色谱技术（仪器技术）_43页.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二章 色谱技术,2.1,色谱法的基本原理,色谱法：利用混合物中各组分在两相中分配系数不同，当流动相推动样品通过固定相时，在两相中进行连续反复、多次分配，从而形成差速移动，达到分离。,2.1.1,色谱法分类：,1),按固定相及流动相的状态分类：液相色谱、气相色谱,2),按固定相形状性质分类：柱色谱、纸色谱、薄层色谱,3),按色谱过程的机理分类：,吸附色谱,：用固体吸附剂作固定相，利用组分在吸附剂上吸附力的不同，因而吸附平衡常数不同而将组分分离,分配色谱,：用液体作固定相，利用组分在液相中的溶解度不同，因而分配系数不同进行分离,离子交换色谱,：利用离子交换原理,排阻色谱,：利用分子大小不同,电色谱,：利用带电物质在电场作用下移动速度不同进行分离,4),亦可按仪器分,:,a,气相色谱,(Gas chromatography),填充柱气相色谱（,Packed column gas chromatography,）,毛细管气相色谱,(Capillary column gas chromatography),裂解气相色谱,(,Pyrolysis,gas chromatography),顶空气相色谱,(Headspace gas chromatography),气相质谱联用技术（,Gas chromatography-Mass spectrometry,）,b,液相色谱仪,(Liquid chromatography),高效液相色谱,(High performance liquid chromatography),超临界流体色谱,(Supercritical fluid chromatography),高效毛细管电泳,(High performance capillary electrophoresis),毛细管电色谱,(Capillary,electrochromatography,),液相质谱联用技术（,Liquid chromatography-Mass spectrometry,c,平面色谱法（,Planar chromatography,）,薄层色谱,(Thin layer chromatography),薄层电泳色谱,(Thin layer electrophoresis),纸色谱,(Paper chromatography),2.1.2,色谱图的重要参数,1.,色谱峰,峰宽（,W,或,Y,）半峰宽（,W,1/2,Y,1/2,),峰高（,H,）,标准偏差,(,)Y,4,亦称曲折点,峰宽，即峰高,0.607,处峰的宽度。,2.,时间保留值,死时间,t,0,，,保留时间,t,R,，,校正保留时间,t,R,t,R,-t,0,3.,体积保留值,死体积,V,0,=t,0,F,c,，,F,c,-,流动相的流速,保留体积,V,R,=,t,R,F,c,，,校正保留体积,V,R,=t,R,F,c,4.,相对保留值（分离因子，,）,t,R1,/t,R2,5.,分配比（,K),和相比（,）,分配比是指平衡时，组分在固定相和流动相中的重量比,6.,分配系数,(K),在一定温度时,达到分配平衡后,组分在固定相中的浓度,(C,s,),与在流动相中的浓度,(C,m,),之比为分配系数,.,K=,C,m,C,s,物理意义：,1.,t,R,相同（,2,以内）或相对保留时间相同的是同一物质,2.,，,Y,1/2,Y,也是定性的主要参数,3.,峰面积和峰高是定量的主要参数,峰面积越大，峰高越高，含量越高,当,t,R,较短，用峰高作定量的根据,当,t,R,较长，用峰面积作定量根据,4.,峰宽或半峰宽是衡量柱效的指标或参数。,5.,谱带宽度越窄，表明柱效越高。,对于,GC,，用选择固定液的办法。对于,LC,，用选择流动相配比的办法。再加上程序升温（,GC,）或梯度淋洗（,LC,）等技术，将是提高分离度的有效办法。,2.1.3,塔板理论,塔板理论是,Martin,和,Synger,首先提出的色谱热力学平衡理论。它把色谱柱看作分馏塔，把组分在色谱柱内的分离过程看成在分馏塔中的分馏过程，即组分在塔板间隔内的分配平衡过程。,柱长,L,H,V,塔板理论的基本假设为：,1,）柱内各段塔板高度,H,不变，柱子塔板数,N,L/H,2,）在塔板高度,H,内，组分在两相间达到瞬间平衡,3,）流动相以脉冲方式进入一个体积,4,）分配系数,K,在每个塔板上均不变，是常数,5,）组分加在,0,号塔板上，轴向扩散可忽略,0 1 2 3 4 5,理论塔板数：,N,L/H=16(),2,=5.54(),2,N,的物理意义：,说明组分在柱中反复分配平行的次数的多少，,N,越大，平衡次数越多，组分与固定相的相互作用力越明显，柱效越高。,色谱峰窄，塔板数,n,多，理论塔板高小，柱效能高。因而,n,或,h,作为描述柱效能的一个指标。,2.2,气相色谱,定义：气相色谱是用气体作为流动相的色谱法。,GC,特点：,1,、高选择性：理化性质极为相似的组分均可分离。如二甲苯的三个异构体均可容易分离。,2,、高效能：填充柱：几千塔板。