细胞凋亡及机制检测.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,细胞凋亡,（科普诗）,apoptosis,似秋叶的,凋零，,告别生命之辉煌；,那难以计数的攻击、诱导，,轻启着道道程序，,逼细胞步步走向生命的末端；,啊，活性氧处处肆虐，,钙波涛惊石裂岸，,线粒体把生命之光一点一点拧淡,;,危难中的细胞啊，,你沉稳不乱，,DNA,片片切割，,化云梯直通天堂；,细胞体分团相聚，,把生命的凝重浓集在小体上；,分别了朝夕相处的伙伴，,再见了快乐美好的时光；,这一切的一切又融入临近的胞体，,腾出的空间再写生命的篇章。,典型的,凋亡小体（,apoposis,boby,）：,由透亮空泡和不透光的浓密的核碎片两部分组成。,坏死 凋亡,1.,性质,病理性,非特异性,生理性或病理性，特异性,2.,诱导因素,强烈病理性刺激,随机发生,生理性或较弱病理性刺激，非随机发生,3.,生化特点,被动过程,无新蛋白合成,不耗能,耗能的主动过程，有新蛋白合成,4.,形态变化,细胞结构全面溶解、破坏、细胞肿胀,胞膜及,细胞器相对完整细胞皱缩，核固缩,膜可发泡成芽,形成凋亡小体,5.DNA,电泳,弥散性降解，电泳呈均一,DNA,片状,DNA,片段化（,180-120bp,）,电泳呈“梯”状条带,6.,炎症反应,溶酶体,破裂，局部炎症反应,溶酶体,相对完整，局部无炎症反应,7.,凋亡小体,无,有,8.,基因调控,无,有,细胞凋亡与坏死的比较,2002,年,10,月,7,日英国人悉尼,布雷诺尔、美国人罗伯特,霍维茨和英国人约翰,苏尔斯顿，因在细胞程序性死亡方面的研究获诺贝尔生理与医学奖,。,Sydney Brenner,H.Robert Horvitz,John E.Sulston,细胞凋亡与疾病发生机制的,新认识,1.,该,“,死,”,的细胞（如,肿瘤细胞、自身反应性免疫细胞,）,未死,，是造成肿瘤、自身免疫性疾病的主要发病机制之一。,细胞凋亡不足,2.,不该,“,死,”,的细胞（如,神经元、心肌细胞,）,死了,，这与老年性痴呆、心肌缺血,/,再灌注损伤等发病有关。,细胞凋亡过度,胸腺细胞,正常,凋亡,胸腺细胞,正常,凋亡,细胞凋亡的过程,1.,凋亡信号转导,2.,凋亡基因激活,3.,细胞凋亡的执行,4.,凋亡细胞的清除,凋亡过程及分期,诱导期 执行期 消亡期,凋,亡,诱,导,因,素,受,体,cAMP,Ca,2+,神,经,酰,胺,死,亡,信,号,凋,亡,相,关,基,因,激,活,Dnase,激活,Capases,激活,巨噬,细胞,吞噬细胞,凋亡细胞,细胞凋亡的生化改变,1.DNA,的片段化“梯”状条带,2.,内源性核酸内切酶激活及其作用,3.,凋亡蛋白酶（,caspases,）的激活,及其作用,1.DNA,的片段化“梯”状条带为细胞凋亡主要特征,几乎所有凋亡细胞均有核小体间的裂,解，导致,DNA,的断裂；,DNA,降解过程的特异性：不伴有组蛋,白和其它核蛋白的降解；,染色质在核小体间的裂解是凋亡细胞,和形态改变的基础；,DNA fragmentation,是凋亡的“,golden,marker”,。,2.,内源性核酸内切酶激活及其作用,由一系列胞内信号转导环节激活，执行染色质,DNA,切割,3.,Caspase,9,激活，需要通过,CARD,（,caspase,-recruitment