电泳+离心.ppt

Gannan Medical University,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,Department of Biochemistry and Molecular Biology,分离蛋白质的方法,分离方法,沉淀法,盐析法,有机溶剂沉淀法,层析法,电学法,电泳法,等电聚焦,超速离心法,离子交换层析,吸附层析,凝胶过滤（分子筛）,亲和层析,电泳原理与技术,Tiselius,type electrophoresis apparatus,电泳的含义,带电粒子在电场中向其所带电荷相反的电极移动，称为,电泳,。,电泳的应用,1.,分离各种有机物：如蛋白质、酶、核酸等,2.,分析某种物质的纯度及分子量,电泳原理与技术,第一节 电泳的基本原理,第二节 电泳的基本装置,第三节 电泳支持物,第四节 电泳后的固定、染色和脱色,第五节 结果的记录与定量分析,pH=,pI,+OH,-,pH,pI,+H,+,+OH,-,+H,+,pH0,即,p,m,V0 S0,粒子达到某一位置后就达到平衡,p,-,m,0,即,p,m,1 V0 Sm,。,这种方法是根据分离的粒子其在梯度液中沉降速度的不同,使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带,达到彼此分离的目的。,(,二,).,速率区带离心法,梯度液在离心过程中以及离心完毕后,取样时起着支持介质和稳定剂的作用,避免因机械振动而引起已分层的粒子再混合。,由于,pm,则,S0,该离心法的离心时间要严格控制,即有足够的时间使各种粒子在介质梯度中形成区带,又要控制在任一粒子达到沉淀前。此法是一种不完全的沉降,沉降受物质本身大小的影响较大,一般是应用在物质大小相异而密度相同的情况。,2.,注意点：,严格控制离心时间,pm,事先配成较平缓的连续密度的梯度溶液,不能用角式转头、只能用水平式转头,不能用刹车,1,原理,预先配制介质的密度梯度（包含了被分离样品中所有粒子的密度），样品铺在梯度液顶上或混合,离心开始后,梯度液受离心力的作用逐渐形成底浓而管顶稀的密度梯度,与此同时原来分布均匀的样品粒子也发生重新分布。最后粒子进入到,p=m,此时,dx,/,dt,为零粒子不再移动，粒子形成纯组分的区带。,(,三,).,等密度离心法,特点：,（,1,）与样品粒子的密度有关（,2,）与样品粒子的大小和其他参数无关（,3,）转速、温度不变,则延长离心时间也 不能改变这些粒子的成带位置。,2.,注意点：,离心时间要长,可用角式转头或水平式转头,粒子密度相近或相等时不宜用,密度梯度溶液中要包含所有粒子密度,不能用刹车,四,.,梯度溶液的制备,(,一,).,梯度材料的选择原则,:,1,、与被分离的生物材料不发生反应。,2,、可达到要求的密度范围,且在所要求的密 度范围内,粘度低,渗透压低,离子强度和,pH,变化较小。,3,、不会对离心设备发生腐蚀作用。,4,、容易纯化,价格便宜或容易回收。,5,、浓度便于测定,如具有折光率。,6,、对于分析超速离心工作来说,它的物理性 质,热力学性质应该是已知的。,常用的梯度材料：,.,糖类,:,蔗糖、甘油、聚蔗糖,(,Ficoll,),、,右 旋糖酐、糖原,无机盐类,:,CsCl,(,氯化铯,),、,RbCl,(,氯化铷,),、,NaCl,、,KBr,等,有机碘化物,:,三碘苯甲酰匍萄糖胺等,硅溶胶,:,如,Percoll,。,蛋白质,:,如牛血清白蛋白,重水,非水溶性有机物,:,如氟代碳等,(,二,).,梯度材料的应用范围,1.,蔗糖,:,水溶性大 性质稳定 渗透压较高 最高密度可达,1.33,g/ml,价格低 容易制备,常用于细胞器、病毒、,RNA,分离的梯度材料 有较大的渗透压,不宜用于细胞的分离。,2.,聚蔗糖,:,商品,名,Ficoll,渗透压低 粘度却特别高,为此常与泛影葡胺混合使用 以降低粘度 用于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细 胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞,3.,氯化铯,:,离子性介质 水溶性大 最高密度可达,1.91,g/ml,重金属盐类,在离心时形成的梯度有较 好的分辨率 被广泛地用于,DNA,、,质粒、病毒和脂蛋 白的分离 价格较贵,4.,卤化盐类,:,KBr,和,NaCl,可用于脂蛋白分离,KI,和,NaI,可用于,RNA,分离,其分辨率高于铯盐,NaCl,梯度 可用于分离脂蛋白,NaI,梯度可分离天然或变性的,DNA,。