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设计RT-PCR引物方法.doc

上传人:1587****927 文档编号:1355874 上传时间:2024-04-23 格式:DOC 页数:21 大小:1.53MB
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设计RT-PCR引物方法 要鉴定某一个基因在mRNA水平上的表达,需要使用Q-PCR的方法。引物设计是很重要的一环,要进行Q-PCR时,获得引物的途径有很多种,其中最为方便的是使用NCBI和primer bank,首先介绍这一方法:比如你要检测某药物对小鼠细胞中IL-2的表达影响,通过Q-PCR检测,要设计引物。 ① 登陆NCBI,选择gene,在选框中输入 IL-2 mus(搜索小鼠IL-2基因)点击搜索 获得结果如下: 选择第一个基因,打开,可以获得gene的ID 利用primer bank和ncbi的gene ID就可以获得前人已经设计好的引物 ② 登陆primer bank (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/),按下图选择NCBI gene ID 选择物种 mouse ,在 for text中输入前面获得的你要检测基因的ID(NCBI的编号) 点击submit 查询,获得如下结果 可以看到其它人设计的好几对引物,基本上是通过实验验证的,做Q-PCR的话直接拿来用就行了,点击绿色高亮的链接可以看到其他人使用这对引物做Q-PCR获得的结果。 二、自己设计Q-PCR引物方法 比如要检测CXCR3的表达,做Q-PCR的扩增目的条带在100bp左右,如果半定量的话(通过跑胶定量)扩增产物一般400bp左右 ① 登陆NCBI,选择gene,在选框中输入 CXCR3 mus(搜索小鼠CXCR3基因)点击搜索 点击打开 将网页往下拖到NCBI reference sequence 选择箭头所示mRNA序列 打开链接 往网页下方拖动,可以看到CDS,点击CDS(编码蛋白区) 出现如下界面,高亮部分为CDS去ATG起始密码子TAA终止密码子 复制CDS区及其附近部分序列,如果要提取基因的话需要完全包括CDS区,如果只是检测的话,比如半定量的话就没必要全部包括。 打开primer 5 软件,新建一个DNA序列 将复制的序列粘贴到选项框中,点击oK 序列就导入了primer 5中,然后单击箭头所指primer,进入引物设计界面 界面如下,点击search,使用primer自动寻找引物功能 进入界面后,分别按下图选取所需要的参数,PCR product size使用默认值即可,primer length一般在20bp左右比较合适 点击OK后进入如下界面,点击OK 出现如下界面,点击rating,按打分排列,打分是100分制,分值越高引物越好,根据自己试验目的,选择打分高的,产物片段400bp左右的引物对,并且Tm温度最好在60以上,有义链和反义链Tm值靠的越近越好,最好不要超过2摄氏度,下图中Tm行中蓝色字体表示有义链的Tm值,红色字体表示反义链Tm值,PCR退火温度一般设置比Tm值低5摄氏度。 我选择的是排行第四的引物对,单击选择后在,引物设计窗口,我们可以看到这对引物的具体情况,下图中红色箭头指的S和A分别指的是有义链和反义链,点击edit primers可以复制编辑引物 选择引物序列,复制到word文档中作为正向引物 点击ok后回到primer 界面后点击A,然后点击Edit primers获得反向引物序列 下面是我获得的引物序列 因为做半定量的模板是整个小鼠基因组,这就需要使用primer-blast验证引物的特异性(是否不会扩增出其它的基因) 进入primer-blast网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) 在primer parameters中输入前面设计的正向引物和反向引物 在primer pair specificity checking中选择database为refseq mRNA ,organism中输入mouse后选择mouse 最后选择如下,选择在新窗口中显示结果,点击get primer。 最后出现如下结果,反馈的结果中就只有一个基因 CXCR3,就是我要检测的基因,证明这对引物的特异性不错,可以用于实验。 并不是选择的每一对引物通过blast后就只有一个基因,很多情况下回出现不是只有一个基因的情况,情况如下图,那就需要再次设计,然后检验,直到获得特异的结果。 获得特异性结果后,可以使用oligo7对所设计的引物进行评价,另外使用primer5的设计的引物在很多情况下总是特异性不是很好,也可以使用oligo7设计引物,oligo7设计的引物特异性会好一些。 使用oligo 7设计引物 新建一个序列 将mRNA的序列粘贴到新建对话框中,选择accept&close 选择search for primers& probes 分别单击paremeters和ranges 在parameters中根据图所示选择引物长度(一般在20bp左右) 在ranges中选择PCR产物的长度范围和设计引物的范围 单击search后出现引物对选择selected oligonucleotides 单击选择评分最高的引物 ,然后选择edit中forward primer 和reverse primer,复制所设计引物到进入primer-blast网站 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)进行特异性检验 选择analysis中的PCR,查看引物的最适退火温度 另外设计RT-PCR 引物最好跨内含子,设计方法如下 问题一:如何在pubmed上找到目标基因的DNA序列以及其内含子和外显子情况。 步骤: 打开NCBI主页面,选GENE,输入基因名称-》显示出很多不同种但名字相同的基因(fig.1)-》找到你要的种属,打开-》显示基因信息,找到”Genomic regions, transcripts, and products”,点击基因名称,links到geneback(fig.2)-》显示了该基因DNA的信息(fig.3),可以看到这是基因组DNA,从mRNA选项中可以看到JION后面的是外显子的位置,该基因一个共有3个内含子,4个外显子,以及外显子的起至位置,为了以后的操作,可以把这个DNA序列和外显子的起至位置记下来。 使用oligo 7设计引物时,在search primer中,正向引物search范围选择在跨内含子区域,然后寻找合适的引物
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