domain),、,Apaf-1,、细胞色素,c,、,ATP,等多个因子的参与,Caspases,在凋亡中的主要作用,1.,灭活,细胞凋亡的抑制物（如,Bcl-2,）；,2.,水解,细胞的蛋白质结构，,导致细胞解体，形成,凋亡小体（,apoposis,boby,）；,3.,在凋亡级联反应中水解,相关活性蛋白,，使该蛋白获得或丧失某种生物学功能,细胞凋亡的调控,（一）细胞凋亡相关因素,1.,诱导性因素,2.,抑制性因素,(,二,),细胞凋亡信号的转导,1.,细胞凋亡的诱导因素,.,生理活性因子：,TNF,家族,(,Fas,-L,TNF),、,TGF,、神经递质,(,谷氨酸、多巴胺,),、生长 因子撤退、,GC,等,.,损伤相关因子：热休克、病毒感染、自由基、癌基因、抑癌基因、放射线等,.,化疗药物,.,毒素：乙醇、,-,淀粉样肽,2.,细胞凋亡的抑制因素,.,凋亡相关基因的抑制作用：,p53,、,bcl-2,、,bcl,-XL,等。,.,生理性抑制剂：生长因子、细胞外基质、锌、雄激素、雌激素等,.,病毒基因：腺病毒,E1B,、杆状病毒,p35,、棒状病毒,IAP,、牛痘病毒,CrmA,、,EBV BHRF1,等,.,药物：,Calpain,抑制剂、,caspases,抑制剂、促癌剂、佛波豆蔻乙脂,(PMA),等,(,二,),细胞凋亡信号的转导,凋亡信号转导系统特点,多样性：不同种类的细胞系统不同,偶联性：与增殖分化的信号系统交叉偶联,同一性：多因素，共用同一系统触发,多途性：同一诱导因素启动多条信号转导途径,细胞凋亡信号的转导,诱导信号,cell,R,神经酰胺,多,途径,R,SAPK/JNK,P53,基因,NF-kB,JNK/AP-1,途径,激活,bax,or,下调,bcl-2,ROS,mtDNA,细胞凋亡相关基因,抑制凋亡基因：,bcl-2,促进凋亡基因：,fas,，,P53,双向调控基因：,c-myc,，,bclx,研究较多的有,c-myc,、,bcl-2,、,p53,、,Ice,、,Fas/APO-1,等。,1,.,c-myc,c-myc,诱导细胞增殖，也能诱导细胞凋亡。,当生长因子存在，,bcl-2,基因表达时，促进细胞增殖，反之细胞凋亡。,第一个被确认有抑制凋亡作用的基因，,存在于线粒体外膜、核膜及部分内质网中。,bcl-2,相当于线虫的,ced9,。,Bcl-2,家族可分为两类，一类是抗凋亡的，如：,Bcl-2,；一类是促进凋亡的，如：,Bax,、,Bad,、,Bid,，以二聚体形体发挥作用。,2,.,bcl-2,Bcl-2,抗凋亡机制,直接的抗氧化,抑制线粒体释放促凋亡的蛋白质,抑制促凋亡的,Bax,，,Bak,细胞毒作用,抑制,Caspases,激活,维持细胞钙稳态,3,.,fas,fas,又称作,APO-1,或,CD95,，,属,TNF,受体和,NGF,受体家族。,对细胞凋亡有促进作用,基因产物为,45KD,的跨膜蛋白。,Fas,蛋白与,Fas,配体组成,Fas,系统，二者的结合导致靶细胞走向凋亡。,与,线虫,ced-3,同源，又称为,Caspase,。,ICE,是一种半胱氨酸蛋白酶，在人类，,ICE,家族至少有,11,个成员，每一成员均含有与底物结合及催化的保守序列，识别位点在,Asp,之后，故又称,Caspases,。,启动子,Caspases,：,Caspases8,、,9,和,10,效应子,Caspases,：,Caspases3,、,6,、,7,4.ICE,蛋白酶家族,5.Apaf-1,与线虫的,ced-4,同源；,在线粒体参与的凋亡途径中发挥作用；,能,激活,Caspase3,，这一过程需要细胞色素,c,和,Caspase9,的参与。,6.p53,磷酸化,p53,使细胞处于,G1,期，必要时诱导细胞凋亡。,p21 CDK RB,不被磷酸化,G1,DNA,损伤,p53,并磷酸化,Bax,Bcl,apoptosis,Gadd45 DNA,修复,野生型,P53,基因具有诱导细胞凋亡的功能,“,分子警察”；,细胞凋亡发生机制,（,一）氧化损伤,（二）钙稳态失衡,(,三,),线粒体损伤,（一）氧化损伤机制,氧自由基可破坏机体正常的氧化,/,还原的动态平衡，造成生物大分子的氧化损伤，干扰正常的生命活动，形成严重的,氧化应激状态,后果：诱导细胞凋亡。