,5.,Percoll,:SiO,2,胶体外面包了一层聚乙烯吡,咯,酮渗透压低对生物材料的影响小颗粒稳定在冷却和冻融情况下还是稳定的 粘度高在酸性,pH,和高离子强度下不稳定用于细胞、细胞器和病毒的分离,五,.,分析性超速离心,为了研究生物大分子的沉降特性和结构,而不是专门收集某一特定组分。它使用了特殊的转子和检测手段,以便连续地监视物质在一个离心场中的沉降过程。,(,一,).,分析性超速离心的工作原理,椭圆形的转子一套真空系统一套光学系统 转子通过一个柔性的轴联接成一个高速的驱动装置,这轴可使转子在旋转时形成自己的轴。,转子容纳二个小室,:,分析室配衡室：经过精密加工的金属块,作为分析 室的平衡用。,分析室：,容量为,1,毫升,呈扇形排列在转子中。其有上下二个平面的石英窗,离心机中装有的光学系统可保证在整个离心期间都能观察小室中正在沉降的物质,通过对紫外光的吸收或折射率的不同对沉降物进行监视。,折射率原理,:,当光线通过一个具有不同密度区的透明液时,在这些区带的界面上产生光的折射。在分析室中物质沉降时重粒子和轻粒子之间形成的界面就象一个折射的透镜,结果在检测系统的照相底板上产生一“峰”。由于沉降不断进行,界面向前推进,故“峰”也在移动,从峰移动的速度可以得到物质沉降速度的指标。,(,二,).,分析性超速离心的应用,1.,测定生物大分子的相对分子重量,沉降速度 沉降平衡 接近沉降平衡沉降速度：超速离心在高速中进行,使得任意分布的粒子通过溶剂从旋转的中心辐射地向外移动,在清除了粒子的那部分溶剂和尚含有沉降物的那部分溶剂之间形成一个明显的界面,该界面随时间移动而移动,这就是粒子沉降速度的一个指标,然后用照像记录,即可求出粒子的沉降系数。,dx,/,dt,S=,2,X,RTS,M=,D(1-,),M-,该分子不含水的相对分子重量,;,R-,气体常数,;,T-,绝对温度,;,S-,分子的沉降系数,;,-,分子的微分比容,(,当一克溶质加到一个大体积的溶液中所占有的体积,;,-,溶剂的密度。,2.,生物大分子的纯度估计,3.,分析生物大分子中的构象变化,一、制备离心技术,定义：,指以分离纯化生化物质、细胞、亚细胞粒子为目的的离心技术。,分类：,一般制备离心技术：,是指在分离、浓缩和纯化样品时，不必制备密度梯度的一次完成的离心操作技术。常用低速或高速离心机来完成，此法主要用于分离血清和沉淀细胞等。,制备超速离心技术：,是指在强大的离心力场作用下，依据物质的沉降系数、质量和形状不同，将混合物样品中各组分分离提纯的一种技术。,差速沉降离心法 密度梯度离心法,差速沉降离心法,定义：是指在离心管内液体密度均一的介质中，对含两种以上大小不同的待分离物质的混合液采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒，在不同的,离心速度,及不同,离心时间,下分步骤离心沉淀，使之互相分离的离心方法。,应用：一般用于分离沉降系数相差较大（相差,10,倍以上）的颗粒，沉降系数在同一个数量级内的各种颗粒不易分开。,此法主要由于组织匀浆液中分离细胞器和病毒，其优点是：操作简易，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。缺点是：须多次离心，沉淀中有夹带，分离效果差，不能一次得到纯颗粒，沉淀于管底的颗粒受挤压，容易变性失活。,密度梯度离心法,（简称区带离心法）：,定义：,区带离心法是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。,密度梯度离心法,（简称区带离心法）：,优点：,分离效果好，可一次获得较纯颗粒；,适应范围广，能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；,颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。