毛细管柱：,100,万塔板数,3,、高灵敏度：可检测,10,7,至,10,13,g,的物质。,4,、分析速度快：一般几分钟到几十分钟。,5,、应用范围广：约占物质总量的,15,以上，凡是能气化或衍生后能气化的物质均能测定。,气相色谱系统,记录仪,色谱,处理机,气体钢瓶,色谱主机,空气压缩机,气相色谱仪整机,气,相,色,谱,整,机,钢瓶与减压阀,氮气,氢气,气相色谱仪主机,控,温,柱,室,色,谱,电,路,控,制,气相色谱仪柱室,控,温,柱,室,控温方式：恒温或程序控温,2.2.1,气相色谱一般流程,钢瓶,减压阀,净化器,稳压阀,转子流量计,进样口,色谱柱,检测器,记录仪,气路系统：氧气，氢气（绿色）、氮气（黑色）、,CO,2,或氩气,氦气等惰性气体,(,灰色,),。,进样系统：注射器进样、阀门进样,色谱分离系统：柱室（单柱路、双柱路）,温控系统：汽化室、柱室、检测器,检测系统：,TCD,、,FID,；,(,单、双,),信号处理系统：记录仪、色谱处理机、色谱工作站,1,4,2.2.2,固定相,1,）固体固定相,a,常用的固体吸附剂：活性炭，硅胶，氧化铝，分子筛等,作用机理：吸附占主导地位,b,新型的固体固定相：高分子多孔微球,低温时，吸附占主导地位，高温时分配占主导地位,c,化学键合固定相：分配占主导地位,主要用于分析永久性气体，如低级烷烃、氢、氧、一氧化碳、二氧化碳、氮氧化物、硫化氢等。,2,）液体固定相,组成结构：,担体,+,固定液，前者是具有较大比表面、化学呈惰性的一类物质，后者在色谱使用温度下呈液体膜状态，化学性质稳定，不流失或挥发，主要用于分析较高沸点的有机物。,对固定液的基本要求：,a,蒸汽压要低，使用温度下为液体,b,热稳定要好，不挥发,c,惰性，与分析物质不产生化学反应。,固定液的选择原则：,“,相似相溶,”，选择与试样性质相近的固定相。,A,非极性样品选用非极性固定液（主要作用力为色散力）,流出顺序：沸点低的先流出，同沸点的极性组分先流出,B,中等极性样品选用中等极性固定液（主要作用力为静电力）,流出顺序：沸点低的先流出，同沸点的极性小的组分先流出,C,强极性样品选用强极性固定液（主要作用力为静电力）,流出顺序：极性低的先流出,2.2.3 GC,检测器,1,）热导池检测器（,TCD,）属于通用型，不破坏样品,测量池,参比池,载气,+,组分,载气,稳压电源引线,稳压电源引线,钨丝与固定支架,Rt,Rc,工作原理：,根据所有物质均具有不同的热传导系数，当载气中混有其它气态物质时，热导率会发生变化的原理而设计的。,Rt,Rc,池平衡调节,电流调节,电位差,电源开关,-,+,空气,氢气,载气,点火线圈,收集极,发射极,废气出口,2),氢火焰离子化检测器（,FID,）,破坏样品，具有选择性,原理：被测有机组分在高温环境中发生分解、产生碳的自由基（,CH,），自由基氧化产生电离，在电场中，正、负离子分别向两个电极迁移，形成电流，当电流通过测量电阻时产生压降，再进行放大处理、记录色谱图。,适用范围：它只对含,C,有机物有信号，主要用于有机物分析，对永久性气体，水，,CO,CO,2,N,的氧化物，,H,2,S,CS,2,CCl,4,，,HCOOH,等没有响应，对含,S,，卤素，,O,，,N,P,的有机物响应很小。,2.3,高效液相色谱分析法,high performance liquid chromatograph,，,HPLC,液相色,谱（,liquid chromatograph,，,LC,）是以,液体为载体的一类色谱形式。,HPLC,以经典色谱法为基础，引入气相色谱的理论和实验方法，采用直径,5,10m,多孔耐压填料，填充到更细、更短的不锈钢柱内，流动相改为高压输送，在辅之以在线检测及一系列自动化技术等，发展而成的分离方法。,HPLC,应用范围广，对被测物质活性影响小，只要求样品能制成溶液，而不需要气化，它几乎可以测定食品中所有的非挥发性物质。,高灵敏的,HPLC,还可以测定水果和蔬菜的杀虫剂残留、有机酸、脂类、氨基酸、毒素（如花生中的黄曲霉毒素）和维生素分析等。,2.2.1,分离过程,液相色谱中,存在两相，一相是以固定床形式存在的固定相，另一相作为载体的流动相。,它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的,(,称为固定相,),，另一个相则流过此固定相,(,称为流动相,),并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。,HPLC,与,GC,的比较,共同点,:,1.,色谱基本理论一致,2.,定性定量分析原理一样,差异点,:,1.,流动相差异,组分在液相中的扩散系数比在气相中的扩散系数小,10,4,10,5,倍,与固定相与流动相的作用力不能忽略。,液体流动相多,气体流动相少,可供选择范围广。,2.,固定相差别,GC:,固定液涂在担体上；,HPLC,：固定液用化学键键合在担体上,3.,利用范围更广。,GC 15,，,HPLC 85,以上的物质均可测定。,4.,仪器结构的原理上亦有差别。