,氧化应激引起细胞凋亡的可能机制,1.,氧自由基引起的,DNA,损伤可激活,P53,基因引起细胞凋亡。,2.,氧自由基引起的,DNA,损伤可活化多聚,ADP,核糖合成酶，引起,NAD,快速耗竭，,ATP,大量消耗，引发细胞凋亡。,3.,氧自由在攻击细胞膜上的不饱和脂肪酸，通过脂质过氧化作用直接造成细胞膜的损伤可诱导细胞凋亡；此外细胞膜上不饱和脂肪酸（如：花生四烯酸）的氧化产物过氧羟基,24,碳四烯酸有很强的诱发细胞凋亡的作用。,氧化应激引起细胞凋亡的可能机制（续）,4.,氧化应激可激活,Ca2+/Mg2+,依赖的,DNase,，也可产生膜的发泡现象。,5.,氧化应激引起细胞膜结构的破坏，可改变细胞膜的通透性使,Ca2+,内流增加，诱导细胞凋亡。自由基对线粒体膜的损害导致其通透性和膜电位的变化也可诱导细胞凋亡。,6.,氧化应激可活化核转录因子,NF-,B,、,AP-1,，可加速细胞凋亡相关的一些基因的表达，诱发细胞凋亡。,（二）钙稳态失衡引起细胞凋亡的可能机制,1.,激活,Ca2+/Mg2+,依赖的核酸内切酶,(,DNase,),，降解,DNA,链；,2.,激活谷氨酰胺转移酶，催化细胞内肽链间的酰基转移，在肽链间形成共价键，使细胞骨架蛋白分子间发生广泛交联，有利于凋亡小体形成；,3.,激活核转录因子，加速细胞凋亡相关基因的转录；,4.Ca2+,在,ATP,的配合下使,DNA,链舒展，暴露出核小体之间的连接区内的酶切位点，有利于,DNA,内切酶切割,DNA,。,(,三,),线粒体损伤,细胞凋亡的恶性网络假说,线粒体,m,PTP,开放,Apaf+Cyt.C,AIF,Caspase,抑制剂,+,Caspase,9,酶原,Caspase-9,Caspase3酶原,Caspase-3,蛋白质水解,无活性核,酸内切酶,内切酶激活,DNA,断裂,+,+,+,Bcl-2,Ca,2+,apoptosis,？,氧化损伤,钙稳态失衡,线粒体损伤,恶性网络假说,(deleterious network hypothesis),细胞凋亡,m,AIF,，,Apaf,PTP open,细胞凋亡的生物学意义,1.,发育 从低等动物到高等动物的发育，都存在着程序性细胞死亡的现象。,2.,免疫系统 淋巴细胞发育分化成熟过程中，始终伴随着细胞凋亡。,3.,衰老 细胞凋亡与许多年龄相关疾病有直接或间接的联系。,4.,损伤与修复,5.,肿瘤发生 细胞增殖与死亡的速度平衡失调。,6.,病毒致病 病毒表达抗凋亡蛋白。,Hutchinson-Gilford syndrome,细胞凋亡与疾病,（一）细胞凋亡不足,1.,肿瘤,2.,自身免疫病,1.,凋亡与恶性肿瘤,肿瘤的发生不仅与细胞过度增殖有关，还与凋亡障碍有关。,Oncogenes,“anti-,apoptic”genes,Cell division cell death,肿瘤治疗新思路：诱导肿瘤细胞的凋亡,2.,凋亡与免疫系统功能障碍,凋亡对免疫系统功能有重要调节作用,淋巴细胞：在发育过程中有凋亡发生；在晚期，当与抗原相互作用时亦发生凋亡。,胸腺发育过程中的自然凋亡过程,（二）细胞凋亡过度,1.,心血管疾病,（,1,）心肌缺血,与缺血,-,再灌注损伤,（,2,）心力衰竭,（,1,）心肌缺血和再灌注损伤,心肌缺血再灌注后可引起心肌细胞的凋亡，由于心肌组织中吞噬细胞数量有限，故而凋亡细胞可以激发性引起炎性反应，招引中性粒细胞浸润，进而导致心肌组织坏死（心肌梗塞）。