,缺点：,离心时间较长；,需要制备惰性梯度介质溶液；,操作严格，不易掌握。,（,1,）差速区带离心法：,当不同的颗粒间存在沉降速度差时（不需要像差速沉降离心法所要求的那样大的沉降系数差）。在一定的离心力作用下，颗粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度介质的不同区域上形成区带的方法称为差速区带离心法。此法仅用于分离有一定沉降系数差的颗粒（,20%,的沉降系数差或更少）或分子量相差,3,倍的蛋白质，与颗粒的密度无关，大小相同，密度不同的颗粒（如线粒体，溶酶体等）不能用此法分离。,（,1,）差速区带离心法：,离心管先装好密度梯度介质溶液，样品液加在梯度介质的液面上，离心时，由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同沉降速度向管底沉降，离心一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，最后形成一系列界面清楚的不连续区带，沉降系数越大，往下沉降越快，所呈现的区带也越低，离心必须在沉降最快的大颗粒到达管底前结束，样品颗粒的密度要大于梯度介质的密度。梯度介质通常用蔗糖溶液，其最大密度和浓度可达,1.28kg/cm3,和,60,。此离心法的关键是选择合适的离心转速和时间。,（,2,）等密度区带离心法：,离心时，样品的不同颗粒向上浮起，一直移动到与它们的密度相等的等密度点的特定梯度位置上，形成几条不同的区带，这就是等密度离心法。,离心管中预先放置好梯度介质，样品加在梯度液面上，或样品预先与梯度介质溶液混合后装入离心管，通过离心形成梯度，这就是,预形成梯度,和,离心形成梯度,的等密度区带离心产生梯度的二种方式。,（,2,）等密度区带离心法：,体系到达平衡状态后，再延长离心时间和提高转速已无意义，处于等密度点上的样品颗粒的区带形状和位置均不再受离心时间所影响，提高转速可以缩短达到平衡的时间，离心所需时间以最小颗粒到达等密度点（即平衡点）的时间为基准，有时长达数日。,等密度离心法的分离效率取决于样品颗粒的浮力密度差，密度差越大，分离效果越好，与颗粒大小和形状无关，但大小和形状决定着达到平衡的速度、时间和区带宽度。,等密度区带离心法所用的梯度介质通常为氯化绝,CSCl,，其密度可达,1.7g/cm3,。此法可分离核酸、亚细胞器等，也可以分离复合蛋白质，但简单蛋白质不适用。,二、分析性超速离心技术,分析性超速离心主要是为了研究生物大分子的沉降特性和结构，而不是专门收集某一特定组份。因此它使用了特殊的转子和检测手段，以便连续监视物质在一个离心场中的沉降过程，从而确定其物理性质。,1.,分析性超速离心的工作原理,分析性超速离心机的组成：,一个椭圆形的转头,一套真空系统,一套光学系统,（,1,）测定生物大分子的相对分子质量,（,2,）生物大分子的纯度估计,（,3,）生物大分子中的构象变化,2.,分析性超速离心的应用,1,dx,S=,.,2,dt x,1,dx,Sdt,=.,2,x,t,2,1 x,2,dx,S,dt,=,t,1,2,x,1,x,1,S(t2-t1)=,(lnX,2,-lnX,1,),2,lnX,2,-lnX,1,S=,(t,2,-t,1,),2,logX,2,-logX,1,=2.303,2,(t,2,-t,1,),若,用,2,n/60,表示则：,2.110,2,logX,2,/X,1,S=,n,2,(t,2,-t,1,),X,1,:,离心前粒子离旋转轴的距离,X,2,:,离心后粒子离旋转轴的距离,1.,平衡离心法 根据粒子大小、形状不同进行分离。差速离心法,(,differential velocity centrifugation),速率区带离心法,(,rate zonal centrifugation),。,2.,等密度离心法,(,isopynic,centrifugation),又称等比重离心法,依粒子密度差进行分离,等密度离心法和上述速率区带离心法合称为密度梯度离心法。,3.,经典式沉降平衡离心法 用于对生物大分子分子量的测定、纯度估计、构象变化。,