,2.2.2,分离模式,1),液,-,固吸附色谱,(liquid-solid adsorption chromatography),基本原理：,组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；,固定相：,固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是,5,10m,的硅胶吸附剂；,流动相：,各种不同极性的一元或多元溶剂。,应用范围：,适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性；,缺点：,非线形等温吸附常引起峰的拖尾；,2,）,液,-,液分配色谱,（,liquid-liquid partition chromatography,）,基本原理：,组分在固定相和流动相上的分配；,固定相与流动相均为液体（互不相溶）；,流动相：,对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相,normal phase,），,反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相,reverse phase,）。,正相与反相的出峰顺序相反；,固定相：,早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；,化学键合固定相：,（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。,C-18,柱（反相柱）。,3,）凝胶,色谱（,gel chromatography,）,固定相：,凝胶,(,具有一定大小孔隙分布,),；,基本原理：,按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。,全部在死体积前出峰；,应用范围：,可对相对分子质量在,100-10,5,范围内的化合物按质量分离。,4),亲和色谱,(,Affinity,chromatograph,，,AC),基本原理：,利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。,先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂,(,环氧、联胺等,),，再连接上配基,(,酶、抗原等,),，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。,2.2.3 HPLC,的一般流程,高压泵,A,槽,B,槽,贮液槽,程序控制器,混合室,色谱仪,记录仪,检测器,至废液槽,HPLC,仪由流动相输送系统、进样系统、色谱分离系统、检测系统和数据处理系统组成。,1,）高压输液泵,主要部件之一，压力：,150,35010,5,Pa,。,为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（,10m,），,液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。,应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性,2),进样装置,流路中为高压力工作状态，,通常使用耐高压的六通阀进样装置，,其结构如图所示：,3),高效分离柱,柱体为直型不锈钢管，内径,1,6 mm,，,柱长,5,40 cm,。,发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。,4),液相色谱检测器,a.,紫外可见光检测器,应用最广，对大部分有机化合物有响应。,特点：,灵敏度高；,线形范围高；,流通池可做的很小（,1mm 10mm,，,容积,8L,）；,对流动相的流速和温度变化不敏感；,波长可选，易于操作；,可用于梯度洗脱。,目前主要有三种类型的紫外可见光检测器：固定波长型、可变波长型和二极管阵列式光度计。,其中二极管阵列检测器能够得到每个时段的紫外可见吸收光谱，因此能进一步确认混合物中的组分，并可分析其纯度。,b.,示差折光检测器,除紫外检测器之外应用最多的检测器；,可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值，差值与浓度呈正比。,通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；,灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；,偏转式、反射式和干涉型三种；,c.,荧光检测器,高灵敏度、高选择性；,对多环芳烃，维生素,B,、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；,2.2.4 HPLC,流动相的选择,对流动相的要求：,1.,惰性,2.,对样品有较大的溶解度,3.,对所选用的检测器没有干扰,4.,粘度小,扩散系数要大,以减少传质阻力,5.,纯度高,成本低,6.,毒性小,稳定性好,