分光光度分析法.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,分光光度分析法,Spectrophotometry,一、实验目的,1、,了解分光光度法的基本原理，理解何谓,吸收曲线,。,2、掌握朗伯比尔定律，理解何谓,标准（工作）曲线,。,3、了解显色反应及其影响因素，了解测量条件的选择。掌握光度法测定的条件及方案的拟定方法。,4、了解分光光度计的性能、结构及使用方法；,二、分光光度法基本原理简介,分光光度法（,spectrophotometry,）,是基于物质分子对光的选择性吸收而建立起来的分析方法。,按物质吸收光的波长不同，可分为紫外分光光度法、可见分光光度法及红外分光光度法。,特点：,灵敏度较高,，适用于,微量组分,(,110,g,L,-1,),的测定；,误差较大,，,相对误差,达到,25%,。,电磁波谱：,X,射线 0.1100,nm,远紫外光 10200,nm,近紫外光 200400,nm,可见光 400760,nm,近红外光 7502500,nm,中红外光 25005000,nm,远红外光 500010000,nm,微 波 0.1100,cm,无线电波 11000,m,1、物质的颜色与吸收光的关系,日光：,紫 蓝 青 绿 黄 橙 红,复合光,：,由各种单色光组成的光。,如白光(太阳光),单色,光,：,只具有一种波长的光。,要求：,=2,nm,。,互补色光,：,如果把两种适当颜色的光按一定的强度比例混合也可以得到白光，这两种光就叫互补色光。,物质的颜色是由于物质对不同波长的光具有选择,性的吸收作用而产生的,。,如：,CuSO,4,呈兰色,。,物质呈现的颜色和吸收的光,颜色之间是,互补关系,。,光的互补：蓝,黄,日光,650760,nm,580600,nm,450480,nm,480490,nm,600650,nm,500580,nm,400450,nm,490500,nm,互补光,2、物质的吸收曲线,M +,热,M+,荧光或磷光,E,=,E,2,-,E,1,=,h,各能级是量子化；选择性吸收;,分子结构的复杂性使其对不同波长光的吸收程度不同；,M +,h,M,*,基态 激发态,E,1,（,E,）,E,2,用不同波长的,单色光,照射，测定吸光度，如果以波长,为横坐标，吸光度为纵坐标即可得一条曲线称为,吸收曲线,（,A,曲线,）。,吸收曲线,清楚地描述了物质对光的吸收情况。,max,=510 nm,（1）,不同物质,吸收曲线的形状和吸收波长不同。,MnO,4,-,531,吸收曲线,（2）,同一物质,对不同波长光的吸光度不同；同一物质,不同浓度,，其吸收曲线形状相似。,吸收曲线是,特征,的，可以提供物质的结构信息，作为,物质,定性,分析,的依据之一；吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。,3,、,光的吸收定律,朗伯-比耳定律,吸光度,A,：,物质对光的吸收程度。,定义：,A,lg,（,I,0,/,I,t,),A,越大，表示对光的吸收越大，透过光越弱。,1760年朗伯(,Lambert),阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系：,A,b,1852年比耳(,Beer),又提出了光的吸收程度和吸收物浓度之间也具有类似的关系：,A,c,二者的结合称为朗伯比耳定律，,A,bc,朗伯,比耳定律数学表达式,：,A,lg,（,I,0,/,I,t,)=,b c,式中：,A,，,吸光度，无量刚；,b,，,液层厚度(光程长度)，,cm,；,c,，,溶液的浓度，,mol,L,-1,；,称为,摩尔吸光系数,，,Lmol,-,cm,-1,，,仅与入射光波长、溶液的性质及温度有关，与浓度无关。,上式表明：,当一束单色光通过溶液时，其吸光度与溶液浓度和宽度的乘积成正比,。,T,、,A,、,c,间的关系：,A,lg,（,I,0,/,I,t,),=-,lg,T,=,b c,透光度,(,透光率,),T,：透过光和入射光强度之比,，,即,T=I,t,/I,0,100%,T,越大，表示对光的吸收越小。,吸光度具有,加和性：,在多组分体系中，吸光度具有加和性，即：,A,（,总）,A,1,+,A,2,+,A,n,=,1,b c+,2,b c+,n,b,c,其方法和步骤是：,1）配制一组浓度不同的标准溶液(,c,1,、,c,2,)；,2）在一定波长下，分别测定其吸光度(,A,1,、A,2,)。,3）以,A,为纵坐标，浓度,c,为横坐标，绘制曲线，得到一条通过原点的直线，称为,标准曲线,（,A-c,曲线）。,4）用完全相同的方法和步骤测定待测溶液的吸光度,A,x,，,从标准曲线上找出对应的浓度,c,x,值（,A,x,c,x,）。,4,、定量测定方法,标准曲线法,A,x,c,x,空白 标准溶液 待测溶液,Blank Standard Sample Sample,c,1,c,2,c,3,c,4,c,x,c,0,标准曲线,a、,目视比色法,用眼睛比较溶液颜色的深浅以确定物质浓度的方法称为目视比色法。,特点：设备简单、操作简便；无需单色光；准确度不高。,b、,分光光度计,5,、,紫外,可见分光光度计,仪器,基本组成,光源,单色器,样品室,检测器,显示器,a.,光源,在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。,可见光区：,钨灯,作为光源，其辐射波长范围在3202500,nm。,紫外区：,氢、氘灯,。