,(2),凋亡与心脏病,心脏传导障碍和心律失常,心脏传导系统在胚胎早期就已形成。新生儿窦房结主要有大量起搏细胞（,P,细胞）和少量胶原组成，而成人则为少量,P,细胞和大量胶原构成，可能是,P,细胞凋亡的结果。因此,P,细胞凋亡不足或过度均可引起心律失常。,2.,神经元退性疾病,（,1,）阿尔茨海默病,(AD),（,2,）帕金森病,（,3,）多发性硬化症,(1),凋亡与神经退行性病变,神经元是,non-proliferating,long-lived,terminally differentiated cell,。,神经元等非增殖细胞发生凋亡的意义：,1,、避免细胞重新进入细胞周期，特别是遇,到致转化刺激信号时。如向终末分化的,细胞中转染,oncogene,可引起细胞凋亡，,而非增殖。,(2),为了器官生存的需要,A deleted cell is more advantageous than a damaged cell,even when the cell is irreplaceable.This is analogous to what is frequently referred to as“better dead than wrong”for dividing cell,3.,病毒感染,人免疫缺陷病毒（,HIV,）感染引起的,AIDS,(,凋亡与免疫缺陷性疾病,),典型例子是,AIDS,1.HIV-1,感染后可引起,CD4+T,淋巴细胞的,凋亡，且可能由病毒被膜蛋白复合体,gp120,介导。,2.AIDS,患者外周血淋巴细胞,Fas/Apo,水平,明显提高，可迅速诱导细胞凋亡。,由此，通过控制凋亡过程是否可以预防或延缓,AIDS,的进展。,（,三）细胞凋亡不足与过度并存,动脉粥样硬化,即属于这种情况，对内皮细胞而言是凋亡过度，对平滑肌细胞来说则是凋亡不足,细胞凋亡在疾病防治中的意义,1.,合理利用凋亡相关因素,2.,干预凋亡信号转导,3.,调节凋亡相关基因,4.,控制凋亡相关的酶学机制,5.,防止线粒体跨膜电位的下降,1.,合理利用凋亡相关因素,抑凋亡：,NGF,老年性痴呆,急性,T,细胞白血病：低剂量放射线、,TNF,促凋亡：,局部肿瘤热疗；高温,43,、,30min,前列腺癌：,去势治疗,2.,干预凋亡信号转导,FAS/FASL,信号系统：阿霉素刺激,SPP,（神经酰胺信号系统的代谢产物）：转导增殖信号，拮抗凋亡,AIDS,，,AD,3.,调节凋亡相关基因,野生型,P53,基因转染,4.,控制凋亡相关的酶,核酸内切酶：,Ca,2+,/Mg,2+,依赖性,Ca,2+,Mg,2+,激活；,Zn,2+,抑制,Caspases,:Ca,2+,直接或间接激活,5.,防止线粒体跨膜电位的下降,环胞霉素,A(cyclosporinA,免疫抑制剂）阻抑,m,，其衍生物无免疫抑制作用，但有稳定,m,细胞凋亡的检测,随着研究技术的提高和对凋亡的认识不断深入，检测凋亡的方法已从细胞、染色质到分子水平日趋完善和成熟。,1.,形态学检测,2.DNA,降解分析,3.,凋亡酶学分析,4.,凋亡相关蛋白分析,5.,流式细胞分析,一细胞凋亡的形态学分析,细胞凋亡的形态学变化主要表现为：细胞皱缩,(cell shrinkage),，,失去细胞连接,(cell junction),，,微绒毛,(,microvilli,),消失，发泡,(,blebbing,),，,染色质浓集并靠近核膜，形成沿核膜收缩的新月状体,(crescents),，,形成凋亡小体,(apoptotic body),等。