种类型化合物，如烷烃、烯烃、芳烃、染料、甾族化合物等。,化学键合相色谱,原理,：,化学键合相色谱是通过,共价键,将,有机固定液结合到硅胶载体表面,，而得到,各种性能的固定相。其,最大的特点是：可以通过改变流动相的组成和种类来有效地分离极性、非极性和离子型化合物，所用键合固定相不易流失，适用于梯度洗脱，但使用时应注意键合固定相不适于酸、碱度过大或含有氧化剂的缓冲溶液作流动相体系。,化学键合相色谱,应用,：,目前应用最多的是十八烷基键合硅胶,(,Octadecylsilane,),，,通常称为,ODS,固定相。由于空间障碍，长链烷基键合相键合羟基数减少。,qe,约,30,的表面羟基被键合，但键合分子大，对残余羟基掩盖作用增强，有较高含碳量和更好的疏水性，对各种类型分子结构的试样有更强的适应能力。,ODS,与裸体硅胶相似。,离子交换色谱,原理,离子交换色谱是根据离子交换树脂上可电离的离子与流动相中带相同电荷的组分离子进行可逆交换，这些离子对交换树脂具有不同的亲和力而彼此分离。,离子交换色谱,类型,：,以微粒硅胶为基质，用化学键合的方法将离子交换基团键合在硅胶表面而成。,以苯乙烯与二乙烯苯的交联共聚物为基质，在它的网状结构上引人各种酸碱性基团作为交换基团。,离子交换色谱,应用,：适于分析在溶剂中能形成离子的组分，不仅广泛用于无机离子的分离，亦可用于有机物和生物物质，如蛋白质、氨基酸、核酸等的分离。,离子色谱,原理,：离子交换树脂作为固定相，电解质溶液为流动相，用电导检测器检测。为消除流动相中强电解质背景离子的干扰，设置了化学抑制柱。,离子色谱,应用,：,待测阴离子随流动相通过离子交换树脂时发生离子交换反应。至今离子色谱是分离分析常见无机混合阴离子唯一快速、灵敏、准确的分析方法。,凝胶色谱,原理,凝胶色谱的固定相是一种表面惰性、含有许多,不同尺寸的孔穴,或立体网状结构的凝胶。当被分离混合物通过凝胶色谱柱时，比固定相孔穴尺寸大的分子不能进入孔穴而被排斥，先流出色谱柱。尺寸小的组分分子则渗入其中最后流出。中等大小的分子则可渗人较大的孔穴中，但受到较小孔穴的排斥。因此被分离组分依相对,分子质量由高到低的顺序,依次流出色谱柱。,第五节 色谱分离方式的选择,根据相对分子质量选择,根据溶解性选择,根据分子结构选择,根据相对分子质量选择,相对分子质量低的试样,(400),因其挥发性强，宜采用气相色谱分离；,相对分子质量大于,2000,的化合物可采用液相色谱分离；,相对分子质量介于,4002000,范围内的分子，应视试样性质选用液,固吸附色谱、液,液分配色谱或离子交换色谱分离。,根据溶解性选择,水溶性离子化合物与共价化合物可分别采用离子交换色谱或液,液分配色谱分离。,对于非水溶性化合物，若易溶于烃类溶剂，可采用液,固吸附色谱分离；若溶于二氯甲烷或氯仿，可采用液,固吸附色谱或正相液,液分配色谱分离；若溶于甲醇，则用反相液,液分配色谱分离。,根据分子结构选择,液,固吸附色谱适用于异构体分离；,液,液分配色谱可用于