发射185400,nm,的连续光谱。,b.,单色器,又称,波长控制器,，其作用是,将光源发射的复合光分解成单色光,，,并可从中选出一任波长单色光的光学系统。,包括,狭缝,、,色散元件,和,准光装置,。,色散元件,的作用是,将复合光分解成单色光,，有,棱镜或光栅,两种。,c.,样品室,样品室放置各种类型的吸收池（,比色皿,）和相应的池架附件。,吸收池主要有,石英池,和,玻璃池,两种。,e.,结果显示记录系统,检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理,d.,检测器,利用,光电效应,将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。,1,、显色反应,2、显色反应条件的选择,3、测量条件的选择,6,、,显色与测量条件的选择,1）、显色反应,显色反应,使无色或浅色的待测组分转变为有色化合物的反应。,显色剂,与待测组分反应形成有色化合物的试剂成为。,Fe,2+,+3R,Fe(3R),2+,（,红橙色，,max,=510 nm）,R,为邻二氮菲,2）,显色反应条件的选择,a.,显色剂用量,选择吸光度最大且基本恒定（曲线变化平坦处）的显色剂用量。,b.,反应体系的酸度,选择吸光度最大且基本恒定（曲线变化平坦处）所,对应的,pH,范围。,c.,显色时间与温度,d.,溶剂,一般尽量采用,水相,测定,。,3）,测定条件的选择,a.,选择适当的入射波长,一般选,max,为入射光波长。如果,max,处有共存组分干扰时，则应考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长。,b.,选择合适的参比溶液,为什么需要使用参比溶液？,使,测得的的吸光度真正反映待测溶液吸光强度。,A=,A1+A2+,+,A(,x,),，,A1+A2+,=0,A=A(,x,),。,参比溶液的选择一般遵循以下原则：,若仅待测组分与显色剂反应产物有吸收，用,纯溶剂（水),作参比溶液；,若显色剂或其它所加试剂在测定波长处略有吸收，而试液本身无吸收，用,“,试剂空白,”,(不加试样溶液)作参比溶液；,若待测试液在测定波长处有吸收，而显色剂等无吸收，则可用,“,试样空白,”,(不加显色剂)作参比溶液；,c.,控制适宜的吸光度（读数范围）,用仪器测定时应尽量使溶液透光度值在,T,=1565%,，,相应地吸光度,A,=0.800.20,。,当溶液的吸光度或透光率不在此范围时，可以通过,改变溶液浓度,及,选择不同厚度的比色皿,来控制。,分光光度法测定铁的含量,一、实验目的,1、了解分光光度法测铁的基本原理；,2、,学习分光光度法中显色与测量条件的优化与选择；,3,、学习标准曲线的绘制以及试样测定方法；,4,、了解分光光度计的性能、结构及使用方法。,二、实验原理,A=,bc,在一定实验条件下，,A,=,kc,，,A,x,值,c,x,值。,pH39，,Fe,2+,与,Phen,反应,：,Fe,2+,+3R,Fe(3R),2+,（,红橙色，,max,=510 nm）,（注：,Fe,3+,+3R,Fe(3R),3+,，兰色，,max,=600 nm,）,用盐酸羟胺还原，再显色反应，则可以测得溶液中总铁含量：,2,Fe,3+,+2NH,2,OH,HCl,=2Fe,2+,+N,2,+2H,2,O+2Cl,-,三、实验步骤,1、吸收曲线的制作,试剂溶液：,不加铁标，其余同上配制。,以,试剂溶液作参比，在440560,nm,间，每隔10,nm,测一次吸光度，并且绘制,A-,曲线，选择最佳测定波长。,注,：,每改变一个波长，就需用参比溶液重新调节仪器。,稀,至刻度,1.00mL,100,mg/L,铁标,1.00mL10%,盐酸羟胺,50,摇匀,2.00mL 0.15%,邻二氮菲,5.00mL 1mol/L,NaAC,H,2,O,试样溶液：,3、稳定性实验,试样溶液同实验1。,以试剂溶液作参比，在508,nm,处，测定不同显色时间下的吸光度，并且绘制,A-,t,曲线，考察反应时间的影响以及有色溶液的稳定性,。,2、显色剂浓度的影响,试样溶液中除了,邻二氮菲的,加入量不同外，其余配制方法同实验1。,以试剂溶液作参比，在508,nm,处，测定不同显色浓度下的吸光度，并且绘制,A-,V,曲线，考察显色剂浓度的影响,。,4、溶液,pH,的影响,以试剂溶液作参比，在508,nm,处，测定不同,pH,下的吸光度，,并且,pH,计,测定相应溶液,pH,值，,绘制,A-,pH,曲线，考察,pH,的影响,。,稀,至刻度,10.00mL,100,mg/L,铁标,5.00mL 2mol/L,盐酸,100,2,min,10.00mL,盐酸羟胺,20.00mL,邻二氮菲,H,2,O,稀,至刻度,10.00mL,上述溶液,不同量0.4,mol/,LNaOH,50,H,2,O,5、标准溶液曲线的制作,按照书中方法配制0#8#溶液，以0#为参比溶液，测定1#8#溶液的吸光度值，并且绘制,A,c,标准曲线。,6、未知样中总铁含量的测定,按照书中的方法配制9#溶液，测定其吸光度值，从标准曲线中查得相应铁总含量。,7、未知样中,Fe,2+,含量的测定,按照书中的方法配制10#溶液（即不加盐酸羟胺），测定其吸光度值，从标准曲线中查得相应亚铁含量。,四、实验注意事项,1、移液管专用；,2、注意移液管的使用方法，要求每次从零刻度放至所需的体积；,3、注意溶液的填加顺序，不能随意颠倒，加入盐酸羟氨后反应5,min，,再加,NaAc,和,邻二氮菲,