,细胞凋亡的形态学检测方法,检测方法,可鉴定凋亡细胞特征,光学显微镜,相差显微镜,透射电镜,聚焦激光扫,描电镜,扫描电镜,流式细胞仪,缩时摄影术,细胞体积缩小、核浓缩、细胞周围透明圈,细胞发泡、凋亡小体,微绒毛消失、染色质沿核膜分布、新月体状核、凋亡小体,凋亡细胞内固缩染色质及核碎片定位,细胞膜表面泡状鼓起,低前向散射光,(FSC),、,高侧向散射光,(SSC),凋亡细胞的形成过程,二,.DNA,降解分析,DNA,降解过程的特点：,1.,发生于凋亡早期，由内源性核酸内切酶激活引起,2.DNA,在核小体连接部位断裂，产生,180,200bp,为最小单位的单体或寡聚体片断,3.DNA,碎片可被细胞膜包裹，形成凋亡小体,(,一,)DNA,凝胶电泳,原理：凋亡细胞降解产生一系列规则的,DNA,片断，其电泳结果呈典型的“梯状带”,(ladder),；,而坏死或凋亡后坏死细胞的,DNA,分解是随机的，产生的碎片分子量大小不一，在电泳时形成“涂片状”,(smear),。,普通琼脂糖凝胶电泳、,Southern blotting,、,放射自显影,(,32,PdATP,或,32,PdCTP,连接到,DNA,片断的,3,端,),(,二,),原位标记法,TUNEL(TdT,mediated,dUTP,nick,end labeling,),终末脱氧核糖核苷酸转移酶介导的原位缺口末端标记技术。,原理：在,TdT,的作用下，带有标记物的,dUTP,被连接在断裂,DNA3,末端，然后通过相应的方法检测标记物，从而判断是否有凋亡发生。,应用范围：石蜡包埋的组织切片、冰冻组织切片、培养细胞、组织中分离的细胞,(,三,)ELISA,法,原理：以抗组蛋白抗体包被微孔板壁，加入标本，凋亡细胞的核小体可与抗体结合，再加入抗,-DNA,片断,-POD,复合物，与核小体中的,DNA,片断结合，最后加入,POD,显色底物，以酶标仪测定光密度以进行定量分析。,三,.,凋亡酶学分析,1.,内切核酸酶,(,endonuclease,DNase,),种类：,DNase,（,内质网、高尔基体,),DNase,（,溶酶体、胞核,),，,NUC18,（,胞核，胸腺细胞中,),等,作用：,使,DNA,断裂成,180,200bp,或其倍数的片断,激活机制：,CAD(caspase,-activate,DNase,),ICAD(inhibtor,of CAD),检测：,Western Blotting,Caspases,的检测,1.Caspase-3,活性测定,(FIENA,法,),荧光测定免疫吸附法,(,flurometric,immunosorbent,enzyme assay,FIENA),caspase-3,可作用于连接荧光素的特异底物乙酰化天冬氨酸,-,谷氨酸,-,颉氨酸,-,天冬氨酰胺,(Ac-DEVD),产生发荧光的裂解产物,AFC,，且,caspase-3,活性与,Ac-DEVD-AFC,分解的量或自由荧光,AFC,产生荧光的强弱成正比，故可定量检测,2.,蛋白印迹法,Caspases,作用底物的检测,PARP89kD,的检测,四,.,凋亡相关蛋白分析,1.Bcl-2,家族,促进凋亡：,Bax,Bal,Bcl,-Xs,Bad,Bid,Bik,Bim,Hrk,Bok,等,抑制凋亡：,Bcl-2,Bcl,-Xl,Bcl-w,Mcl-1,A1/Bfl-1,等,均含有,BH(Bcl-2 homology),结构域，通过此结构域以二聚体形式调控凋亡。,2.,其他相关蛋白,p53,Myc,Fas,等,五、流式细胞分析,（,Flow,Cytometry,，,FCM,）,利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。,FCM,分析细胞凋亡的方法,一,.,细胞形态分析,二,.,细胞膜结构与功能改变分析,三,.,细胞,DNA,含量分析,四,.TUNEL,法,